PCAG gapEGFP plazmid Dr. S. McConnell (Stanford, CA) bir hediye oldu. pCAG-tdTomato plazmid Dr. M. Feller (Berkeley, CA) bir hediye oldu. Biz, teknik destek için pilot çalışmalar ve Crair laboratuvar üyeleri iki plazmid Cre / loxP strateji doğrulamak için tek bir hücre etiketleme ve Anne Schohl (Montreal, QC) için iki plazmid strateji kullanımı öneren Dr. Edward Ruthazer teşekkür ederiz. R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) ve NIH P30 EY000785 (MC) ile desteklenir.

1. Set-up Elektroporasyon için ekipman <ol><li> Elektrotlar: Biz Dumont elektrotlar olarak kullanmak için # 5 forseps güncellenmiştir. <ol><li> Ayrı ve forseps parçalayın. </li><li> Lehim her dişine daha geniş sonunda bir tel. Tel bağlanmış ve yalıtım bandı ile dişleri maruz çatallı ucu yaklaşık 25-30 mm bırakarak sarın. </li><li> Modifiye forseps bahar eylem sağlamak için uygun plastik iki dişleri arasında herhangi bir boşluk (örneğin, bir düğme) ile tekrar bir araya koyun. </li></ol></li><li> Elektrik donatımı: Biz, teslim olmak bakliyat dalga ve numarayı onaylamak için elektroporasyon ve osiloskop ve ses monitör için geçerli bakliyat sunmak için bir elektrik stimülatörü kullanın . <ol><li> Stimülatör ile seri bağlı bir ayak pedalı forseps biri diş teli bağlayın. Ayak pedalı bir anahtar olarak görür. Zaman depresif devre elektroporasyon için tamamlar. </li><li> Diğer diş elektrik stimülatörü tel bağlayın. </li><li> Stimülatörü osiloskop ve ses monitör bağlayın. </li></ol></li><li> Set-up mikropipet ve enjektör: Biz doğrudan retinanın içine boya veya DNA çözümü çok küçük hacimlerde enjekte etmek için, keskin cam pipetler çekti ve Nanoinject II enjektör sistemi kullanın . <ol><li> 3-eksenli mikromanipülatör Mount enjektör sistemi. </li><li> Uzun konik ve küçük ucu cam pipetler çekin. </li><li> Geri (ayrıntılar Nanoinect II kullanım kılavuzu görmek için), madeni yağ ve güvenli enjektör ile çekilir pipet doldurun. </li><li> Keskin microdissecting makas kullanarak küçük bir açıklık (~ 2-3 mm), pipet ucu kesilmiş. </li><li> Pipet, pipet ucu ile enjeksiyon çözüm istenilen miktarda doldurun. Sürece ucu bütünlüğünü tutan, çoklu enjeksiyon ve hayvanlar için kullanılır. Not: i) yeterli enjeksiyon çözüm yeniden toprakla mineral yağ, göz içine enjekte asla böyle ipuçları yüklü olduğundan emin olun. ii) Nanoinject II sistemi ve bu videoda kullanılan özel elektronik cihazlar RGCs başarılı bir şekilde etiketlenmesi ulaşmak için kritik değildir. Gibi diğer ortak uyarıcıları picospritzer ve elektroporasyon gibi diğer cihazlar ile yapılan Enjeksiyonlar etiket RGCs de kullanılabilir. </li></ol></li></ol> 2. RGC Etiketleme Plazmid Çözümler <ol><li> RGCs küçük kümeler etiketleme: CAG organizatörü (CMV derhal erken arttırıcı tavuk β-aktin organizatörü) kontrolü altında bir yapı kodlama EGFP (~ 2-3 mikrogram / ​​mcL) gelişmiş yeşil flüoresan protein) kullanırlar. EGFP, hücre zarı (mut4EGFP) 12 hedeflemesi GAP-43 palmitoylation dizisi (büyüme ilişkili protein-43) ile etiketlenir . Bu yapı pCAG-gapEGFP olarak adlandırılır. </li><li> Tek bir hücre için etiketleme: Biz iki yapıları bir arada kullanın. Ilk vektör Cre recombinase (pCAG Cre, Addgene [Cambridge, MA] plazmid 13775) 13 ve ikinci vektör hedeflenen EGFP (pCAG-LNL-gapEGFP) membran tarafından takip floxed DUR kaset içeren sürüş CAG organizatörü. pCAG Cre (~ 0.15-ng/μL) (gereğince hücrelerin az sayıda güçlü EGFP ifade hapsetmesi pCAG-LNL-gapEGFP (1-2 μgμL) &#39;den yaklaşık 1,000-10,000 kat daha düşük konsantrasyonda nispeten düşük pCAG Cre konsantrasyon). </li></ol> 3. Retina Enjeksiyon ve Elektroporasyon Protokolü <ol><li> P5 daha yaşlı farelerin intraperitoneal ketamin (4,28 mg / ml), ksilizin (0.82 mg / ml), bir kokteyl (0.7 ml / kg) ile anestezi ise postnatal gün P5 yavrular 0 (P0), hipotermi ile anestezi ve acepromazine (0.07mg/ml) 14. </li><li> Cerrahi aletler ve sıcak bir boncuk sterilizatör tüm elektrot ipuçları sterilize