Finansman Ulusal Bilim Vakfı (MF) tarafından sağlanmaktadır.

Giriş OMT bir &quot;sanal tüy simülatörü&quot; dahil etmek için tasarlanmış bir manyetik halata sistemi [1] bir adaptasyon. Aşağıdaki protokolleri nasıl düzgün bir halata sinekler (Bölüm 1) ve mıknatıslar (Part 2) ve kütle akış düzenlenmiş koku dağıtım sistemi (Part3) kurmak için stratejiler sağlayacaktır. Burada açıklanan bilgiler, bu özel sistem için optimize edilmiş ve bileşenler için diğer teknik özellikleri ile farklılık gösterebilir. Bölüm 1: tethering sinekler Burada açıklanan tethering adımları çok önceki çalışmalarda benzer [2] ancak bir OMT kullanım için adapte [3]. Uygun tethering sağlam ve tekrarlanabilir deneysel çalışmalarda sağlamak için çok önemlidir. Dikkatli tethering önemi göz ardı edilemez. <ol><li> 4-6 gün eclosion sinekleri toplayın ve 4-6 saat açlıktan. Kimwipe foodless flakon kuruma önlemek için su ile ıslatılmış yerleştirin. </li><li> Bir şişe sinek toplu küçük bir flakon transferi ve santigrat yaklaşık 4 derece Peltier soğutma sahnede pirinç blok yerleştirin. Uygun sıcaklık yaklaşık 30 saniye içinde sinekleri anesthetizes. </li><li> Soğuma evresi, soğuk yüzey üzerinde sinekler sıralayın. Nemli bir Kimwipe manikür sürekli soğutma ve nem esneklik sağlar. Tethering için en büyük kadın seçin. </li><li> Ince bir fırça kullanarak, tek bir sinek özel olarak inşa edilen bir lahit, tek bir vahşi tip kadın meyve sineği uyum şekillenmiştir pozisyona itin. <img src="/files/ftp_upload/old/1063_2008_11_26_2/1063_Figure-01_thumb.png" alt="" /> Şekil 1. <a href="https://www.jove.com/files/1063_2008_10_28_1/1063_Figure-01.png">Rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> </li><li> Biz bir micromanipulator üzerine monte edilmiş bir manyetik çubuk ile minutien pin (Cezalar Bilim Araçları) yerleştirin. Pin, künt sonunda sadece iki kanadı arasındaki başın arkasında dorsal toraks dokunur gibi uyumlu hale getirilmesi. Kafa gözleri doğru bakıldığında pin mükemmel dikey olmalıdır. , Sinek ve pin arasındaki &#39;roll&#39; bile küçük bir miktar tolere edilemez. Pin ve vücudun uzun ekseni arasındaki yan görüş açısı, burun-ufuk (Şekil 1) göre 30 derecelik bir açıda olması gerekir. Not: mıknatıs halata optimum işletimi için, pimleri kısa uzunluklarda kesilmiş gerekebilir. Bu süspansiyon mıknatıslar arasındaki mesafeyi tamamen bağlıdır. </li><li> Minutien pin uyumlu sonra, UV-aktive tutkal (elektrolit Corp) minutien pin künt sonuna kadar küçük bir damla uygulamak için bir ince çelik tel kullanın. </li><li> Tutkal damlacık sadece başının üstünde sinek toraks dokunur, böylece pin işleyin. Uygun damla boyutu ile, tutkal tavlama ve toraks üzerine pin akış. Çok yapıştırıcı kullanmak için dikkatli olun. </li><li> UV ışık iki adet 20 saniyelik atışlarla Cure tutkal. </li><li> Sabit bir sinek bir kenara koyun ve tekrarlayın. Kimwipe küçük kareler şeklinde dilimleyin ve forseps ile uçuş dizginlemek için