, Ulusal Bilim Vakfı MF hibe tarafından finanse edilen

OMT sanal bir tüy simülatörü 2 birleştirmek için tasarlanmış bir manyetik halata sistemi 1 bir adaptasyon. Aşağıdaki protokolleri elde edilen video görüntüleri (Part 1) optimize etmek ve temel görsel-koku alma deneyleri iki tip (Bölüm 2 ve 3) nasıl çalıştırılacağını anlatacağım . Bölüm 1: video Edinimi Video görüntüsü en iyi duruma getirme edinilen verilerin kalitesi için çok önemlidir. Temiz görüntüler için şu adımları izleyin. <ol><li> Bir çift forseps kullanılarak arenada taze gergin sinek yerleştirin. </li><li> Gergin sinek ventral kamera görüntüsü bir cam tüp, doğrudan yukarı doğru haznesinden olduğu gibi berrak akrilik vakum odasına altında pozisyon Firewire board kamera (Ateş-I 1394store.com). IR filtresi, video sistemi objektif üzerinde herhangi bir kaplama olmadığından emin olun. </li><li> Sinek aydınlatmak için, kızılötesi LED, LED paneller hemen altına konumlandırılmış dairesel bir dizi (Küçük Parça A.Ş.) kullanın. Eşit aydınlatmalı, sinek vücudunun ayrı ayrı LED her odaklanın. </li><li> Panel sistemi parlamayı azaltmak ve sinek tarafından gözlenen görsel ipuçları en aza indirmek için, düz siyah boya ile kamera görüntüsü içinde kat yansıtıcı yüzeyler için yararlıdır. Oda ışıkları, sinek gözü tarafından algılanamaz parlama ve parlaklık modülasyon azaltmak için kapalı olmalıdır. </li><li> Görme kamera görüntüsünü kontrol edin. Sinek, parlak siyah bir arka plana karşı beyaz olmalıdır. Eğer görüntü bulanık lens odaklı gerekebilir. Sinek koyuysa, LED dizi bulanıktır ya da yeterince uygun aydınlatma için güç olabilir. Arka planda parlak nesneler içeriyorsa, arka plan yansıma en aza indirmek için sadece sinek üzerinde siyah akın kağıt bir disk takmak. </li><li> Biz Image Acquisition araç kutusunu kullanarak Matlab yazılı özel subroutinler video kazanır. </li></ol> Bölüm 2: koku bulutunun bulma sinek Bir basit bir deney OMT yerini aç (hasret) sinek gözlemleyerek ve daha sonra aktif bir tüy çekici gıda koku izleme. Görsel çevresi kurgulama sinek iştahlı bir yemek kokusu sağlam izlemek için yeteneğini etkiler. Deneyler genellikle deneysel amacıyla herhangi bir önyargı en aza indirmek için rasgele bir blok biçiminde çalıştırmak olduğunu unutmayın. Tüm dış donanım (gaz çoklayıcılar, LED arenada, video satın alma) Matlab (Mathworks) yazılı özel yazılım rutinleri tarafından kontrol edilir. <ol><li> Bir çift forseps kullanılarak arenada taze gergin sinek yerleştirin. </li><li> Her deneyden önce, tüm 360 yaw ekseni etrafında düzgün hareket sağlamak için, görsel ekranı kullanarak birçok devrimler için 3 sinek döndürmek. Sinek dönmüyorsa yavaşça atın. Sorun devam ederse, olası nedeni yanlış hizalanmış mıknatıslar. Not: spin deneme sırasında birkaç yörüngeleri başlığı arenada dağılımı önemli zirveleri (yani 360 derece düz değil) gösterir, yanlış hizalanmış mıknatıslar nedeniyle bir oryantasyon önyargı muhtemeldir. </li><li> Rastgele sırayla aşağıdaki örnek deneysel koşullar sinek Günümüze: i) su buharı, koku limandan kaynaklanan yüksek kontrastlı çizgili desen, ii) yüksek kontrastlı çekici koku buharı ile çizgili desen iii) tek bir dikey 90 derece ofset su buharı memesi ve iv) tek bir koku buharı ile 90 derece şerit ofset. Bizim tecrübelerimize göre, 30 saniyelik aralıklarla sinekler, kendi kokusunun kaynağını bulmak için meydan deneyler için iyi çalışır. Biz her deney koşulunda süresince 30 Hz video kazanmak ve (biri Matlab yazılmış özel yazılım rutinleri kullanarak çevrimdışı görüntüleri analiz en kullanışlı dahili Matlab fonksiyonları bir elips gibi geometrik özellikleri analiz regionprops.m. </li><li> Koku kapatıldıktan