Biz J. Sedgewick gümüş taneleri görüntülerini yakalamak için konfokal mikroskop kurma yardım için teşekkür ederiz; Ulusal Araştırma Kaynakları hibe Merkezi, Ulusal Sağlık Enstitüsü, araştırma hibeleri AI48484 (ATH), AI20048 (RA) ve AI066314 (CJM) tarafından kısmen desteklenen. RR00169 (CNPRC, University of California, Davis).

Bu yöntem bildirilen araştırma <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1726">Li ve ark, Bilim 323, 1726-1729 (2009)</a> . , In situ tetramer boyama ve in situ hibridizasyon (ISTH) prosedürleri birlikte Antijen spesifik CD8 ISTH prosedürleri 4 adımda içine bölünmüş olması.:) 1 IST boyama + dokularda T hücreleri; 2) virüs-virüslü-RNA + hücreleri tespit için ISH; 3) IST-boyanan hücreler ve viral-RNA konfokal mikroskopik görüntüleme + hücreleri; 4) görüntü analizi, görüntü montajı inşaat ve haritalama tetramer + ve virüs RNA + hücreler de dahil olmak üzere. 1. IST boyama antijen-spesifik CD8 + T hücreleri, doku kesitlerinde. <ol><li> Vibratome veya neşter kullanılarak 200 um kalınlığında kesitler taze dokular kesin. </li><li> Chill vibratome steril PBS-H ile banyo ve soğuk 0-2 ° C, oldukça sarp 27 ° vibratome bıçak açısını ayarlayın. Mümkün olduğunda, doku bozulması en aza indirmek için buz üzerinde soğutulmuş tutmak. Taze dokusu da soğutulmuş bir vibratome kullanarak bölümüne kolaydır. </li><li> Doku, cerrahi makas veya küçük yaklaşık 0.5 cm genişliğinde, 0.25 cm boyunda parçalara neşter ile kesiniz. Bir tartmak tekne veya küçük bir çanak koyun ve doku parçaları ile kaplayın ~ 40 ° C erimiş% 4 PBS agaroz erimeye düşük tamponlu. Doku çanak alt ile temas halinde olduğundan emin olun. Doku parçaları yüzen eğer aşağı doğru itin. Buz üzerinde katılaşmaya. Bu genellikle 3-5 dakika sürer. </li><li> Loctite yapıştırıcı ile kaplayın vibratome doku bloğu. Sonra forseps kullanarak bir neşter ve doku etrafında agaroz Kes, tutkalla kaplı vibratome blok dikkatlice kırılgan agaroz gömülü doku transferi. Doku blok sonra doku parçası hareket ettirmeyin. Buz üzerinde yaklaşık 10 dakika kurumasını bekleyin. </li><li> Dağı doku vibratome blok ve ölü bir yavaş, ileri hız ve nispeten yüksek genlik kullanarak 200um kalınlığında kesitler doku kesmek. Hız ve genlik ayarları her vibratome ile değişir. Vibratome kullanılabilir, ya da doku kesit vibratome için uygun değildir, ince şeritler halinde bir neşter kullanılarak doku kesin. </li><li> Bölümleri içeren 1 ml soğutulmuş PBS-H 24-iyi doku kültürü plakası iyi ayarlanmış bir doku odasına bir fırça ile aktarın. Dört doku kesitlerinde kadar her doku odasına koyun. Bir lastik bant ile plaka deneysel örnek bilgileri ve güvenli kapak ile doku kültürü plaka kapağı Etiket. </li><li> Alternatif olarak, vibratome ile iyi kesmeyin dokular için, gut gibi, neşter veya ustura bıçağı ile mümkün şeritler gibi ince kesebilir. Neşter kesilmiş bölümler için başına sadece iyi bir bölümünde koyun. </li><li> Bitmiş kesme dokuların hemen sonra boyama geçin. Bölümleri her zaman sabit kadar bozulması en aza indirmek için soğutulmuş tutun. Bölümleri kurumasına izin vermeyin. Soğutulmuş steril PBS-H bölümleri tutun. </li><li> 0.5 mg / ml FITC konjuge tetramers doku bölümleri gece boyunca inkübe edin. Fare ya da çözümü engelleme 1:200 sulandırılmış bu inkübasyon ekstrasellüler epitoplar, örneğin