Dr T. Otis, Nörobiyoloji Bölümü, UCLA, Biz bize TPLSM tesis paylaşımı için teşekkür eder, Dr. C. pEYFP ClC1 plazmid tür bağış için Fahlke, Fizyoloji Enstitüsü, RWTH Aachen, Almanya, ve Sn. teknik destek için R. Serrano. Bu çalışma NIH / NIAMS hibe AR047664 ve AR54816 bağışları ile desteklenmiştir.

FDB ve IO kasları in vivo elektroporasyon Deneysel Prosedürler <ol><li> In vivo elektroporasyon protokolleri başlamadan önce, memeli ifade plazmid konsantrasyonu 2-5 mg / ul TE plazmid Not aralığında verim amplifiye olmalıdır: Biz rutin olarak ticari amplifikasyon kitleri kullanın ve üreticinin prosedürleri takip . In vivo transfections iskelet kası çok iyi CMV organizatörü çalışma taşıyan Ticari ifade plazmid. </li><li> Kısım plazmid çözüm gerekli hacmi (10-20 ul) ve iki adet 0.5 ml Eppendorf tüpleri (fare her bir ayak için bir tane) kaydedin. </li><li> Steril Tyrode 2 mg / ml hiyalüronidaz içeren bir solüsyon hazırlayın. </li><li> Bir anestezi kutusunu kullanarak, derin bir fare kullanarak onaylı bir gaz anestezi makinası ile O2% 4 izofluran anestezisi. Bir ısıtma yastığı (37 ° C) hayvan koyun ve bir kemirgen yüz maskesi kullanılarak anestezi korumak. Ayak tutam refleks ile anestezi derinliği izleyin. </li><li> Diseksiyon mikroskobu ile gözlem altında 1 &quot;uzun 33 göstergesi steril bir iğne kullanarak fare tek ayak ayak pedleri, 10 mcL altında hiyalüronidaz çözüm enjekte edilir. Ayağın topuk yakın bir noktada cilde nüfuz etmesini ve deri altına iğne ~ 1 / 4 &quot;için ayak tabanına doğru ilerlemek. </li><li> İstenirse diğer ayak ile aynı işlemi tekrarlayın. </li><li> Anestezi çıkarın ve fareyi bir kafes yerleştirin. Tam anestezi kurtarmak için izin verin. </li><li> Bir saat sonra, ikinci kez hayvan uyutmak ve ısıtma yastığı koyun. Hiyalüronidaz çözüm için açıklanan aynı prosedürü izleyerek, plazmid DNA (plazmid yapının büyüklüğüne göre) toplam 20-50 mg enjekte edilir. Toplam enjeksiyon hacmi az 20 mcL / ayak olmalıdır Not: 15-20 μ L gerekli olduğunda, cilt, doku yapıştırıcı ile iğne giriş noktasında kapatmak için tavsiye edilir . </li><li> Anestezi çıkarın ve fareyi bir kafes yerleştirin. Tam anestezi kurtarmak için izin ver ve 10-15 dakika bekleyin. </li><li> Üçüncü kez hayvan anestezisi ve ısıtma yastığı koyun. </li><li> Hayvanın bir ayağı seçin. Koyun, altın kaplama akupunktur Topuk deri altında iğne ve ayak tabanında bir diğeri. Elektrotlar yönelik ayak uzun eksenine dik ve birbirlerine paralel. </li><li> Iğneler (elektrotlar), mikro-klip konnektörleri kullanarak elektrik stimülatörü başkanı bağlayın. 1Hz 20 bakliyat, süresi / her biri 20 ms uygulayarak kasları Electroporate. Elektrotların aralık bağlı olarak, darbeleri &#39;gerilim genliği (bir osiloskop ile izleme), ~ 100 V / cm Not elektrik alan verim ayarlanır: uyaranlara yanıt yok kasılmaları dikkat edilmelidir düzeyinin ise anestezi yeterli. </li><li> İsterseniz, hayvan kontralateral ayak yukarıdaki işlemleri tekrarlayın. </li><li> Kendi kafesine hayvan dönün ve bir kez tam olarak gözlem altında sürdürmek anestezi