Biz T. Huber ve TP Sakmar yararlı tartışmalar için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma LBV ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe ve Belçika-Amerikan Eğitim Vakfı ve ML Revson Vakfı tarafından desteklenen

1. Ekipman ve Reaktifler Koku dilüsyonları: <ul><li> Parafin yağı (Sigma, CAS numarası: 8012-95-1) </li><li> Drosophila larvaları 1 cazibe ortaya çıkarır yüksek saflıkta kullanılabilir kokuları. Bu video makalede, hayvanlar izoamil asetat (Sigma: 123-92-2, CAS numarası) ile test edildi. </li><li> 1.5ml Teflon kapaklı cam şişe (Agilent Technologies) </li><li> Ağırlık olarak hassas seyreltme için dijital ölçme skalası </li></ul> Set-up Testi arenada: <ul><li> Agaroz (Promega) </li><li> 96-well Mikroplaka (353.071 BD Falcon, katalog numarası) Kapaklar. Bizim davranış arenada üç yığılmış kapakları oluşur. </li><li> Tek kanallı 1-20 ul pipetter veya çoklu-kanal pipetter odorant damlacık (ler), yığının en üst kapağının içine yüklemek için. Birden fazla kaynak deneyi kurmak için, biz Rainin 5-50 ul pipetleyin-Lite çok kanallı pipetter kullanın. </li></ul> Drosophila davranış testleri için hazırlanması larva: <ul><li> % 15 (w / w) sakaroz çözeltisini </li><li> Düzenli Petri kapları (BD Falcon) larvaları yıkayın ve saklamak için </li><li> Larvaları işlemek ve aktarmak için boya-fırça (4-5mm kıl uzunluğu) </li></ul> Larva hareket Kaydı: <ul><li> Arenaya larva transferi için düz bir kafa ile Küçük pimleri </li><li> Forseps veya kaydettikten sonra larvalar çıkarmak için fırça </li><li> Olmayan homojen bir ısıtma ışık kaynağı ile aydınlatılmış bir sahne, &quot;İnce Edge&quot; Işık Pad Logan Electric tarafından imal </li><li> Kabine surround davranış arenada ve kontrol ışık koşullarında </li><li> Video izleme sistemi, hayvan hareketlerini kayıt için. Biz Ethovision yazılımı (Noldus Hollanda) kullanıyor. </li><li> CCD kamera ve frame grabber video kartı (Temel EureCard Piccolo) Ethovision yazılımı ile satın </li><li> Termometre ve nem kaydedici (isteğe bağlı) davranış testleri sırasında atmosferik koşullar izlemek için </li><li> Özelleştirilmiş veri analizi için Matlab (Mathworks) (isteğe bağlı) </li></ul> 2. Davranış arenada Davranışsal arenada üç yığılmış 96-iyi çanak kapakları oluşur. Alt kapak, ışık ped sistemin geri kalanından izole ve konveksiyon arenada azaltmak için kullanılır. % 3 agaroz jel 25ml ile kaplı ikinci bir kapak, larvalar üzerine yürümek için bir sahne olarak hizmet vermektedir. Üst kapak yüzey gerilimi ile askıda kalır koku damlacıkları tutar. Koku damlacıklar 96-iyi çanak kapağı kuyu içine doğrudan pipetlenir. Tek veya birden fazla koku kaynakları farklı, doğrulanabilir profilleri 2 geçişinde oluşturmak için kullanılabilir. Anosmi ve larvaları kemotaksis kusurları için test için, aşağıdaki iki testleri kullanmayı öneriyoruz. 