edin. Daha sonra göz termal zarar vermemek için kullanmadan önce steril serum fizyolojik hem de serin. </li><li> Bir diseksiyon kapsamı ve pozisyon enjektör altında yer fare. </li><li> P14 (göz açmadan önce) daha genç fareler için, cerrahi mikro diseksiyon yaylı makas b ile gelecekteki göz kapağı açma boydan boya keserek göz kapağı açın . </li><li> Göz küresi kısmen forseps c ipuçları ile göz çevresinde hafifçe basınç uygulayarak çıkıntı olun. </li><li> Bir yerde göz göz küresi çevresindeki deri hafifçe sıkıştırılarak tutun. </li><li> Mikromanipülatör ayarlayın ve göz küresi yakın pipet getirmek. </li><li> Basın ayak pedalı, Nanoinject II sistemi, enjeksiyon solüsyonu birkaç damla sınırdışı ve böylece pipet tıkalı olmadığını doğrulamak için bağlı. </li><li> Bir yandan göz küresi stabilize, cam pipet ucu, retinal pigment epiteli ile deler ve retina girdiği mikromanipülatör hareket ettirin. </li><li> Des enjekteNanoinject II sistemi için ayak pedalına basarak çözüm ired miktarı. Örneğin, 2.3-4.6nL tek bir enjeksiyon yapmak tek RGCs etiket. </li><li> Pipet geri çekin ve dikkatli bir şekilde enjeksiyon sitesi üzerinden doğrudan elektrot ipuçları ve devreyi tamamlamak ve göz electroporate Stimülatörü için ayak pedalına. Biz genellikle 25V gücü, 50 milisaniye süresi, ayrı 1sn ayarları kare darbeleri kullanın. 10 bakliyat (5 bakliyat her polarite) P4 daha eski ve 6 bakliyat (3 bakliyat her polarite) P3 fareler P0 için uygulanan farelerde uygulanır. </li><li> Sokete yavaşça geri itin göz küresi ve kesme göz kapaklarının üzerine steril oftalmik merhem uygulayın. </li><li> Yeri hayvanlar, sıcaklık kontrollü bir ısı pedi ve yeterli rewarming ve hareketliliği de dahil olmak üzere tam iyileşme, anneleri hayvan dönün. </li><li> Hayvanları, hareket kaybı, anormal postür veya damat yetmezliği gibi ağrı, sıkıntı veya rahatsızlık, herhangi bir işaret için her 12 saatte bir izleyin. Anestezi, enjeksiyon ve elektroporasyon Tekrarlanan mermi aynı hayvan üzerinde yapılan olmamalıdır. </li></ol> 4. Notlar <ol><li> Bu video açıklanan enjeksiyon yöntemi &#39;kör&#39; bir enjeksiyon. Albino fareler ve renkli çözeltiler (DII veya hızlı mavi eser miktarda plazmid çözüm) ile çalışırken enjeksiyon miktarı ve konumu görselleştirmek mümkündür. Ancak, pigmentli fareler suşları ile enjeksiyon konumunu doğrudan canlandırılabilen olmayacak ve dolayısıyla sözlü bir retina amaçlanan konuma ulaşmıştır ya da ne kadar bir özellikle RGC katmanı hedef pipet hareket edip etmemesi gerektiğini tarif etmek zordur. Bu nedenle, bu enjeksiyonları, retinanın hemen görüntülenmiştir olabilir çünkü ilk albino farelerde DII enjeksiyonları ile başlatmak için yeni kullanıcılara tavsiye ve RGC retina projeksiyonları ve beyin etiketleme enjeksiyon kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir. Odak enjeksiyon için% 10 DII N, N-Dimethylformamide (% 100) hazırlayın. Bir kere bu yordamı hakim kullanıcılar RGCs pigmentli farelerde açık DNA plazmid çözümleri ile sürekli hedef olmalıdır. </li><li> Bu video açıklanan enjeksiyon yöntemi retinotopy (4.6nL etiketler birkaç yüz RGCS) 14 çalışma ve konjuge fluorophores (Alexa555, 488, vb.) Toplu etiket RGCs hücrelerin küçük popülasyonlarda etiket odak DII enjeksiyonları yapmak için kullanılır. kolera toksin altbirim B # 10 yukarıdaki elektroporasyon adım hariç olmak üzere, göz-özel ayrımı çalışma. Herhangi bir çözüm P14 daha genç fareler için P14 ve 1-2uL daha yaşlı farelerin 2-3uL maksimal toplam enjeksiyon hacmi önerilir. </li><li> Pipetler enjektör pipet montaj ve ucu kırarak önce mineral yağ ile dolgu enjekte takip edilmesi gereken çözümleri ile yeniden toprakla olabilir. Pipetin ucundan yük çok viskoz ve zor genel yüksek konsantrasyonda DNA çözümleri (~ 6ug/uL) kullanarak, bu özellikle yararlıdır. </li><li> Cam pipet tıkandığında, boya (DII) çözümleri için DNA çözümleri ve etanol (% 100) için suya batırılmış bir pamuk çubukla pipet dikkatle