anti-CD8 antikorlar, yönelik olmayan tavşan antikorları içerebilir. Bu ve sonraki tüm inkubasyon için ortalama 1 ml solüsyon kullanın ve bu ve 4 sonraki tüm inkubasyon ° C sallanan bir platform üzerinde plakaları ile gerçekleştirebilirsiniz. Sonraki adımda çözüm çapraz bulaşmayı önlemek için en az bir boş ayrılmış farklı deneysel örnekleri içeren bir doku odaları tutun. </li><li> Birincil inkübasyondan sonra, her biri için 20 dakika soğuk PBS-H iki katı (2X) bölümleri yıkayın. Soğutulmuş PBS-H içeren farklı bir 24-iyi doku kültürü plakası doku odalarına aktararak bunu yapın. Bir deneysel örnek diğerine içeriğini damla dikkatli olun, doku odaları taşırken. Benzer sonraki tüm inkubasyon ve yıkama için uygun bir çözüm içeren temiz bir tabak doku odalarına transfer. Bölümler doku odaları kenarlarına yapışmış alamadım emin olmak için prosedür sırasında doku odaları bölümleri izleyin. </li><li> Taze PBS ile Fix bölümleri, oda sıcaklığında 2 saat için% 4 paraformaldehid tamponlu. Soğuk PBS-H 2X her biri 5 dakika ile yıkayınız. </li><li> 1-3 gün boyunca bloke çözüm, 10.000: tavşan anti-FITC antikorlar, örneğin Biodesign1 inkübe edin. Co-etiketleme için de bu inkübasyon hücrelerarası epitoplar yönelik olmayan tavşan antikorları içerir. Bu seçenek için, gerekirse epitoplar ortaya çıkarmak ve nüfuz ve ikinci inkübasyon öncesinde hücrelerin engellemek. </li><li> Formaldehit fiksasyonu antijen alımı gerektiren intrasellüler epitoplar kullanarak antikorlar, mikrodalga fırın, 0.01m Üre kaynar 3 kez, her seferinde 10 saniye epitoplar maruz. Her ısıtma arasında 2 dakika bekleyin. Kaynar çözüm kuyular bölümleri zorlayabilir çok dikkatli olun. Bu durumda, bir boya fırçası kullanındoku odasının yanında kesitler itmek veya uygun doku odasının altına plaka kapağı. Antijen alımı antikorlar gerektirir yoksa bu adımı atlayabilirsiniz. </li><li> Önce ikinci inkübasyon, hücre içi epitoplar yönelik antikorları kullanarak, permeabolize ve PBS-H, bir saat süreyle% 0.3 triton X-100 ve% 2 normal keçi serumu içeren doku kesitlerinde hücreleri engellemek. Ardından% 0.3 triton X-100 ve% 2 normal keçi serumu içeren PBS-H kalan antikor inkubasyon gerçekleştirin. </li><li> Ikinci bir inkübasyondan sonra, birkaç saat 20 dakika PBS-H bölümleri yıkayın. Üç yıkama olmak üzere toplam iki kez tekrarlayın. Uygun floresan etiketli antikorlar ile nihai bir inkübasyon gerçekleştirin. Örneğin, keçi anti-tavşan-Cy3 ve keçi anti-fare-Alexa 488 çözüm engelleme 1:1000 her seyreltilir. 1-3 gün süreyle inkübe edin. Bölümlerde ışık besler fluorophores gibi, bundan sonra bu inkübasyon sırasında plakalar kalay folyo sarma ve ışıktan korunmalıdır tutun. </li><li> PBS-H bölümlerde birkaç saat 20 dakika boyunca yıkayın. Üç yıkama olmak üzere toplam iki kez tekrarlayın. </li><li> ISH post-fix bölümleri yere güvenli tetramers ve antikorlar için 1 saat için% 4 paraformaldehid post-fix ile birlikte IST için, daha sonra tekrar ve montaj bölümleri PBS-H ile durulayın. </li><li> Bir mikroskop lamı bölümler aktarmak için bir fırça kullanın. Kat gliserol / jelatin içeren 4mg/ml n-propil gallat veya bir lamel ile bir fluorofor koruyucu ve kapak içeren diğer montaj medya ile her bölüm. Mağaza -20 ° ışık korumalı slayt konteyner slaytlar. Doku kültürü plakaları yıkayın ve alkol ile kapaklar etiketleri