kurtarıldı. Not: prosedürün normal giderse, hayvan, 30 dakika içinde tam hareketlilik kazanması ve daha sonra vivaryum hayvan odasına geri gönderilmek üzere hazır. Ayak pedleri hiyalüronidaz ve DNA enjeksiyonları, hayvanlar üzerinde farkedilebilir olumsuz etkileri yoktur. Bir kez anestezi kurtarıldı, fareler normalde kafes etrafında eşkin edebiliyoruz. Ek bir önlem olarak, 0,0027 mg / ml analjezik olarak 2 gün süreyle hayvan Carprofen içme suyu ekleyin. </li><li> Protein ifade transfeksiyon 2-8 gün sonra test edilmelidir. Ancak, birçok proteinlerin sürekli ifade ay boyunca görülmüştür. </li></ol> NOT: Hayvan Refahı Kanunu ve İnsani Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım PHS Politikası tarafından zorunlu olarak tüm hayvan işlemleri UCLA Başbakanı Hayvancılık Araştırma Komitesi tarafından kabul edildi. Temsilcisi Sonuçlar: FDB ve IO kasları plazmid etkin transfeksiyon, yukarıda açıklanan in vivo elektroporasyon prosedürleri doğru bir şekilde uygulanması sonucu gerekir . Ancak, transgenik protein çeşidi ifade verimliliği plazmid bağlıdır, protein, protein, fonksiyonel özellikleri ve bizim kontrolümüzün dışındaki diğer değişkenler bir dizi boyutu ve karmaşıklığı. MCherry protein için ticari bir plazmid (PMR-mCherry) kodlama varlığı electroporated bir FDB kas için Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi, bunlardan en çok kırmızı floresan ekran gerçeği ile gösterildiği gibi, kas liflerinin çoğu bizim protokol ile transfekte . Bu bireysel lifleri farklı derecelerde protein ekspresyonu sergileyen olasılığını ekarte değildir, ya da birkaç lif her 3 transfekte değildir. B olmalıdıre mCherry, EGFP, ECFP ve EYFP gibi floresan proteinleri büyük miktarda verimli bir şekilde ifade, kas lifleri eksitabilite ve eksitasyon-kasılma kaplin özellikleri zarar etmediğini kaydetti. Aslında, onlar sahte transfekte kasları (sonuçlar gösterilmemiştir) olanlardan ayırt edilemez. Iskelet kas lifleri floresan etiketli proteinlerin yerelleştirilmiş ifade doğrulamak için kullanılan pratik yaklaşımlar. Di novo ifade edilen transgenik proteinlerin hücre içi yerelleştirme rutin hücresel yapılarının iyi tanımlanmış belirteçlerin ilgili etiketleri ve görüntülerin TPLSM, floresan görüntüleri kullanarak, aynı anda satın tarafından değerlendirilir . Bu son en tipik şunlardır: a) ikinci harmonik üretimi (SHG) sarkomerik miyozin anizotropi bir bant (M hatları merkezli) 9,10 ortaya çıkan görüntü, ve b) di-8-ANEPPS floresan görüntüleri, yüzey ve enine tübüler bu laktobionat potansiyometrik dye11 kas liflerinin (T-tübül) sistemi zarı etiketleme ile elde edilebilir. Di-8-ANEPPS ile boyandı kas liflerinin floresan görüntüler, T-tübüller uzun lif eksenine floresan odaklı yaklaşık dik dar bant olarak görünür. Bu bantlar eşitsiz birbirinden aralıklı: M-hatları üzerinden yayılan uzun bir mesafe ve 11 Z-line üzerinden yayılan kısa bir bir ayrılır. İfade ve iskelet kas lifleri α-aktinin-EGFP lokalizasyonu. Α-aktinin, yapısal kas protein etiketli bir varyant ifade bir