silin. </li><li> Gözünün içine enjekte ettikten sonra, göz küresi pipet geri çekin ve tekrar enjekte etmek için ayak pedalına basın. Bu enjeksiyon işlemi sırasında ucu tıkalı olmadığını teyit etmek için. Herhangi bir çözüm reçete ise, enjeksiyon başarılı olmadığını oldukça muhtemeldir. Ancak, bu enjeksiyon başarılı olmadığını mutlak bir işareti olarak alınması gerekir. Çoklu enjeksiyon siteleri ve daha fazla sayıda hücre etiketleme isteniyorsa deneyci yine aynı göz enjekte edebilir. </li><li> Nanoinject kontrol kutusu üzerinde yavaşlatmak için, tek bir RGCs etiketleme için enjeksiyon hızını ayarlamak. Bu da cam pipetler ucu aynı anda hızlı bir şekilde göz küresi retrakte edilirken sistemin çözüm dağıtmak için bu ayarı daha fazla zaman alır gibi retina içine enjekte çözüm miktarını azaltır. </li><li> Göz hasarı (bu iyileşme birkaç gün sonra belirgin hale gelir, göz kanıtlanabilir normalden daha küçük olduğunda) çok kolay olduğundan postnatal gün Elektroporasyon 0 - 3 (P0, P3) fareler ek bakım gerektirir. Bakliyat ve gerilim uygulandığında sayısını azaltarak erken neonatal fareler için tavsiye edilir. P4 sonra, gözbebekleri elektroporasyon zarar daha esnektir. </li><li> EGFP veya RFP deneyimimizi membran hedef sürümleri (&#39;gapEGFP&#39;, 12), beyin retinofugal projeksiyonları inceleyerek için değiştirilmemiş GFP çok daha üstün . Ancak, membran hedefleyen bir değişiklik yoksun pCAG-tdTomato, aynı zamanda iyi çalışır (Şekil 1E). Buna ek olarak, dekstran konjuge floresan boyalar de yukarıda açıklanan elektroporasyon protokolünü kullanarak etiket RGCs kullanılmalıdır. </li><li> Tipik olarak, 10 enjeksiyonları 9 çift plazmid yaklaşımı ile, etiketli RGCs enjeksiyon rağmen sadece yaklaşık% 15 yol açacaktır ederetiketli olan sadece tek bir RGC sonuçlanabilir. , Bir gözü birden fazla yerde DNA enjekte veya her bir gözüne farklı floresan proteinleri kodlayan plazmid enjekte edilerek başarılı vakalarının sayısı artırılabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar RGC etiketleme elektroporasyon sonra 24 saat ile RGCs EGFP etiketleme ile P2 P25 arasında değişen, her yaşta gözlenen ve en az üç hafta sonra transfeksiyon ifade muhafaza. Floresan etiketli dendritler (Şekil 1A, B) ve tek RGCs aksonal milleri (Şekil 1F) açıkça görüntülenebilmekte ve yeniden inşa edilebilir. Apart RGCs, bu teknik, yatay hücreler, bipolar hücreleri ve çeşitli amacrine hücre alt tiplerinin (Şekil 1C) gibi diğer retinal hücre tipleri etiket için kullanılabilir Bu yöntem, SC (Şekil 1E) normal retinotopy gösterdiği görsel harita arıtma normal süre içerisinde müdahale etmiyor. Her yaştan, olguların yaklaşık% 90, pCAG-gapEGFP küçük hacimli enjeksiyon (~ 2.3-4.6nL), bir kaç RGCs (Şekil 1D) ifade yol açtı. Retina nöron etiketleme RGCs (Şekil 1A, B, D) ve amacrine gibi diğer hücre tipleri de dahil olmak üzere tek yol, pCAG-Cre ve hayvan başına pCAG LNL-gapEGFP kombinasyonu plazmid tek bir enjeksiyon kullanılarak çalışmaların yaklaşık% 15 hücreleri (Şekil 1C). <img src="/files/ftp_upload/2678/2678fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 - A, EGFP B. Örnekler düz bir montaj retinada tek retina ganglion hücrelerinin (ok başı akson işaret) doğum sonrası 14. günde (P14) etiketli P8 tek dolup taşan amacrine hücre C. Örnek D. Bir küme, sağ göz E. Dorsal ve ventral RGCs P14 az düz bir montaj retinada RGCs ve amacrine hücreler de dahil olmak üzere EGFP etiketli retinal nöronların electroporated ve EGFP ve sol göz temporal ve ventral RGCs etiketli elektrolizle edildi. P1 tdTomato ile etiketlenir. Etiketli RGCs tarafından oluşturulan hedef bölge (yıldız) topografik doğru P9 SC konumu (tüm montaj, beyaz anahat) görülebilir. RGC çardak (2-D projeksiyon) etiketli tek bir EGFP F. Örnek SC sagital kesiti (250 mikron kalınlığında) (noktalı çizgi). Görüntüleri netlik için, (D) ve (F) dönüştürülmüş olan gri tonlama ve ters için. Ölçek bar (mikron): (A) - (D), (F): 100 (E): 500