2.1. Tek koku kaynağı tahlil: iyi # E7 belirtilen tek bir koku damlacık (standart 96-plaka referans sistemi). <ul><li> Uyaran: parafin yağı seyreltilmiş koku 10μl </li><li> İlk koşulları: Tek bir larva, koku kaynağı (veya yakın mahallede) altında tanıtıldı. </li><li> Temel gözlemler: çekici uyaranlara (örneğin izoamil asetat), wild tip larva kaynağı altında birikir. Koku alma hatalarına maruz Anosmic hayvan veya hayvan hızla damlacık uzak dolaşın. </li><li> Deneme Süresi: 3 dk. Deneme süresi en kısa sürede hayvan temas plaka duvar olarak geçen ya kadar verilen bir hayvanın hareket kaydedilir. </li><li> Olası davranışsal ölçümü için ölçümlerini: küçük dairesel bir bölgede koku kaynağı merkezli bir hayvan tarafından harcanan zaman yüzdesi; koku kaynağına mesafe demek; koku kaynağı mesafe zaman ders vb. </li></ul> Bu testte verimli mutant larvaları temel anosmi testleri. Aynı zamanda özellikle kokuları 2 için güvenilir algılama eşiğini belirlemek için kullanılabilir. 2.2. Birden fazla koku kaynağı tahlil Çeşitli koku damlacıkları üst kapak iyi serilir. Mevcut video makalede, merkezi satır E. boyunca toplam altı damlacıklarının (standart 96-plaka referans sistemi kuyuları # # E4 E2, E6, E8, E12 # E10 # getirilmiştir gradyanlar kurdu .) Petri kabı ve tek koku kaynağı testlerin aksine, birden fazla koku kaynağı tahlil arena uzunluk ve genişlik boyunca kurulan degrade geometri niteliksel kontrol sağlar. Bu testte chemotax 2 Drosophila larvaları izin duyusal mekanizmaları karakterize etmek için kullanıldı. <ul><li> Uyaran: 10μl koku damlacıkları Bir satır boyunca kuyu alternatif serilir. Bu düzenleme, seçili satır merkezli bir degrade yaratılmasına yol açar. Arena genişliği boyunca homojen bir degrade oluşturmak için, birkaç satır birden fazla kaynaktan yüklenebilir. </li><li> Başlangıç ​​koşulları: Tek bir larva, kuyular # E3 ve arasındaki koku kaynağı altında tanıtıldıE4. </li><li> Temel fenotipleri: anosmic larvaları başlangıç ​​noktası rasgele dolaşmak. Çekici uyaranlara (örneğin izoamil asetat), artan koku konsantrasyonu yönünde gezinmek kokusunu mümkün olan hayvanlar. Olan bir hayvan koku izi yükselir doğruluğu odorant uyarıcı duygusu ve işleme yeteneği ile ilişkilidir. Kıvrımlı yollar genellikle duyu kusurları neden olur. Bir hayvan, deneme en yüksek konsantrasyon noktasına ulaştı, bu pozisyonda çevresinde kalır. </li><li> Deneme Süresi: 3 dk maksimum (larva ilgi kaybedebilir ve sonunda degrade terk gürültü tanıtmak için daha uzun takip süreleri eğilimindedir). Bu video makalede gösterilen degradeler için hayvan yüksek konsantrasyon kaynak (iyi # E12) Mahallesi&#39;nde ulaşıncaya kadar, bireysel bir larva hareketi kaydedildi. Hayvan hedef alan ulaşıldığında veya arena herhangi bir duvara temas olarak kaydetme gibi kısa bir süre durdu. </li><li> Olası davranış ölçümü için ölçümlerini: odorant hattı (mavi dikdörtgen) altında bir hayvan tarafından harcanan zaman yüzdesi; koku degrade yerel yönüne göre başlık anlamına gelir; kombine kemotaksis puan odorant takip etmek bir hayvanın küresel eğilimin ölçülmesi hat 2. </li></ul> 3. Degrade Profil doğrulama Belirli bir degrade larvaları test etmeden önce, zaman içinde kendi dengesini belirlemek için önemlidir. Bu temel üzerinde, deneyci her deneme için yeterli bir süre ve aynı arenada sırayla takip edilebilir larvaların sayısı belirleyebilirsiniz. Degrade kararlılık testi için, IR spektroskopisi 2 dayalı bir yöntem geliştirdi. Bu yöntem, bu protokol kapsamı dışındadır ve daha ayrıntılı olmayacaktır. 4. Bir deney hazırlanması için protokol 4.1. Agaroz plaka ve koku dilüsyonları hazırlanması: <ol><li> 1. 