örneği Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Bu protein gibi rutin olarak bu structure12 bir işaretleyici olarak kullanılan, Z-line önemli bir bileşeni olarak bilinen ve. Biz α-aktinin EGFP ile C terminalinde etiketli insan (non-kas) plazmid pEGFPN1-α-actinin1 kodlama FDB ve IO kasları transfekte. Transfeksiyon Altı gün sonra, α-aktinin çoğunlukla lif ekseni boyunca eşit aralıklı dar bantlar ifade EGFP floresan dağıtım, değerlendirilen bulundu. Sarkomer başına tek bir grup (Şekil 2A ve 2B) görülür. Z-hatları ile bu bantları ko EGFP floresan dağıtım SHG (Şekil 2B) ve di-8-ANEPPS (Şekil 2E) görüntüleri ile karşılaştırarak gösterilmiştir. Z-hatlarının konumu ile örtüşen, birbirini takip eden iki M-bantları arasında yarı yolda bulunan olduğunu belirterek, SHG bantları ile α-aktinin EGFP bantları alternatif kaplama görüntü (Şekil 2C) ile gösterilir. Di-8-ANEPPS ile boyanmış transfekte kas lifleri, α-aktinin-EGFP bantları, T-tübüller (Şekil 2F) kanadına Z hatları (yani kısa bir mesafe ile ayrılmış) bilinen her çifti arasında merkezli görülür böylece transgenik α-aktinin, Z-line hedef olduğunu göstermektedir. DHPRα1s İfadesi EGFP N-terminalindeki etiketlenen PEGFPC1.1-DHPR α 1s kas transfeksiyon etkinliği olduğunu gösteren TPLSM görüntü (örneğin Şekil 3A) doğrulandı en lifleri ifade EGFP DHPRα1s (transmembran protein). Transfekte lifleri en belirgin özelliği, bu proteinin T-tüplerdeki hedef ise bekleneceği üzere çift bantlı desen EGFP floresans (Şekil 3A ve 3B). Aynı zamanda farklı liflerin floresan çeşitli düzeylerde görüntüler, bantlı floresan desen bireysel bir lif lif boyunca homojen korunabilir görünüyor Şekil 3&#39;te görülebilir. Yüksek büyütme (Şekil 3B), açıkça, düzensiz gruplar arasında boşluk di-8-ANEPPS (örneğin Şekil 2E) boyanmış lifleri gözlenen benzer olduğunu görülmektedir olabilir. Bindirme görüntüleri (Şekil 3B &amp; 3E) SHG bantları, bu proteinin T-tübüller olduğunu doğrulayan EGFP-DHPRα1s bantları arasında büyük bir boşluk içinde yer olduğunu göstermektedir. Ek floresan olmayan lipofilik anyon ile ölçümler FRET DPA (veriler gösterilmemiştir) EGFP benzer parçaları daha T-tübüller &#39;membranların iç broşürün birkaç nanometre içinde olduğunu göstermek. Yerelleştirme ve EYFP-ClC1 ifade fonksiyonel değerlendirme EGFP-DHPRα1s gözlenen benzer bir yapı ile iskelet kas klorür kanal (ClC1), ekran EYFP floresan bantları (Şekil 4A) EYFP etiketli inşa (N-terminal) kodlar pEYFP ClC1 ile transfekte Elyaf &#39;ifade (Şekil 3A) ve di-8-ANEPPS boyama (Şekil 2E) ile gösterildiği gibi T-tübül düzenlemeye karşılık. Beklendiği gibi, üst üste EYFP-ClC1 (Şekil 4A) ve SHG görüntüleri (Şekil 4B) kaplama (Şekil 4C) &#39;de gösterildiği gibi, SHG büyük boşluklar o bantlar merkezli olduğunu göstermekEYFP floresan bantları arasında f. EYFP ClC1 sonuçları fonksiyonel klorür kanalları aşırı ekspresyonu beklendiği gibi kas lifleri dinlenme iletkenlik önemli bir artış ifade transfekte FDB kas enzimatik ayrışmış kas lifleri ve elektrofizyolojik özellikleri okudu olmadığını değerlendirmek için deney düzeneği