kaldırmak. Plakalar yeniden mi. </li><li> Konfokal mikroskop ile boyanmış doku kesitlerinde analiz edin. Sonra ISH devam edebilirsiniz. </li></ol> 2. In situ hibridizasyon virüs bulaşmış-RNA + hücreler algılar. Bu situ hibridizasyon protokol aşağıdaki gibi 4,5 daha önce yayınlanmış protokoller güncellenmiştir: <ol><li> Re-kesim yerinde tetramer boyanan kesitler kalın 5-8-mikron kalınlığında-sectionss. <ol><li> 200 mikron kalınlığında kesitler slayt bölümünü ayırmak için 70 ° C&#39;de 5 dakika ısıtılır. </li><li> Bu bölüm, daha sonra kuru buz üzerinde OCT yerleştirilmiştir. </li><li> 8 mikron bölümleri kalınlığında kesitler Kriyostat ile kesilir ve Silanlanmış slaytlar yapıştırılır. </li><li> Slaytlar in situ hibridizasyon -80 ° C daha sonraki bir kapalı kutu içinde saklanabilir. </li></ol></li><li> In situ Hibridizasyon <ol><li> 3 dakika her biri için% 90 etanol ve DEPC arıtılmış su kaydırağı çeker doku bölümleri rehidrate. </li><li> 98 ° C su banyosunda 15 dakika süreyle 10mM sitrat tamponu (pH 6.0) ısıtarak doku bölümleri Permeabilize. </li><li> 20-30 dakika süreyle oda sıcaklığında Cool doku kesitlerinde. </li><li> 3 dakika DEPC arıtılmış su iki kez yıkayın. </li><li> 10 dakika için 0.1 M ÇAY (trietanolamin pH8.0)% 0.25 asetik anhidrit slaytlar çeker doku bölüm Acetylate. </li><li> 5 dakika için 0,1 M ÇAY (pH8.0) içine slaytlar aktarın. </li><li> Bölümlerine 35 S etiketli virüs özgü antisens probu veya duyu (HIV-1 için negatif kontrol, SIV), veya 35 G etiketli LCMV riboprobes (toplanmış hissi ve antisens) (HIV-1, SIV gibi). Melezleşme </li><li> 42 gecede hibridizasyon 5 dakika sonra 2xSSC ile iki kez yıkayın bölümleri ° C </li><li> STE bölümleri (0.5 M NaCl, 1mm EDTA, 20 mM Tris-HCL, pH 7.5) 5 dakika boyunca yıkayın. </li><li> 30 dakika 37 RNases Ste A ve T1 ° C bölümleri Digest </li><li> 2x SSC bölümleri artı 5 dakika boyunca% 50 formamid yıkayın. </li><li> Bölümleri 1x SSC 10 dakika yıkayın. </li><li> Bölümlere 0,5 x SSC 15 dakika yıkayın. </li><li> 70 bölüm, 80 ve% 100 etanol içeren 0.3 M amonyum asetat, her 5 dakika dehydrate. </li><li> Kat bölümlerinde nükleer iz emülsiyon </li><li> 1 saat boyunca karanlık bir odada kurulayın. </li><li> 4 bölümleri Açığa ° C, 11 gün (SIV) ve 3 gün (LCMV). </li><li> 3 dakika (Kodak, Kedi # 146 4593) D19 bölümleri geliştirmek, dH2O 30 saniye içinde, 4 dakika yıkayın (Kodak, Kedi # 146 4106) Rapid Fixer düzeltmek, dH2O 5 dakika x 3 kere yıkayın. </li><li> % 70,% 80 ve mutlak etanol, her biri 5 dakika dehydrate. </li><li> Floresan uyumlu Permount orta Mount slaytlar. </li></ol></li></ol> 3. Konfokal mikroskop görüntüler elde. <ol><li> Bio-Rad MRC 1000 Konfokal Mikroskop, ya da Epi2-Mavi Yansıma cihaz ile herhangi bir diğer konfokal mikroskop ile ISTH görüntüleri yakalayın. </li><li> (LCMV için), kırmızı tetramer florokrom, yeşil CD8 florokrom Epi2-522 DF32, ve gümüş tahıllar için Epi2-Mavi Yansıma (gelişmiş radioautographs ISH sinyal) 20x (SIV) veya 60x Epi1-605 kullanın. </li><li> Sırayla her alanın üç kanal 1 mikron aralıklarla Z seri görüntüler toplamak. </li><li> Her bölümün soldan görüntüler eldebir Excel dosyası, satır ve sütun göre sağa ve yukarıdan aşağıya doğru ve adı her görüntü. </li><li> Yeniden inşa montaj görüntü boşluklar önlemek için komşu görüntüleri ile bir ~% 20 üst üste