96-iyi çanak kapağı düz üstüne 3% agaroz 25ml dökün; izin agaroz soğumaya ve katılaşmaya (~ 30 dakika). Önemli: 96-kuyu kapakları larvaların davranış etkileyebilir katılaşmış agaroz jel üzerinde bir yamaç varlığı olarak agaroz dökülmeden önce düz bir yüzey üzerinde olduğunu emin olun. Jel dökme işlemi sırasında, yüzeyde formu varsa kabarcıkları giderin. </li><li> 2. Parafin yağı parafin yağı ve koku her seyreltme miktarda doğru ölçmek için bir dijital ölçeği kullanarak istenen konsantrasyonlarda kokuları sulandırınız. </li></ol> Notlar: düşük koku konsantrasyonlarda kullanıldığında, seri dilüsyonları dayalı kaynak konsantrasyonlarda bir dizi hazırlamak için tercih edilir. 1.0M bir çözüm ile, örneğin, bir çözüm 0.5M elde etmek için 1:2 dilüsyon, Start ve gerçekleştirmek. Tekrarlı geçmeden, bir 0.5M geometrik ilerlemesi 1.0M, 0.25m, 0.12M, 0,06 m&#39;lik, 0.03M, 0.015M izleyerek bir seyreltme serisi alır. Önemli: Birçok organik kokuları plastik ile reaksiyona Teflon kapaklar cam şişeleri, koku dilüsyonları saklanmalıdır. İdeal olarak, her bir deney deneyler arasında gerçek koku konsantrasyon dalgalanmaları azaltmak için önce kokuları taze hazırlanmış olmalıdır. Yüksek uçucu kimyasallar kullanarak bu özellikle doğrudur. 4.2. Larva hazırlanması: <ol><li> 1. Distile su ile% 15 sukroz solüsyonu hazırlayın. Notlar:% 15 sakaroz çözeltisini larvaları daha yoğundur ve onlara çözüm yüzey umutlu neden olacaktır. Ancak, çözünmemiş sinek yiyecek parçaları çözüm daha büyük bir yoğunluk var ve hızla dibine çöker. Böylece, bu sakaroz çözeltisini kullanarak etkin bir gıda larvaları ayırma anlamına gelir sağlar. Sakaroz çözeltisini, biyolojik kirleticiler için mükemmel bir ortam, çözüm bulutlu hale gelirse filtresi kontaminasyonu temizlemek için sterilize edilebilir. </li><li> 6 gün yaşlı larva veya istenilen gelişimsel aşamada larvaları ile bir şişe alın. Notlar: Tüm deneyler, 6 gün süren eski larva (üçüncü instar gelişimsel aşamada orta) ile yürütülmektedir, bu gelişimsel aşamada larva izleme yazılımı ile algılama kolaylığı için yeterince büyük, ama aynı zamanda son derece aktif . </li><li> Sakaroz, larvaları içeren gıda flakon içine dökün. </li><li> Bir spatula kullanarak, break up ve larvaların serbest bırakmak için hafifçe sinek gıda çözülür. Çıkış larvaları yüzeye kadar yüzer. </li><li> Flakonun dibine batırmak için anında yiyecek parçaları için birkaç dakika bekleyin, daha sonra, bir Petri kabı içine sakaroz ve larvaları dökün. Larvaların seçim öncesi gerekli ise, hayvanların bir filtre ile sakaroz dökerek toplanabilir. Larva sonra bir fırça ile seçimi için bir çanak transfer edilebilir. </li><li> S yaklaşık 30 dakika boyunca larva bırakındavranış testleri ile hayvanların sakaroz çözeltisini alışmakta izin geçmeden önce ucrose çözüm. Larvaları sakaroz beslemek için görünmez olarak, hayvanların açlık durumundan kemotaksis performansını artırır yaşayacaksınız. </li><li> Petri kabı kapağı (veya sakkaroz) su ile doldurulur ve davranışsal testler sonrasında atılan hayvanlar için bir priz olarak kullanılabilir. </li></ol> 5. Protokolü davranışsal kayıtları gerçekleştirmek için 5.1. Arena set-up: <ol><li> 1. (Doldu