her gergin uçmak için tek vermek. </li><li> Bir saat sonra kurtarma, gergin sinekler deneyler için hazır. </li><li> Yanlış yapıştırma mıknatıs arenada gerçekleştirmek için bir sinek yeteneğini engelleyebilir. Her sinek sinekler düzgün yapıştırılmış sağlamak için her türlü deney başında düz rotasyon için kontrol edilmelidir. Bu yeterince büyük bir mekansal süre ile güçlü optomotor tepkiler çizgili desen dönen yapılabilir [4]. Sinek yanlış eğim açısı yapıştırılmış veya rulo eksenine göre pin eğik ise, uçabilirsiniz: (i) hiç dönmeye, (ii) sınırlı bir hareket var, ya da (iii) tutarsız döndürmek hız. Yukarıdaki durumlarda anında atılır ve yenisi ile değiştirilir. Bu sorunu çözerse, büyük olasılıkla yanlış yapıştırma bir durumda idi. (Sinek değiştirilmesi sorunu çözmezse, Bölüm 2.4 &#39;e bakınız) </li></ol> Bölüm 2: mıknatıslar hizalama Mıknatıslar (Nadir-toprak-magnets.com) hizalama, düzgün, pürüzsüz bir 360 derece aralığında hareket ulaşmak için sinek için gerekli. Mıknatıslar düzgün hizalamak için şu adımları izleyin. <ol><li> Düşük halka mıknatıslar yatay plastik bir kol tarafından düzenlenen ve doğrudan açık bir vakum odasının üstüne yerleştirilir (Şekil 1, bölüm 3) daha sonra açıklanacaktır. Üst çubuk mıknatıs alt mıknatısın üzerine dikey olarak yaklaşık 3 / 4 &quot;sabittir. </li><li> Kabaca, doğrudan alt halka mıknatıslar merkez noktası üzerinde üst çubuk mıknatıs yerleştirerek görsel olarak alt ve üst mıknatıslar hizalamak. Bu ince ölçekli ayarı için üst mıknatıs mikromanipülatör (Siskiyou A.Ş.) eklemek yararlı olacaktır. </li><li> Epoksi üst mıknatısın alt yüzeyinde bir V-mücevher rulman (Küçük Parça) dönme sürtünme en aza indirmek ve sinek konumlandırma standardize etmek. </li><li> Arenada bir sinek yerleştirin ve yatay ve vsinek kadar üst mıknatısın ertical pozisyonu sorunsuz ve sürekli yaw ekseninde 360 ​​derece dönebilir. Her sinek mıknatıslar doğru hizalanır ve bireysel minutien pimleri (bkz. Bölüm 1.11) zarar görmediğinden emin olmak için her deneyde başında düz rotasyon için kontrol edilmelidir. Mıknatıslar düzgün uçabilirsiniz (i) tüm dönmeye uyumlu değildir (ii) Eğer sınırlı bir hareket aralığı (iii) tutarsız hızlarda dönmesini var. Yeni bir sinek değiştirerek sorunu çözüldü ise, (bkz. Bölüm 1) büyük olasılıkla bir yapıştırma sorunu nedeniyle oldu. Bu sorunları her sinek için varsa, büyük olasılıkla, mıknatıslar ve daha fazla uyum gerekli olacaktır hizalama ile bir konudur. </li><li> Uyarı: eğlenceli olabilir nadir toprak mıknatıslar ile oynarken, onlar çok tehlikelidir. Hasarlı ekipman ve / veya küçük yaralama sonuçları Kötüye Kullanımı. Bu cazip henüz kolaylıkla hafife mıknatıslar çok dikkatli olun. </li></ol> Bölüm 3: Koku Teslimat <ol><li> Koku dağıtım sistemi daha önce açıklanan bir dayanmaktadır [5] ve optimize etmek için en zor kısmı (Şekil 1). Bu bir çok sabır ve deneme-yanılma gerektirir. Istikrarlı bir koku izleme ulaşmak için şu adımları