her görüntüyü yakalayın. </li></ol> 4. Görüntü analizleri: montaj görüntü rekonstrüksiyonu, hücre centroid hesaplama ve Mekansal analiz. <ol><li> Konfokal Yardımcısı (Sürüm 4.02). Ile her kanal için tek bir görüntü içine Proje Z seri görüntüler. </li><li> Photoshop 7.0 Eylem yordamı kullanarak, tek bir RGB görüntü otomatik olarak üç kanal yansıtılan görüntü birleştirme. </li><li> Photoshop 7.0 katmanları birleştirilmiş görüntüler dikiş montaj bir görüntü oluşturur. </li><li> Önlisans bireysel gümüş tahıl ve tetramer hücreleri ile leke ve X atamak, Y MetaMorph (sürüm 7.1.3) veya Photoshop (yazar), SIV RNA + ve tetramer + hücreler merkezleri (uzaysal) koordinatları </li><li> Her hücre için sayısal numaraları gibi Excel dosyaları içine ağırlık merkezi veri ihracat. E: T oranları Excel dosyaları bölümünde tetramer sayıların toplamı + ve viral RNA + hücreler belirlenir. </li></ol> Mekansal, kırmızı tetramer + ve mavi SIV RNA arasındaki ilişkiler + hücrelerin kopyalama ve yapıştırma Photoshop belgeye Excel dosyaları kendi araziler yakalanır. Bunlar renk-seçerek ve kopyalama ve mavi RNA + hücreleri konumlarını bir yeni tabaka içine yapıştırarak, denk böylece ızgaraları hizalamak ve ölçek için bir katman donukluk, ve sonra ızgaraları hizalamak için kullanılan atarak katmanı, pozisyonlarını azaltarak sonra tetramer + ve viral RNA + hücreleri düzleştirilmiş görüntü ortaya çıkacak. 5. Ek Notlar Bulaşıcı doku kesme Eğer: Bir BSL2.5 laboratuarda çalışın. Tıraş bıçakları ile özel önlemler alın. Jilet bir forseps ile vibratome bıçak monte içine koyun. Bir forseps ile bıçak koyamazsınız, o zaman banyo için doku eklemek için önce koymak ve bıçak yerine geçmez. Bitmiş keserken bıçak, bir forseps ile çıkarın. Kaldırmadan önce, Sprey ile% 70 EtOH veya DMQ bıçak. Her zaman olduğu gibi, bir dikiş iğnesi konteyner bıçaklar atmayın. Dış eldiven değiştirme ya da doku veya tank içinde kirlenmiş PBS ile her temastan sonra dezenfektan durulayın. Bittiğinde, bulaşıcı bir malzeme ile çalışıyorsanız, tank içinde PBS DMQ dezenfektan ve kaldırılması için önce bir kaç dakika bekletin. Boşa dekontamine PBS atın. Sonra tuz ve dezenfektan kaldırmak için tankı su ile durulayın. DMQ ile temiz bir çalışma alanı ve gereçleri. Eşyaları su ile durulayın. Biotinlenmiş MHC monomerlerin tetramers olun: Gibi moleküller biotinlenmiş MHC sınıf Edinme HLA-A * 0201 / B 2 m / ya Gag (SLYNTVATL), Pol (ILKEPVHGV) Beckman Coulter veya alakasız MART peptid (ELAGIGILTV) peptitler ile üretilen peptid molekülleri. Biotinlenmiş HLA-A * 0301 / ya Gag (KIRLRPGGK) veya NIAID tetramer tesiste Nef (QVPLRPMTYK) ile üretilen B 2 m / peptid molekülleri. Tetramers 6 alikotları etiketli FITC ekleyerek oluşturulur biotinlenmiş Mamu ExtraAvidin (Sigma) * 01 / B 2 m / 8 saat boyunca son molar oranı 4.5:1 bir peptit monomerleri. Extravidin ekleyerek arkasındaki mantığı yavaş yavaş erken zaman noktalarında sırasında Extravidin bağlı dört biotin siteleri alır eklediğiniz garanti monomer bir overabundance olmasıdır. ExtrAvidin bağlı her 4 siteleri olmayacağını bir şans daha az monomer sol ve daha var, çünkü daha sonra tepki olarak, bu süreci daha az verimli. Bir kerede tüm ExtrAvidin eklediyseniz tepki, daha az verimli olacak ve daha Extravidin molekülleri sadece 2 ya da 3 monomerlerin bağlı olurdu.

<ol>
	<li>Altman, J. D., Moss, P. A. H., Goulder, P. J. R., Barouch, D. H., McHeyzer-Williams, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274, 94-96 (1996).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+Edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting Edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> Journal of Immunology. 165, 617-61 (2000).</li><li>Qingsheng, L. i., Skinner, P. J., Ha, S. -. J., Duan, L., Mattila, T., Hage, A., White, C., Barber, D. L., O'mara, L., Southern, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+antigen-specific+and+infected+cells+in+situ+predicts+outcome+in+early+viral+infection.">Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcome in early viral infection.</a> Science. 323, 1726-1729 (2008).</li><li>Haase, T., Haase, K., Zupancic, M., Sedgewick, G., Faust, R. A., Melroe, H., Cavert, W., Gebhard, K., Staskus, K., Zhang, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perelson+Quantitative+Image+Analysis+of+HIV-1+Infection+in+Lymphoid+Tissue.">Perelson Quantitative Image Analysis of HIV-1 Infection in Lymphoid Tissue.</a> Science. 274, 985-989 (1996).</li><li>Li, Q., Duan, L., Estes, J. D., Ma, Z. M., Rourke, T., Wang, Y., Reilly, C., Carlis, J., Miller, C. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peak+SIV+replication+in+resting+memory+CD4+T+cells+depletes+gut+lamina+propria+CD4+T+cells.">Peak SIV replication in resting memory CD4 T cells depletes gut lamina propria CD4 T cells.</a> Nature. 434, 1148-1152 (2005).</li><li>Li, Q. i. n. g. s. h. e. n. g., Estes, J. a. c. o. b. D., Schlievert, P. a. t. r. i. c. k. M., Duan, L. i. j. i. e., Brosnahan, A. m. a. n. d. a. J., Southern, P. e. t. e. r. J., Reilly, C. a. v. a. n. S., Peterson, M. a. r. n. i. e. L., Schultz-Darken, N. a. n. c. y., Brunner, K. e. v. i. n. G., Nephew, K. a. r. l. a. R., Pambuccian, S. t. e. f. a. n., Lifson, J. e. f. f. r. e. y. D., &amp;amp, J. o. h. n. V. C. a. r. l. i. s., Haase, A. s. h. l. e. y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+monolaurate+prevents+mucosal+SIV+transmission.">Glycerol monolaurate prevents mucosal SIV transmission.</a> Nature. , (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Virüs RNA, bu raporda virüsle enfekte olan hücreleri için bir belirteç olarak kullanılan olduğundan, hibridizasyon önce tüm reaktifler RNAase arındırılmış olmalıdır. In situ hibridizasyon prosedürü burada açıklanan floresan in situ tetramer boyama sinyal korumak için modifiye edilmiştir. In situ hibridizasyon tarafından tespit edilen virüs bulaşmış hücrelerin radioautographic sinyal tek-hücre çapı hakkında bir derinlikte olduğundan, in situ tetramer boyanması için kullanılan kalın bölümlerde 5-8 mikron kalınlığında bölüme recut olmak zorunda. Burada anlatılan roman tekniği, in situ tetramers ve in situ hibridizasyon (ISTH) birleştirerek Bu virüse özgül CD8 + T hücreleri ve virüs ile enfekte hedef hücreleri olan uzaysal ilişkisi eş zamanlı görüntüleme, haritalama ve analiz sağlayan. Bu yöntem, CD8 + T hücre tabanlı aşı değerlendirmek için uygulanan ve diğer non-virüs patojen ve konak etkileşimleri olabilir. Görüntü analiz yöntemi, burada açıklanan in situ etkileşen herhangi iki hücre popülasyonlarının mekansal ilişkileri incelemek için de adapte edilebilir, biz son zamanlarda insan dışı primat maymun bağışıklık eksikliği modeli HIV-1 cinsel yolla bulaşmasını eğitim centroid haritalama yöntemi kullanılır, örneğin rhesus, virüs enfeksiyonu 6 makakların