<ol>
	<li>Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+development+of+visual+maps+and+receptive+fields.">Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields.</a> Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).</li><li>McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinotopic+map+refinement+requires+spontaneous+retinal+waves+during+a+brief+critical+period+of+development.">Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development.</a> Neuron. 40, 1147-1160 (2003).</li><li>Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+and+postnatal+development+of+retinogeniculate+and+retinocollicular+projections+in+the+mouse.">Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse.</a> J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).</li><li>Jaubert-Miazza, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+composition+of+the+developing+retinogeniculate+pathway+in+the+mouse.">Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse.</a> Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+gene+function+in+the+retina.">Analysis of gene function in the retina.</a> Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode.">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T., Yuste, R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-+lapse+imaging+of+neuronal+development.">In vivo time- lapse imaging of neuronal development.</a> Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 191-204 .</li><li>Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+ocular+gene+transfer.">Nonviral ocular gene transfer.</a> Gene Ther. 12, 843-851 (2005).</li><li>Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+in+the+developing+nervous+system+with+retrovirus+expressing+modified+green+fluorescent+protein.">Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein.</a> Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Plas, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=morphogenetic+proteins,+eye+patterning,+and+retinocollicular+map+formation+in+the+mouse.">morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse.</a> J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).</li></ol>

Bu video in vivo elektroporasyon protokol gösteren floresan proteinleri kodlayan DNA yapıları ile doğum sonrası farelerde retinal nöronların tek ya da küçük kümeler etiketlenmesi ile sonuçlanır. Önceki çalışmalarda bu elektroporasyon normal RGC akson çardak arıtma karışmadı gösteren, lipofilik boyalarla RGC etiketleme kullanarak dLGN ve SC floresan etiketli RGC projeksiyonları Küçük kümeler benzer projeksiyon modelleri çoğaltılamaz. Biz, normal ve kesintiye görsel haritalar ile ?...

<table border="1"><tbody><tr><th> Malzemeler </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th></tr><tr><td> Dumont # 5 Forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Elektrik Stimülatör </td><td> Çim Aletleri </td><td> Model S4 </td></tr><tr><td> Osiloskop </td><td> Agilent </td><td> Model 54621A </td></tr><tr><td> Ses monitör </td><td> Çim Aletleri </td><td> Model AM8B </td></tr><tr><td> Çektirme </td><td> Sutter Aletleri </td><td> Model P-97 </td></tr><tr><td> Vannas Makas bir </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 14003 </td></tr><tr><td> Mikro Makas b </td><td> Ted Pella </td><td> 1347 </td></tr><tr><td> Dumont AA Forseps c </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11210-20 </td></tr><tr><td> II Sistem Nanoinject </td><td> Drummond Bilimsel </td><td> 3-000-204 </td></tr><tr><td> Cam Pipetler </td><td> Drummond Bilimsel </td><td> 3-000-203-G / X </td></tr><tr><td> Ayak pedalı </td><td> Drummond Bilimsel </td><td> 3-000-026 </td></tr><tr><td> Madeni Yağ </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M3516 </td></tr><tr><td> DII </td><td> Invitrogen </td><td> D-383 </td></tr><tr><td> N, N-Dimethylformamide </td><td> Sigma </td><td> D4551 </td></tr></tbody></table>