tarafı) yeni bir 96-iyi çanak kapağı alt koku damlacıkları uygulayın. Önemli: farklı koku ve koku konsantrasyonları kirlenmeyi önlemek için, yeni bir kapak her yükleme set-up için kullanılması gerekir. Koku kaynakları içeren kapak Yok deney sonra geri dönüştürülür. Bağlı olarak kullanılan koku konsantrasyon aralığı, odorant gradyanlar kapalı bir sistem içerisinde sadece 10 ila 20 dakika boyunca sabit olduğu tespit edilmiştir. Degrade set-up ve davranış testi asıl başlangıcı arasındaki süreyi en aza indirmek için bu nedenle önemlidir. </li><li> Kapağını ters çevirin ve% 3 agaroz tabakası ile kaplı ikinci bir kapak üzerinde yığını. Önemli: koku damlacıkları komşu kuyuların yayılmasını önlemek için dikkatli bir şekilde kapağı haricindekileri. </li><li> Agaroz yüzey üzerinde üst kapağın inversiyon üzerine, koku larva tanıtan önce 30 saniye boyunca diffüz izin verir. </li></ol> 5.2. Yükleniyor larva: <ol><li> Yeterli larva yükleme izin odorant damlacıkları içeren üst kapağı kaldırın. </li><li> Sakaroz çözeltisini agaroz katmanı bir larva transferi. Kullanılan testin hayvan başlangıç ​​pozisyonuna bağlıdır: Tek bir koku kaynağı testi için, larva odorant damlacık altında yayınlandı. Birden fazla koku kaynağı testi için, larva kuyuları # E3 ve # E4 arasında serbest bırakılır. Önemli: Orient tutarlı bir şekilde pazara yeni sunulan hayvanların. Biz degrade yönde yönlendirmek hayvanlar, hayvan vücut ve baş yüksek konsantrasyon yüz emin. Degrade bir oryantasyon karşısında tanıtıldı Hayvanlar arama davranışı başlatın. Bizim görüşümüze göre, bu ilk arama süresi gereksiz bir gürültü kaynağı temsil eder. Baş yönünü kontrol, keşif davranışı sırasında arenada duvara temas hayvanların sayısını azaltır. Bu uygulama asal hayvan hareket yönü veya önemli ölçüde şans eseri odorant hattı boyunca chemotaxing anosmic hayvanların sayısını artırmak değil (yani koku testleri yanlış pozitif). </li><li> Üst kapak değiştirin ve kayıt derhal başlatmak. Notlar: Sağlıklı larvaları arenada sunulmasından hemen sonra sürünerek başlar ve ilk 10 saniye içinde 1cm mesafe kapsayabilir. Deneyci kayıt başlatarak yavaş ise, ilk datapoints kaybolur. Bu nedenle, deneyci bir denemeyi çalıştırmak için denemeden önce kayıt başlatmak için iyi yazılım komutları ile tanışmış olur öneririz. </li><li> Larva (genellikle 3 dakika) kayıt süresi için davranmasına izin verin. Notlar: larva arenada duvara çarptığında ya da hedef alan (degrade tahlil gibi) ulaşırsa Kayıtlar 3 dakika sona ermeden önce sona erdirilir . </li><li> Kaydın sonunda, derhal kapağı kaldırın ve forseps veya bir fırça ile larva kaldırmak. Petri kabı kapağı (veya sukroz) içeren su izlenen hayvanlar yerleştirin. Önemli: Kaydedilen hayvanların yeniden değildir. Su çanağı sadece deneyler çalışırken kaydedilir ve kaydedilen un hayvanları ayırmak için uygun bir priz. </li><li> Bir arena altında birden fazla hayvan izleme set-up olursa, hemen bir sonraki larva yük ve yukarıda gösterildiği gibi kayıt başlatmak. Önemli: set-up aynı alanda yapılan çalışmaların sayısı herhangi bir davranışsal deney 2 gerçekleştirmeden önce kontrol edilmelidir degrade istikrarın temelinde karar verilmelidir. </li><li> Bir kez arenada set-up izlenir ve arenada