Çözümler ve Reaktifler: <ul><li> PBS-H Fosfat RNASes etkisizleştirmek için tuzlu su içeren heparin (100ug/ml veya 18.7U/ml) tamponlu </li><li> Heparin içeren RPMI doku kültür ortamı (100ug/ml veya 18.7U/ml) RNASes inhibe </li><li> % 4 PBS düşük erime agaroz </li><li> PBS% 2 normal keçi serumu ile (veya fluorofor konjuge antikorların yapıldığı türler serum). </li><li> PBS% 2 normal keçi serumu ve% 0.3 Triton X-100 </li><li> MHC sınıf FITC konjuge tetramers </li><li> Anti-FITC antikorlar, örneğin Biodesign tavşan anti-FITC </li><li> Son derece birden fazla etiketleme, örneğin keçi anti-tavşan-Cy3 ile kullanmak için diğer türler IgG adsorbe çapraz fluorofor konjuge anti-tavşan IgG </li><li> Son derece birden fazla etiketleme ile kullanmak için diğer türler IgG adsorbe çapraz fluorofor konjuge anti-fare IgG </li><li> Taze PBS% 4 paraformaldehid tamponlu </li><li> 0.01m Üre </li><li> Gliserol / jelatin içeren 4mg/ml n-propil gallat </li></ul> Özel ekipman <ul><li> Vibratome </li><li> Skalpel </li><li> Tıraş bıçağı </li><li> Cerrahi makas </li><li> Loctite Hızlı Kurulum Hızlı Yapıştırıcı (ürün # 46.551) </li><li> Forseps </li><li> # 2 deve saç boya fırçaları. Jilet ile istenilen kalınlıkta kırpabilir </li><li> 24-düz dipli doku kültürü tabak örneğin Falcon katalog # 353.226 </li><li> Doku odaları </li><li> Kalay folyo </li><li> Karton slayt klasör örneğin Fisher katalog # 12-587-10 </li><li> Konfokal Mikroskop </li></ul> IST Reaktifler Hızlı Başvuru PBS-H (fosfat tamponlu salin ile heparin) <ul><li> 450 ml 1X PBS </li><li> 50 ml 1X PBS + 10X heparin </li></ul> 1x PBS + 10X heparin <ul><li> 500 ml 1X PBS </li><li> 500 mg heparin toz (kuru kimyasal depolama raf bulundu) </li></ul> PBS-H / 2% NGS (normal keçi serumu) <ul><li> 49 ml Falcon tüp PBS-H </li><li> 1 ml NGS (-20 dondurucuda 1 ml alikotları bulundu) </li></ul> PBS-H / 2% NGS /% 0.3 Triton X-100 <ul><li> Falcon tüp içerisinde 49 ml PBS-H /% 0.3 Triton X-100 </li><li> 1 ml NGS (-20 dondurucuda 1 ml alikotları bulundu) </li></ul> PBS-H /% 0.3 Triton X-100 <ul><li> 500 ml PBS-H </li><li> 1,5 ml Triton X-100 (kuru kimyasal depolama raflarda bulunan kalın bir sıvı) </li></ul> % 4 LMP Agaroz <ul><li> 2 g LMP agaroz tozu </li><li> 50 ml PBS </li><li> , Tozu eriyene kadar karıştırılır, mikrodalga kadar çalkalayın. </li></ul> (N-propil galate jelatin gliserol GG-NPG <ul><li> Eritmek için 50 derece su banyosunda gliserol jelatin bir şişe yerleştirin. </li><li> 0.06 g (Terris raf bulundu) propil galate ekleyin, iyice çalkalayınız. </li><li> Eriyene kadar ara sıra çalkalayarak su banyosunda tutun. </li><li> 1 ml tüpler (kahverengi tüpler) içine kısım </li></ul> 4% paraformaldehid <ul><li> 4 g paraformaldehid toz (kuru kimyasal depolama raflarda bulunan) </li><li> Ml Mezür PBS-H, yaklaşık 10 koyun pf tozu ekleyin </li><li> Hacmi yaklaşık 70 ml ulaşana kadar biraz su ekleyin. </li><li> NaOH bir damlalık ekleyin. </li><li> Çözünmüş (genellikle yaklaşık 20-30 dakika) kadar karıştırın. </li><li> PH 7-8 arasında ulaşıncaya kadar HCl ekleyin. </li><li> 100 ml su ile hacim kazandırın. </li></ul> Üre 0.01 M <ul><li> 0.3 g üre (kuru kimyasal depolama raflarda bulunan) </li><li> 500 ml su </li></ul>

a technique to simultaneously visualize virus-specific cd8+ t cells and virus-infected cells in situ

Sayıları ve konumları virüs spesifik CD8 + T hücreleri enfekte hücrenin hedeflerine sayıları ve yerleri göreli açıklık kronik kalıcı enfeksiyonlar bu aralıktaki sonuçlarının belirlenmesinde kritik olduğu düşünülmektedir. Biz burada bir bağışıklık efektör (E) virüs-spesifik CD8 + virüse özgül CD8 + T hücreleri tespit etmek yerinde tetramer (IST) boyama birleştiren T hücreleri ve enfekte hedefleri (T) ve içinde in situ arasında mekansal ve kantitatif ilişkileri değerlendirmek için yöntemi tarif hibridizasyon (ISH), bağışıklık sistemi ve enfeksiyon arasındaki savaş gerçekleşir dokularda viral RNA + hücreleri algılamak için. T oranları: IST boyama ve ISH, kısaltılmış ISTH kombinasyonu immün efektör hücreleri ve hedefleri, ve E facile belirlenmesi yerleri görüntüleme ve haritalama sağlar. Bu parametreler sırayla sonra mekansal yakınlığı arasındaki ilişkileri belirlemek için kullanılır, ve erken enfeksiyon sonuçlarını tahmin immün yanıtın zamanlaması ve büyüklüğü olabilir