daha önce bir iki Mikroelektronlar kullanarak 6,11,13 tarif . Biri, standart bir floresan mikroskop küresel floresan yoğunluğu ölçümleri (gösterilmemiştir) değerlendirilen EYFP-ClC1 büyük miktarlarda ifade ve diğer olmayan bir transfekte kontrolü: Şekil 5 iki liflerinden sonuçları gösterir. Şekil 5A gerilim kayıt (EYFP ClC1 ifade kas lifi elde) aşırı dinlenme iletkenlik nedeniyle gösterir, fiber neredeyse olmayan heyecanlı. Şu uyaran bakliyat kadar 400nA (0.5ms) çok küçük bir aktif yanıt (hiçbir aşmayı, Şekil 5A) ortaya çıkarmak için kullanılan gerekiyordu. Klorür kanal blokeri 9-ACA 500 mcM içeren bir dış Tyrode çözüm değiştirilmesi sonra, 200 nA akım darbeleri (, kontrol fiber kaydedilen dışında olmasına rağmen çok daha yavaş ve daha geniş bir aksiyon potansiyeli (Şekil 5B) ortaya çıkarmak için yeterli Şekil 5C). Beklendiği gibi, bu kontrol fiber (Şekil 5D) 9-ACA Ayrıca minimal etkisi vardı. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520fig1tmb.jpg" alt="Şekil 1" border="0" /> Şekil 1 in vivo elektroporasyon yöntemi Transfeksiyon verimliliği aydınlık (A) ve floresans (B) bir FDB kas görüntüleri PMR-mCherry transfekte. Elektroporasyon protokol gün sonra 12 gün. Lütfen <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1520/1520fig1.jpg">buraya tıklayın</a> Şekil 1&#39;de bir büyük versiyonu için. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 İfade ve FDB lifleri α-aktinin-EGFP hedef Panelleri A ve B sırasıyla α-aktinin-EGFP ifade eden bir lif EGFP floresan ve SHG görüntüleri,. Panel C, A ve B. Paneller D ve E görüntüleri süperpozisyon, sırasıyla, di-8-ANEPPS ile α-aktinin-EGFP ve lekeli ifade başka bir lif floresan görüntüler. 6 gün: Panel F elektroporasyon protokolü sonra D ve E. günlük görüntüler süperpozisyon. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 İfade ve FDB lifleri EGFP-DHPRα1s hedef. Panel, EGFP-DHPRα1s ifade liflerinin bir grup EGFP floresan görüntü. B Paneli kare bir genişleme panelinde bir protein ifade bantlı desen daha iyi göstermek için. Panel C SHG görüntü paneli A. Panel D görüntüye karşılık gelen görüntü bindirme A ve C. Panel E elektroporasyon protokolü sonra panele D. Gün gösterilen alanında bir genişleme: 20 gün. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 İfade ve FDB lifleri EYFP-ClC1 hedef. Paneller A ve B lifleri EYFP-ClC1 ifade sırasıyla EYFP floresan ve SHG görüntüler,. 7 gün: Panel C, A ve B Paneli D elektroporasyon protokolü sonra panele C. Gün görüntü vurgulanan beyaz çizgi boyunca ölçülen bir yoğunluk profili panelleri görüntülerin süperpozisyon. <img src="/files/ftp_upload/1520/1520figure5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 transgenik EYFP-ClC1 Panelleri ifade Elektrofizyolojik değerlendirme lifleri A ve B sırasıyla, 9-ACA ile tedavi öncesi ve sonrası akım darbeleri yanıt EYFP-ClC1 ifade fiber gerilim kayıtları. Panelleri C ve D olmayan bir transfekte fiber akım darbeleri karşısında aksiyon potansiyelleri ortaya çıkardı gerilim kayıtları sırasıyla 9-ACA ile tedavi öncesi ve sonrası.