izleyin. </li><li> Koku sisteminin ilk set-up, özel yapılı su / koku şişeleri, gaz çoklayıcı (Sable Systems International) dar göstergesi teflon tüp (Küçük Parça) çalıştıran gerektirir. Bu şişeleri çıkış aynı teflon tüp kullanarak derialtı liman tüplerine doğrudan bağlanır. </li><li> Açık bir akrilik vakum odasına mıknatıslar desteklemek için arenada altında konumlandırılmış. Biz sinek yakın açılış vakum getirmek ve açılış çapı azaltmak için vakum odasına bağlı sinek altına monte 4mm cam tüp kullanın. </li><li> Forseps kullanarak arenaya gergin bir sinek yerleştirin. </li><li> (Elma sirkesi iyi çalışıyor), çekici bir koku ve görsel sinek, koku izler doğrulamak açın. Sinek koku için bir tercih var gibi görünüyorsa, önümüzdeki üç adımları izleyin. Bu birkaç sinek ve çeşitli çalışmalar gerekebilir. </li><li> Sinek, koku izlemek için görünene kadar koku liman konumunu ayarlayın. Biz sinek kafası koku mikromanipülatörler port (Siskiyou A.Ş.) ve konumlandırılmış 4mm ve 3mm dorsal anterior monte edilebilir. </li><li> Sinek, koku izlemek için görünene kadar kütle akış hızını ayarlayın. Bizim ayarları 7ml/min Sable Systems International (MFC-4). </li><li> Sinek, koku izlemek için görünene kadar vakum akış hızını ayarlayın. Biz, bir akış regülatörü (Cole Parmer) kullanarak 13l/min vakum debisi ayarlayın. Not: Bina vakum besleme hatları, tüy yapısı dalgalanmalara neden zaman içinde değişkenlik gösterebilir. Akış regülatörü sabit vakum akış koşulları için harici bir vakum pompası bağlamak için yararlı olabilir. </li><li> Liman ve akış hızları konumunu ayarlamak sonra, periyodik olarak bir gaz çoklayıcı kullanılarak değiştirilebilir kullanarak teslim su buharı ve kokusu buharı arasındaki geçiş ve görsel sinek, koku açıkken sadece koku izler olduğunu doğrulamak. Bazen, koku portu içinde kalan koku koku kapalı koku izleme temin edebilirsiniz. Bu, düzgün bir şekilde yerleştirilmiş bir koku port etanol ile derialtı tüpleri dolum ve Kimwipe ile teslim ucunda toplama çıkarmadan ortadan kaldırılabilir. Basınçlı hava kullanarak, kalan etanol darbe ve deneyler devam. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Bu adımları doğru takip edildiğinde iki şeye dikkat edilmelidir. İlk olarak, sürekli dönen görsel uyaranlara altında gergin bir sinek OMT yerleştirilen sorunsuz yaw ekseninde 360 ​​derece dönmelidir. &quot;Aptal&quot; tur (sakkadlar denir) sabit görsel uyaranların yokluğunda spontan dönüm davranış özelliğidir. Sinekler görünüşte sorunsuz döndürmek yapamıyorsanız, yanlış yapıştırma (Part 1) ve hizalanmamıs mıknatıslar (bkz. Bölüm 2) suçlu olabilir. İkincisi, koku açıldığında, sinek, koku yönde başkanı olmalıdır. Koku kapatıldığında, sinek arenada herhangi bir tek pozisyon için hiçbir tercih kendiliğinden sakkaddan gerekir. Sineklerin koku bulutunun, koku liman konumunu, hava akış hızı ve / veya vakum debisi aktif takip etmiyorsanız ayarlanması gerekebilir (bkz. Bölüm 3).