Watch this Scientific Journal Video about A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ at JoVE.com

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Yerinde tetramer boyama in situ hibridizasyon (ISTH) birleştirerek bir tekniği görselleştirme, haritalama ve analiz, virüs bulaşmış hedefleri virüs spesifik CD8 + T hücreleri mekansal yakınlığı ve bu bağışıklık etkileyiciler ve hedefleri arasındaki nicel ilişkilerin belirlenmesi sağlar enfeksiyon sonuçlarını.

Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

a-technique-to-simultaneously-visualize-virus-specific-cd8-t-cells

Research

JoVE Journal

Biology

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

12.0K Görüntüleme.  University of Minnesota. Yerinde tetramer boyama in situ hibridizasyon (ISTH) birleştirerek bir tekniği görselleştirme, haritalama ve analiz, virüs bulaşmış hedefleri virüs spesifik CD8 + T hücreleri mekansal yakınlığı ve bu bağışıklık etkileyiciler ve hedefleri arasındaki nicel ilişkilerin belirlenmesi sağlar enfeksiyon sonuçlarını.

Video: A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

Regulatory T cells: Therapeutic Potential for Treating Transplant Rejection and Type I Diabetes

Düzenleyici T hücreleri: Nakli Reddetme ve Tip I Diyabet Tedavisinde Terapötik Potansiyeli

Biyoloji

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

Kemik İliği Hematopoetik Hücreler, Homing

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

Yapışkan ve Sigara yapışık Memeli Hücre yerinde Subselüler Fraksiyonu

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Kapak Endotel Hücreleri İzolasyon

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Clonogenic Testi: yapışkan Hücreler

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated precursors. Researchers have employed various methods of lineage labeling, such as DiI labeling1 and pressure injection of traceable enzymes2 to ascertain cell fate at later stages of development in model systems. The first fate maps in zebrafish (Danio rerio) were assembled by iontophoretic injection of fluorescent dyes, such as rhodamine dextran, into single cells in discrete regions of the embryo and tracing the labeled cell's fate over time3-5. While effective, these methods are technically demanding and require specialized equipment not commonly found in zebrafish labs. Recently, photoconvertable fluorescent proteins, such as Eos and Kaede, which irreversibly switch from green to red fluorescence when exposed to ultraviolet light, are seeing increased use in zebrafish6-8. The optical clarity of the zebrafish embryo and the relative ease of transgenesis have made these particularily attractive tools for lineage labeling and to observe the migration of cells in vivo7. Despite their utility, these proteins have some disadvantages compared to dye-mediated lineage labeling methods. The most crucial is the difficulty we have found in obtaining high 3-D resolution during photoconversion of these proteins. In this light, perhaps the best combination of resolution and ease of use for lineage labeling in zebrafish makes use of caged fluorescein dextran, a fluorescent dye that is bound to a quenching group that masks its fluorescence9. The dye can then be "uncaged" (released from the quenching group) within a specific cell using UV light from a laser or mercury lamp, allowing visualization of its fluorescence or immunodetection. Unlike iontophoretic methods, caged fluorescein can be injected with standard injection apparatuses and uncaged with an epifluorescence microscope equipped with a pinhole10. In addition, antibodies against fluorescein detect only the uncaged form, and the epitope survives fixation well11. Finally, caged fluorescein can be activated with very high 3-D resolution, especially if two-photon microscopy is employed 12,13. This protocol describes a method of lineage labeling by caged fluorescein and laser uncaging. Subsequenctly, uncaged fluorescein is detected simultaneously with other epitopes such as GFP by labeling with antibodies.

This protocol delineates a way to label and trace the fate of small groups of cells zebrafish embryos using UV-uncaging of caged fluorescein, followed by whole mount immunolabeling to amplify the signal from the uncaged fluorescein.

Lazer Uncagable Floresein Dextran&#39;ın Zebra balığı Hücre Lineage Etiketleme

A central problem in developmental biology is to deduce the origin of the myriad cell types present in vertebrates as they arise from undifferentiated ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Otofajinin Kas Hücrelerinde Yerinde İmmunofloresan Boyanması

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...