<ol>
	<li>Muangmoonchai, R., Wong, S., Smirlis, D., Phillips, I., Shephard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+liver+in+vivo+by+biolistic+particle+delivery.">Transfection of liver in vivo by biolistic particle delivery.</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 145-151 (2002).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+dynamic+FRET+signals+from+the+transverse+tubules+in+mammalian+skeletal+muscle+fibers.">Voltage-dependent dynamic FRET signals from the transverse tubules in mammalian skeletal muscle fibers.</a> J Gen Physiol. 130 (6), 581-600 (2007).</li><li>DiFranco, M., Neco, P., Capote, J., Meera, P., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+mammalian+skeletal+muscle+as+a+heterologous+protein+expression+system.">Quantitative evaluation of mammalian skeletal muscle as a heterologous protein expression system.</a> Protein Expression and Purification. 47 (1), 281-288 (2006).</li><li>Meera, P., Dodson, P. D., Karakossian, M. H., Otis, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GFP-tagged+neuronal+glutamate+transporters+in+cerebellar+Purkinje+neurons.">Expression of GFP-tagged neuronal glutamate transporters in cerebellar Purkinje neurons.</a> Neuropharmacology. 49 (6), 883-889 (2005).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Quinonez, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+FRET+Signals+between+DPA+and+the+{alpha}1s+and+{beta}1a+Subunits+of+the+DHPR+of+Mammalian+Skeletal+Muscle.">Dynamic FRET Signals between DPA and the {alpha}1s and {beta}1a Subunits of the DHPR of Mammalian Skeletal Muscle.</a> Biophys. J. 94, 2633-2633 (2008).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+in+the+transverse+tubular+system+and+voltage+dependence+of+calcium+release+in+normal+and+mdx+mouse+muscle+fibres.">Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 568 (Pt 3), 867-880 (2005).</li><li>DiFranco, M., Woods, C. E., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophic+skeletal+muscle+fibers+display+alterations+at+the+level+of+calcium+microdomains.">Dystrophic skeletal muscle fibers display alterations at the level of calcium microdomains.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14698-14703 (2008).</li><li>Lueck, J. D., Mankodi, A., Swanson, M. S., Thornton, C. A., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Chloride+Channel+Dysfunction+in+Two+Mouse+Models+of+Myotonic+Dystrophy.">Muscle Chloride Channel Dysfunction in Two Mouse Models of Myotonic Dystrophy.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 79-94 (2007).</li><li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation.">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li><li>Plotnikov, S. V., Millard, A. C., Campagnola, P. J., Mohler, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Myosin-Based+Source+for+Second-Harmonic+Generation+from+Muscle+Sarcomeres.">Characterization of the Myosin-Based Source for Second-Harmonic Generation from Muscle Sarcomeres.</a> Biophys J. 90 (2), 693-703 (2006).</li><li>DiFranco, M., Capote, J., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+and+functional+characterization+of+the+transverse+tubular+system+of+mammalian+muscle+fibers+using+the+potentiometric+indicator+di-8-ANEPPS.">Optical imaging and functional characterization of the transverse tubular system of mammalian muscle fibers using the potentiometric indicator di-8-ANEPPS.</a> J Membr Biol. 208 (2), 141-153 (2005).</li><li>Mills, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+actin-binding+proteins,+{{alpha}}-actinin-2+and+-3,+in+different+species:+implications+for+the+evolution+of+functional+redundancy.">Differential expression of the actin-binding proteins, {{alpha}}-actinin-2 and -3, in different species: implications for the evolution of functional redundancy.</a> Hum. Mol. Genet. 10 (13), 1335-1346 (2001).</li><li>Woods, C. E., Novo, D., DiFranco, M., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential-evoked+sarcoplasmic+reticulum+calcium+release+is+impaired+in+mdx+mouse+muscle+fibres.">The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres.</a> J Physiol. 557 (Pt 1), 59-75 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Biz burada, in vivo elektroporasyon iskelet kas lifleri DNA plazmid etkili transfections ulaşmak için takip edilmesi gereken ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır . Yaklaşımın ana avantajı, uygulama kolaylığı ve hayvanlar için önemsiz sağlık açısından tehlike sonuçları minimal invazivlik. Gerçekte, yukarıda açıklanan elektroporasyon protokolleri anestezi altında hayvanlar tarafından iyi tolere edilen tüm elektrik stimülasyonu protokolü tarafından takip ayak başına iki subkutan e...