<ol>
	<li>Bender, J. A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+stimulation+of+saccades+in+magnetically+tethered+Drosophila.">Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).</li><li>Tammero, L. F., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collision-avoidance+and+landing+responses+are+mediated+by+separate+pathways+in+the+fruit+fly,+Drosophila+melanogaster.">Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).</li><li>Duistermars, B. J., Frye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossmodal+visual+input+for+odor+tracking+during+fly+flight.">Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight.</a> Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).</li><li>Reiser, M. B., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+display+system+for+insect+behavioral+neuroscience.">A modular display system for insect behavioral neuroscience.</a> J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).</li><li>Frye, M. A., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+output+reflects+the+linear+superposition+of+visual+and+olfactory+inputs+in+Drosophila.">Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).</li></ol>

Sinekler tethering ve bu alanda istikrarlı bir koku izleme eliciting oldukça basittir. Bu uygulama, sabır ve deneme ve yanılma gerektirir. Bu alanda birçok yerinde daha deneysel potansiyel farklılıklar verim için optimize edilmiş ya da değiştirilmiş olabilir. Örneğin, vakum odasının yeni sürümleri çok daha küçük ve arenada altında daha fazla yer sağlar. Ayrıca, nadir toprak mıknatıslar gücü ve tipi biraz değişik olabilir ve ek koku koku türleri ve / veya konsantrasyonları, deneylerde kullanılan sayısını ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cooling Stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Teca</td>
<td>LHP-300CP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brass Cooling Block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Machined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>~4 x 8 x 2cm</td>
</tr>
<tr>
<td>Sarcophagus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Machined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contact us for details</td>
</tr>
<tr>
<td>UV-Activated Glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kemxert corp</td>
<td>KOA300</td>
<td>1oz bottle lasts years</td>
</tr>
<tr>
<td>Panel System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caltech</td>
<td>http://www.dickinson.caltech.edu/panels</td>
<td>[4]</td>
</tr>
<tr>
<td>Minutien Pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lower Ring Magnets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rare-earth-magnets.com</td>
<td>NSN0615</td>
<td>5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125"</td>
</tr>
<tr>
<td>Upper Rod Magnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rare-earth-magnets.com</td>
<td>NSN0750</td>
<td>0.125" x 1"</td>
</tr>
<tr>
<td>V-Jewel Bearing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>VJ-0469-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MFC-4 Flow Regulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Systems International</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gas Multiplexer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Systems International</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Teflon Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>STT-20-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20 Gauge Hypodermic Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>HTX-20R-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>4mm o.d.</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum Flow Regulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole Parmer</td>
<td>EW-32464-52</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a magnetic tether system to investigate visual and olfactory mediated flight control in drosophila

Bu böcekler, bir rüzgar akışı başlığı stabilize etmek için görsel ipuçları kullandıkları uzun yıllar boyunca açık olmuştur. Birçok hayvan, rüzgarla taşınan kokuları takip edin. Upwind gibi, görsel istikrar koku izleme doğrudan yardımları izleme. Ama koku alma sinyalleri doğrudan rüzgar ipuçları bağımsız görsel izleme davranışlarını etkiler mi? Ayrıca, nörofizyoloji ve Drosophilia&#39;daki koku duyusunun nörodavranışsal genetik araştırma son tufan, her zamankinden daha teknik olarak karmaşık ve nicel davranış testleri motive vardır. Burada, aslında arena dar laminer akış koku tüyleri ile donatılması görme deneyleri için geliştirilen bir manyetik halata sistemi değiştirilmiş. Bir sinek küçük bir çelik pim yapıştırılmış ve serbestçe yaw sağlayan bir manyetik alan asılı. Küçük çaplı gıda koku tüyleri, aç bir sinek tarafından istikrarlı izleme eliciting, sinek s başının üzerinde aşağıya doğru yönlendirilir. Burada, mıknatıslar hizalayarak koku bulutunun tasarlayarak ve istikrarlı bir koku izleme teyit tethering kritik mekaniği odaklanmak.

Watch this Scientific Journal Video about A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila at JoVE.com

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

Burada, bir koku, manyetik halata (OMT) cihazı bir sinek nasıl halata açıklar. Biz, nadir toprak mıknatıslar ve koku bağlantı noktalarını ve nasıl en iyi koku izleme ulaşmak için uyaran teslim ve suction için kütle akış oranını ayarlamak için hizalamak nasıl açıklar.

Drosophila Görsel ve Koku aracılığı ile Uçuş Kontrol Araştırma Manyetik Tether Sistemi

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

a-magnetic-tether-system-to-investigate-visual-olfactory-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Görüntüleme.  University of California, Los Angeles. Burada, bir koku, manyetik halata (OMT) cihazı bir sinek nasıl halata açıklar. Biz, nadir toprak mıknatıslar ve koku bağlantı noktalarını ve nasıl en iyi koku izleme ulaşmak için uyaran teslim ve suction için kütle akış oranını ayarlamak için hizalamak nasıl açıklar.

Video: A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Drosophila Uçuş sırasında Görme aracılığı Koku Takibi

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Biyoloji

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Tek hücreli fare Koni fotoreseptörlerin Emiş Kayıtlar

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama Pratik Bir Yaklaşım: Hücreler Mark ve Track Görsel Bir Rehberi In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Tek ve Çok hücreli Bağlamlarda Invadopodia aracılı Ekstrasellüler Matriks Proteoliz Kantitatif Ölçümü

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Drosophila'da Sıcaklık Tercih Davranışının ve Sirkadiyen Ritminin Tasarımı ve Analizi

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Uçuş Performans Doğru ve hızlı ölçüm için geliştirilmiş Yöntemi<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...