kaldırılır var altında test edilmesi için tüm larvaları, üst kapak ve agaroz katmanı atın. Ara kapak (yani agaroz kapak) geri dönüştürülebilir. Not: Biz, &#39;arka plan çıkarma&#39; algılama yöntemi seçmek için Ethovision kullanıcılara tavsiye ediyoruz . </li></ol> 6. Video makale gösterilen örnek deneyleri 6.1. Izoamil asetat 1.0M Tek koku kaynağı tahlil. Bir numara atanmış olan, her biri mutantlar ve on vahşi tip (W1118) larvaları - Biz körü körüne on Or83b / test. Izleme denemeer her hayvanın genotipi hakkında herhangi bir bilgi almadı. Tüm deneme için kaynak altında birikimi gözlendi, smellers yolu çabuk koku kaynağı Mahallesi&#39;nde sol olmayan smellers, her kaydettikten sonra, bir öngörü fenotip test edilen her hayvan atandı. 20 hayvan davranışı kaydedildi ettikten sonra, yolları fenotipe göre gruplandırıldı. Bu gruplaşma sonucu larvaların gerçek genotip ile karşılaştırıldı yapılan tüm atamaları doğru olduğu tespit edildi. 6.2. Izoamil asetat üstel ve lineer degradelerle Çoklu koku kaynağı tahlil. Bu deneyde, lineer ve üstel bir degrade boyunca chemotaxing vahşi tip larvaların performansları karşılaştırıldı. Kemotaktik davranışları 0.5M, aynı yüksek konsantrasyon ile iki gradyanlar kaydedildi. Makalede açıklandığı gibi, üstel degrade koku kaynakları, 0,015 ve 0,5 M arasında değişiyordu. Doğrusal bir degrade kaynakları, 0,25 ve 0,5 M (0.05M ortak farkı aritmetik ilerlemesi) arasında değişiyordu. Doğrusal bir degrade, konsantrasyon, yerel fark sürekli ve görece küçük olduğu gibi daha zorlu kemotaksis ortamı temsil ve dar bir konsantrasyon aralığında (0.25m). Buna karşılık, üstel degrade konsantrasyon aralığı patikada konsantrasyon yerel farklılıklar artan büyüktü. Onbeş larvaları, her iki degrade geometrileri ve tek bir grafikte üst üste yolları kaydedildi. Iki grafik görsel denetim, vahşi tip larva hem de geometrileri için degrade güvenilir yükselmek mümkün olduğunu ancak kıvrımlı miktarını doğrusal bir degrade durum için daha fazla olduğunu gösterir. Bu sinyalin degrade uzunluğu boyunca doğrusal bir biri için çok daha güvenilir bir üstel şekli tespit olduğunu göstermektedir. 6.3. Izoamil asetat degrade bir &quot;çatı&quot; geometri ile birden fazla koku kaynağı tahlil. Burada bir koku degrade getirilen larvaların yerine sadece koku varlığı ya da yokluğu çok koku konsantrasyonu yerel değişikliklere duyarlı olduğunu doğrulayın. 0.06, 0.12, 0.25, 0.5, 0.25, 0.12M: Bir izoamil degrade Aşağıdaki konsantrasyonlarda koku damlacıklarının uygulama tarafından kurulmuştur. Bunu takip eden degrade geometri 0.5M kadar yükselerek asimetrik bir &quot;çatı&quot; benziyordu. Larva ve 0,06 m&#39;lik 0.12M koku damlacıkları arasında serbest bırakıldı. Bizim hipotezi larvaları sadece koku varlığı bilgisayar eğer belirli bir konsantrasyonu en fazla tercih yapmaksızın tüm degrade takip edecek. Buna karşılık, eğer larvalar 0.5M damlacık altında birikir konsantrasyon yerel değişikliklere duyarlıdır. Onbeş larvaları kaydedildi ve tüm larvalar kısa bir keşif döneminde de yüksek konsantrasyonda altında biriken bulundu. Bu yerel değişiklikler koku konsantrasyonu hesaplanır ve Drosophila larvaların kemotaktik davranış bilgilendirmek olduğunu göstermektedir.