dna transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation

Hücre biyolojisi büyüyen bir ilgi endojen dağılımı ve fonksiyonel önemi araştırmak için gerekli proteinler (örneğin floresan etiketli yapıları ve / veya mutant türevleri) transgenically değiştirilmiş biçimlerini ifade etmek. Ilginç bir yaklaşım tamamen farklılaşmış hücrelerin bu amacı yerine getirmek için uygulamaya konmuştur.<em&gt; In vivo</em, Karaciğer gibi özel dokulara çeşitli yöntemlerle plazmid&gt; transfeksiyon<sup&gt; 1</sup&gt;, Iskelet kası<sup&gt; 2,3</sup&gt; Ve hatta beyin<sup&gt; 4</sup&gt;. Biz burada verimli lifleri genetik materyal transfect için takip edilmesi gereken adımları ayrıntılı bir açıklama mevcut<em&gt; Fleksör digitorum brevis</em&gt; (FDB) ve<em&gt; Interosseus</emBir yetişkin farelerin&gt; (IO) kaslar<em&gt; In vivo</em&gt; Elektroporasyon yaklaşım. Deneysel parametreleri tek fiber ifade proteinlerin nitelik ve nicelik bozabilir doku zedelenmelerinde en aza indirerek transfekte kas liflerinin sayısını en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiştir. Biz bu yazıda anlatılan metodoloji uygulanması çözünür proteinlerin yüksek verim, yani EGFP ve ECFP sonuçları doğruladıktan<sup&gt; 3</sup&gt; Calpain, FKBP12, β2a DHPR, vb yapısal proteinleri, yani minidystrophin ve α-aktinin; ve membran proteinleri, yani α1s DHPR, RyR1, kardiyak Na / Ca<sup&gt; 2 +</supFDB, IO ve diğer kasların fare ve sıçanlarda uygulanan değiştirici, NaV1.4 Na kanal, SERCA1, vb. Bu proteinlerin bazı etkili ifade biyokimyasal ile onaylandı<sup&gt; 3</sup&gt; Ve fonksiyonel bir kanıt<sup&gt; 5</sup&gt;. Ancak, şimdiye kadar bize en sık kullanılan doğrulayıcı yaklaşım floresan etiketli protein yapıları standart floresan mikroskopi ve 2-foton lazer tarama mikroskobu (TPLSM), sadece genel olarak ifade tanımlamak için izin verir, ama aynı zamanda detaylı intrasellüler localisation. (Burada görüldüğü gibi) ifade için fizyolojik ilgili proteinleri kodlayan plazmid transfect yöntemi eşit kullanılan ya da parazite RNA (siRNA) normalde ifade proteinleri (henüz test edilmedi) ifade bastırmak için amaçlayan olabilir. Bu kasların enzimatik ayrışmış liflerin altında temel uyarılabilirlik ve eksitasyon-kasılma kaplin mekanizmalarının araştırılması için şu anda en uygun modellerin biri olduğundan FDB ve IO kas liflerinin transfeksiyon memeli kas fizyolojisi soruşturma için özellikle ilgili olduğunu belirtmek gerekir akım veya gerilim kelepçe<sup&gt; 2,6-8</sup&gt;.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation at JoVE.com

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Biz elektroporasyon ve floresan mikroskobu kullanarak protein ekspresyonu sonraki görselleştirme kullanılarak canlı farelerin ayak kaslarının lifleri plazmid DNA verimli transfeksiyon ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır.

Memeli İskelet Kaslar kullanarak DNA Transfeksiyon In Vivo Elektroporasyon

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

dna-transfection-mammalian-skeletal-muscles-using-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

17.7K Görüntüleme.  David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles. Biz elektroporasyon ve floresan mikroskobu kullanarak protein ekspresyonu sonraki görselleştirme kullanılarak canlı farelerin ayak kaslarının lifleri plazmid DNA verimli transfeksiyon ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır.

Video: DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Tek Hücre Elektroporasyon bozulmamış Gelişmekte olan beyin içindeki in vivo

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Biyoloji

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.

Yetişkin grubuyla Memeli Nöronlar içine DNA intranükleer Mikroenjeksiyon

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Memeli Hücrelerde DNA çift iplikli Break (DSB) Tamir Analizi

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

Fare Testis İn Vivo Mikroenjeksiyon ve Elektroporasyon

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Fare İskelet Kası Algılama ve DNA Hasar Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; TÜNEL Yöntemiyle

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.

This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.