sonra, yüksek koku konsantrasyonları kullanırken, artık koku koku limanından piyasaya olabilir. Bu sistem herhangi bir kalıntı koku dışarı akmasına izin dönen bir panorama ile birkaç saniye için sinek spin yararlı olabilir herhangi bir etkileri en aza indirmek için. </li><li> Tutmak (i) görsel, deneysel tedaviler arasında sinek döndürmek için de faydalıdır aktif deney ve (ii) tek bir noktada kalan uçar tutmak için uğraşan uçar. Ii) i) Yirmi ikinci ilk tanı spin beş saniye ara dönmeye; iii) yirmi ikinci şartı çifti # 1, iv) beş ikinci ara spin; v) yirmi ikinci şartı çifti # 2: Bir örnek deney aşağıdaki sırayla olabilir. </li></ol> Bölüm 3: sinek, koku bulutunun içinde kalan OMT ikinci bir temel deney görsel bir koku bulutunun içine bir sinek sürüklemek için, anında görsel koşulları değiştirmek ve daha sonra tüy kalır kabiliyetini ölçmek. Yine, rastgele bir blok formasyonu tüm deneyler yapılır dikkatt deney amacıyla herhangi bir önyargı en aza indirmek için. <ol><li> Bir çift forseps kullanılarak arenada taze gergin sinek yerleştirin. </li><li> Görme hayvan (bkz. Bölüm 2.2) her yöne yönlendirmek için kapasiteye sahip olduğunu sağlamak için tanısal bir onay olarak her deneyden önce (spin), arena etrafında sinek birkaç kez döndürün . </li><li> Her koşul önce, deneysel koku (su ya da sirke) açmak ve görsel sinek, tüy pozisyonu küçük bir dikey salınan tüy &quot;sürükle&quot;. Bu sinekler [4] gözlenen güçlü bir şerit tespit davranış yararlanır. </li><li> Şimdi sinek tüy yönelik olduğunu, salınım şerit kaldırın ve aşağıdaki örnek görsel koşulları sunmak: i) su buharı (Şekil 1A) ile yüksek kontrast panoramik çizgiler, ii) su buharı (Şekil 1B) ile aynı arka plan; iii) kokusu buharı (Şekil 1C) ile yüksek kontrast panoramik şeritler; iv) koku buharı (Şekil 1D) ile homojen bir arkaplan. 2.3 &#39;deki gibi video edinin. Yirmi ikinci şartı çifti # 2 v), ii) beş ikinci tüy şerit salınım; iii) yirmi ikinci şartı çifti # 1; iv) beş ikinci bir tüy şeridi salınım i) yirmi ikinci ilk tanı spin bir örnek deney akan sırada olabilir . </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/old/1110_2009_1_22_1/Fig 1.png" alt="Şekil 1" width="600" height="195" /> Şekil 1 Bölüm 1 OMT video görüntüleri optimize etmek için nasıl açıklar. Video görüntüsü, koyu siyah bir arka plan üzerinde ışıklı sinek net bir görüş olmalıdır. Aşırı parlak bir görüntü, arka plan girişim azaltılması, IR LED yoğunluğunu azaltarak, ya da oda ışıkları kapatarak geliştirilebilir. Sinek yanlış yanıyorsa, IR LED IR LED modüle yoğunluğu odak ayarlama sorunu çözebilir. Bölüm 2 ve 3 bir OMT uygun şekilde çalıştığını doğrulamak için yapmak için basit deneyler tanımlamak. Tüm durumlarda, bir sinek, görsel olarak düzgün ve tam bir hareket aralığını sağlamak için arenada birçok devrimler döndürmek için (optomotor tepkiler) &quot;zorla&quot; olmalıdır. Bölüm 2 de bir sinek, kendi başına bir koku bulutunun bulmak için meydan . Deney yapan sinek tutmak için artık koku serbest etkisini azaltmak için, ve deney boyunca tek bir başlık korumak uçar tutmak için, görsel olarak bir kaç saniye için çalışmalar arasındaki sinek döndürmek için yararlı olur. Bir sinek bir önemli ölçüde su buharı tüy yerelleştirmeniz asla ve zengin panoramik görsel ipuçları varlığı her zaman bir koku bulutunun lokalize olmalıdır. Bölüm 3 bir sinek görsel doğrudan bir koku bulutunun içine sürükledi ve sabit görsel geçmişleri çeşitli karşı tüy içinde başlığı korumak için meydan. Sinek, su buharı tüy sürüklenen ise, çabucak açmanız gerekir. Sinek bir koku bulutunun içine sürükledi ve sağlam bir izleme aracı için yeterli görsel ipuçları vardır, sinek, tüy kalır.

<ol>
	<li>Bender, J. A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+stimulation+of+saccades+in+magnetically+tethered+Drosophila.">Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila.</a> J Exp Biol. 209, 3170-3182 (2006).</li><li>Duistermars, B. J., Frye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossmodal+visual+input+for+odor+tracking+during+fly+flight.">Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight.</a> Curr Biol. 18, 270-275 (2008).</li><li>Reiser, M. B., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+display+system+for+insect+behavioral+neuroscience.">A modular display system for insect behavioral neuroscience.</a> J Neurosci Methods. 167, 127-139 (2008).</li><li>G&#246;tz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Course-control,+metabolism+and+wing+interference+during+ultralong+tethered+flight+in+Drosophila+melanogaster.">Course-control, metabolism and wing interference during ultralong tethered flight in Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 128, 35-46 (1987).</li></ol>

Bu sistem için görüntü alımı Matlab yazılmış ucuz bir firewire board kamera ve yazılım kullanır. Net görüntüler, doğru veri izleri elde etmek için çok önemlidir. Yukarıda açıklanan stratejiler bu sistem görüntü temizliği için yararlıdır. Bu sistem için diğer video izleme prosedürleri 1 tarif edilmiştir. Ayrıca, bu sistem kolaylıkla gerçek zamanlı video izleme içerecek şekilde değiştirilmiş olabilir. Burada anlatılan örnek deneysel protokolleri bir OMT düzgün çal?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Firewire camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1394store.com</td>
<td>Fire-I board camera BW</td>
<td>4.3mm lens no IR coating</td>
</tr>
<tr>
<td>IR LEDs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Black spray paint</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rustoleum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Flat black</td>
</tr>
<tr>
<td>Black flock paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Edmund Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Panel system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caltech</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3</td>
</tr>
<tr>
<td>Matlab 2006a</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mathworks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Image acquisition toolbox</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

visually mediated odor tracking during flight in drosophila

Uçan böceklerin bir rüzgar akışı başlığı stabilize etmek için görsel ipuçları kullanın. Birçok hayvan ayrıca, rüzgarla taşınan kokuları takip edin. Upwind gibi, görsel istikrar koku izleme doğrudan yardımları izleme. Ama koku alma sinyalleri doğrudan rüzgar ipuçları bağımsız görsel izleme davranışlarını etkiler mi? Ayrıca, koku alma moleküler genetik ve nörofizyoloji son gelişmeler genetik özgü koku alma aktivasyon devreleri inaktive (örneğin) davranışsal etkilerini değerlendirmek için kantitatif roman davranışsal analizleri motive etmiş. Biz aslında arena dar laminer akış koku tüyleri ile donatılması görme deneyleri için geliştirilen bir manyetik halata sistemi değiştirilmiş. Burada bir sinek gergin sonra yapılan ve manyetik alanda gezinmek mümkün olabilir deneyler odaklanmak. Biz istikrarlı bir koku takibi nasıl yargılamak için vücut açısını ölçmek için optimize edilmiş video görüntüleri elde etmek için nasıl göstermek ve koku izleme görsel ipuçları etkisini incelemek için iki deneyler göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila at JoVE.com

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Burada bir koku manyetik halata (OMT) aparat için, satın alınan video görüntüsü nasıl optimize etmek için açıklayın. Ayrıca, görsel-koku alma füzyon eğitimi için iki örnek deneysel protokolleri açıklar.

Drosophila Uçuş sırasında Görme aracılığı Koku Takibi

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

visually-mediated-odor-tracking-during-flight-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

9.8K Görüntüleme.  University of California, Los Angeles. Burada bir koku manyetik halata (OMT) aparat için, satın alınan video görüntüsü nasıl optimize etmek için açıklayın. Ayrıca, görsel-koku alma füzyon eğitimi için iki örnek deneysel protokolleri açıklar.

Video: Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Yüksek çözünürlüklü Ölçüm Drosophila Larva Koku-Driven Davranış

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Biyoloji

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Also, the recent deluge of research on the neurophysiology and neurobehavioral genetics of olfaction in Drosophila has motivated ever more technically sophisticated and quantitative behavioral assays. Here, we modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. A fly is glued to a small steel pin and suspended in a magnetic field that enables it to yaw freely. Small diameter food odor plumes are directed downward over the fly s head, eliciting stable tracking by a hungry fly. Here we focus on the critical mechanics of tethering, aligning the magnets, devising the odor plume, and confirming stable odor tracking.

Here we describe how to tether a fly in an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We describe how to align the rare-earth magnets and odor ports, and how to set mass flow rates for both the stimulus delivery and vacuum suction to achieve optimal odor tracking.

Drosophila Görsel ve Koku aracılığı ile Uçuş Kontrol Araştırma Manyetik Tether Sistemi

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Yetişkin Drosophila melanogaster Locomotion Yüksek Çözünürlüklü Video Takip

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

Synaptic Potansiyellerinin Channelrhodopsin2 aracılığı Uyarım Drosophila Nöromüsküler Kavşaklar

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Uçuş Performans Doğru ve hızlı ölçüm için geliştirilmiş Yöntemi<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...