<ol>
	<li>Fishilevich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+behavior+mediated+by+single+larval+olfactory+neurons+in+Drosophila.">Chemotaxis behavior mediated by single larval olfactory neurons in Drosophila.</a> Curr Biol. 15, 2086-2096 (2005).</li><li>Louis, M., Huber, T., Benton, R., Sakmar, T. P., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilateral+olfactory+sensory+input+enhances+chemotaxis+behavior.">Bilateral olfactory sensory input enhances chemotaxis behavior.</a> Nature Neuroscience advance online publication. , (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

high-resolution measurement of odor-driven behavior in drosophila larvae

Drosophila larvaları Olfaktör yanıtları geleneksel tek bir periferik koku kaynağı içeren Petri kutularına çalışılmıştır. Bu davranış paradigma, deneyci genellikle kaynaktan odorant moleküllerin hızlı difüzyon çanak istikrarlı bir degrade yaratılmasına neden olduğunu varsayar. Duyusal girdilerin ve davranışsal yanıtları arasında kantitatif bir ilişki kurmak için, daha kapsamlı bir karakterizasyonu odorant uyaran koşulları elde etmek için gerekli. Bu video makalede, istikrarlı ve denetlenebilir geometrileri odorant degradelerin inşaat sağlayan yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Biz kısaca bu gradyanlar koku alma kusurları (tam ve kısmi anosmi) ekrana nasıl kullanılabileceğini göstermek ve daha ince kemotaksis davranış özelliklerini incelemek için.

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae at JoVE.com

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Bu video makalede, istikrarlı ve denetlenebilir geometrileri odorant degradelerin inşaat sağlayan yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Biz kısaca bu gradyanlar koku alma kusurları (tam ve kısmi anosmi) ekrana nasıl kullanılabileceğini göstermek ve daha ince kemotaksis davranış özelliklerini incelemek için.

Yüksek çözünürlüklü Ölçüm Drosophila Larva Koku-Driven Davranış

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

high-resolution-measurement-odor-driven-behavior-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Görüntüleme.  Rockefeller University. Bu video makalede, istikrarlı ve denetlenebilir geometrileri odorant degradelerin inşaat sağlayan yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Biz kısaca bu gradyanlar koku alma kusurları (tam ve kısmi anosmi) ekrana nasıl kullanılabileceğini göstermek ve daha ince kemotaksis davranış özelliklerini incelemek için.

Video: High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

3. Instar Drosophila Larva hayali Disklerin Diseksiyon

Biyoloji

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Yetişkin Drosophila melanogaster Locomotion Yüksek Çözünürlüklü Video Takip

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

In ömrü ölçümü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Zebra balığı Larva kas fonksiyonu değerlendirmek için daralma sırasında Kuvvet Ölçümü

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Drosophila'da Sıcaklık Tercih Davranışının ve Sirkadiyen Ritminin Tasarımı ve Analizi

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Metabolik Oranı Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Respirometrik kullanarak

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

Larvaların Faaliyet Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...