transfection of mouse retinal ganglion cells by in vivo electroporation

Ortabeyin RGC projeksiyonlar hedefleme ve arıtma gelişimi sırasında nöral bağlantı formunun ne kadar hassas desenler çalışmak için popüler ve güçlü bir model sistem. Farelerde, retinofugal projeksiyonlar, talamus ve Superior Colliculus (SC) Lateral genikulat Nucleus topoğrafik bir şekilde ve form göz belirli katmanlarına (dLGN) düzenlenir. Retinofugal projeksiyonlar bu kesin desen gelişimi genellikle horseradish peroksidaz 1-4 gibi floresan boyalar ve izleyiciler ile RGCs nüfusu, etiketleme çalışılmıştır. Ancak, bu yöntemler retinotopic harita oluşumunun temelinde bireysel RGC aksonal çardak morfolojisi gelişimsel değişiklikler içgörü sağlamak için çok kaba. Ayrıca RGCs genetik manipülasyon için izin vermez. Son zamanlarda, elektroporasyon 5-11 retina içine yüklü moleküllerin teslimat için mekansal ve zamansal hassas kontrolü sağlamak için etkili bir yöntem haline gelmiştir. Şu retina elektroporasyon protokolleri genetik manipülasyon için izin ve doğum sonrası farelerde RGCs, tek ya da küçük bir kümenin retinofugal projeksiyonları izleme yok. In vivo elektroporasyon postnatal RGCs transfecting etiketleme verimliliği son derece düşük olduğu için uygulanabilir bir yöntem değildir ve bu nedenle embriyonik yaşta RGC atalarıdır farklılaşması ve proliferasyonu 6 geçiren hedef gerektirir öne sürülmüştür . Bu video için in vivo elektroporasyon protokolünde hedeflenen gen teslimat, shRNA ve postnatal fare RGCs floresan dextrans açıklar. Bu teknik, dallanma, laminasyon, yenilenme ve devre geliştirme çeşitli aşamalarında sinaps oluşumu, akson retraksiyon da dahil olmak üzere sinirsel gelişimi çeşitli yönleri yer alan aday genlerin etkin bir tarama için hızlı, etkin maliyetli ve nispeten kolay bir platform sağlar. Özet olarak biz burada duyusal harita gelişiminin altında yatan moleküler mekanizmaları içine daha fazla bilgi sağlayacak değerli bir araç açıklar.

Watch this Scientific Journal Video about Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation at JoVE.com

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Bir göstermektedir.<em&gt; In vivo</em&gt; Retina ganglion hücrelerinin (RGCs) ve geniş bir yaş aralığı üzerinde postnatal farelerde diğer retinal hücre tipleri, tek ya da küçük kümeler transfecting elektroporasyon protokolü. Etiket ve genetik postnatal RGCs işlemek için yetenek<em&gt; In vivo</em&gt; Gelişim çalışmaları için güçlü bir araçtır.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

transfection-mouse-retinal-ganglion-cells-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

15.4K Görüntüleme.  Yale University. Bir göstermektedir. In vivo Retina ganglion hücrelerinin (RGCs) ve geniş bir yaş aralığı üzerinde postnatal farelerde diğer retinal hücre tipleri, tek ya da küçük kümeler transfecting elektroporasyon protokolü. Etiket ve genetik postnatal RGCs işlemek için yetenek In vivo Gelişim çalışmaları için güçlü bir araçtır.

Video: Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Genetik Etiketli Retina Ganglion Hücreleri Işık Tepkisi Record İzole Retina Hazırlık

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Nörobilim

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi<em&gt; In Vivo</em&gt; Elektroporasyon

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Topikal Transgenik Rats nesil tarafından<em&gt; Utero</em&gt; Elektroporasyon ve<em&gt; In vivo</em&gt; Biyoparlaklık Eleme

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Floresan Boyalar Yetişkin Zebra balığı Retina Ganglion Hücreleri retrograd Etiketleme

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Elektroporasyon tarafından Kemirgen Siyatik Sinir Schwann Hücreleri için Vivo Gen Transferi

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seqi

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Optik Koherens tomografi: Fare retina Ganglion hücreleri Vivo içinde görüntüleme

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Fare Retina Ganglion Hücreleri Transfeksiyon tarafından In vivo Elektroporasyon

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler