Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü 1K22AI097291-01 hibe tarafından desteklenen ve Ödül Numarası UL1TR000433 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Translasyonel Bilimler ilerlemek için Ulusal Merkezi tarafından yapıldı. Biz de aşı nanopartiküller ve OT-I / Luc transgenik fareler üzerinde ilk çalışmaları katkılarından dolayı Fred Hutchinson Kanser Merkezi&#39;nde MİT ve Prof. Matthias Stephan Prof. Darrell Irvine kabul etmiş sayılırsınız.

Bu protokol açıklanan tüm deneyler belirlenen politika ve kurallarına göre Kullanımı ve Michigan Üniversitesi&#39;nde Hayvanlarının Bakımı (UCUCA) Üniversite Komitesi tarafından onaylandı ve yapıldı. 1. Sentezi ve Karakterizasyonu Protein ICMVs Antijen ve Adjuvan Moleküller ile Co-yüklü <ol><li> Karışım 1: 1,2-dioleoil-sn--glisero-3-fosfokolin (DOPC) ve 1,2-dioleoil-sn--glisero-3-phosphoethanolamine- N 1 mol oranı - [4- (p -maleimidophenyl) bütiramit] kloroform (MPB), yığın başına 1.26 umol toplam lipit miktarı tutulması (örneğin, DOPC, 500 ug ve MPB 630 ug) 20 ml bir cam şişe (çap = 28 mm, yükseklik = 61 mm). </li><li> Istenilen konsantrasyonda lipit solüsyonuna, örneğin monofosforil lipid A (MPLA) ya da lipofilik boyalar (örneğin, yaptığımız) gibi lipofilik ilaçlar, ekleyin. İyice ekstra kuru nitroge ile tasfiye ederek organik çözücü kaldırmakn gaz ve vakum O / N altında örnekler yerleştirerek. </li><li> Suda çözünür ilaçlar (örneğin, protein antijenleri) ihtiva eden 10 mM Bis-Tris propan (BTP, pH 7.0), 200 ul ekleyerek lipid filminin hidratı. 10 saniye oda sıcaklığında 1 saat süre ile, her 10 dakika vorteksleyin. </li><li> Cam içeriği, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine ufak şişe yer örnekleri, bir buz-su banyosu içinde, 125 W / 20 kHz prob ucu sonikatör ayarı% 40 yoğunluk kullanılarak 5 dakika boyunca sürekli olarak sonikasyon aktarın. </li><li> Her parti (çalışma konsantrasyonu 2.4 mM), girdap ve masa mikro santrifüj kullanılarak kısa bir süre santrifüje 150 mM ditiyotreitol (DTT), 4 ul ekle. </li><li> 200 mM CaCI2 40 ul ekleyin ve pipet (çalışma konsantrasyonu 33 mM) ile karıştırın. DTT ile lipit katman MPB-ihtiva eden çapraz bağlanmasını sağlamak için 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Santrifüj numuneleri 15 dakika için 20,000 x g&#39;de, ddiH 2 O 200 ul supernatant, ve tekrar süspansiyon kaldırma </li><li> Adımı yineleyin 1.7 ve santrifüj yeniden ikinci ddiH 2 O yıkamadan sonra süpernatanından CaCl 2, reaksiyona girmemiş DTT ve kapsüllenmemiş kargo malzemelerini çıkarmak için. </li><li> DdiH 2 O 2 kDa polietilen glikol-tiol (PEG-SH), 10 mg / ml hazırlayın PEG-SH çözeltisi 100 ul her bir ICMV örnek yeniden süspanse edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> İki ddiH 2 O yıkar (adım 1.7) gerçekleştirin ve 4 ° C&#39;de son ICMV PBS pelet ve mağaza tekrar süspansiyon. Parçacıklar uzun süreli depolamadan sonra dibe olabilir önce ICMV süspansiyonu karıştırmak, kullanmak için. </li><li> Partiküllerin karakterizasyonu için, her partiden ICMVs küçük bir kısım (~% 10) kaldırıp ddiH 2 O, 1 ml bir toplam hacim içinde ayrı ayrı seyreltik Bir Zetasizer hücresi ve ölçü parçacık boyutu, polidispersite indeksi ve DLS ve (imalatçının protokolüne göre) zeta potansiyeli ölçüm sistemi kullanılarak numunelerin zeta potansiyeli tek bir örnek yerleştirin. </li></ol> Ve Lenf Nodu Boşaltma 2. Sınav Konfokal Mikroskopi ile ICMVs Floresan-etiketli <ol><li> ICMVs hazırlanması florofor-etiketli antijen ve lipofilik bir floresan boya ile yüklenir <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak, ovalbümin Alexa Fluor 555-süksinimidil ester ile reaksiyona sokulmaktadır gibi florofor-etiketli protein, hazırlayın. </li><li> Lipid kabuk fluorofor ile etiketlenmiş ICMVs hazırlamak için, lipofilik floresan boya (örneğin, 1,1-dioktadesil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, () yaptı) (lipit filmin hazırlanması sırasında Adım ekleme 1.2)% 0.05 molar lipid miktarda. Lipid filmi hidrasyon (Basamak 1.3), florofor etiketli antijen ihtiva eden kullanımı tamponu ve tam ICMV sentezi için adımlar 1,4-1,11 belirtildiği gibi. </li></ol></li><li> Kuyruk dibinde nanopartiküllerin deri altı uygulama <ol><li> Indüksiyon odasında u ile donatılmış kontrollü bir akış buharlaştırıcı kullanılarak fare anestezisiIACUC göre% 3 izofluran ve oksijen akışının 1.5 L / dak tilizing hayvan protokolü onayladı. Fare bilinçsiz sonra, enjeksiyon yerinde optimal erişime izin ve hayvan rahatsızlığı en aza indirmek için kapalı giyen anestezi hızlı bir şekilde önce aşağıdaki adımları uygulayın. Alternatif olarak, anestezi korumak için uygun bir uydurma burun konisi kullanın. Farenin uzunluğu 5 dakika için anestezi uygulanır ise, işlemden sonra tahrişi en aza indirgemek için gerekli olan göz madeni uygulanır. </li><li> Sterilize ve deri altına iğne görselleştirmek için kullanılabilir görebilir deri, küçük bir yama ortaya çıkarmak için kürk Bölüm ıslak saç ıslak% 70 etanol ile kuyruğun tabanına püskürtün. </li><li> Istenen antijen miktarı ve PBS içinde aşı dozu, 100 ul başına yardımcı madde ihtiva eden parçacık püskürtme süspansiyonu hazırlayın (örneğin, 10 ug OVA ve enjeksiyon doz 100 ul başına 0,3 ug MPLA son 6,9 kullanılmıştır). </li><li> Parçacık süspansiyon int Beraberlikoa bir 27-29 G iğne ile şırınga ve kuyruk dibinde iğneyi (~ çizgisi 5 mm) eğim ile yukarı bakacak ve partikül süspansiyonu 22 50 ul enjekte edilir. </li><li> Aşırı geri akışı önlemek ve iğneyi çekin eşitlemek için baskı için birkaç saniye bekleyin. Her iki drenaj kasık LN hedef kuyruk tabanının diğer tarafta enjeksiyon tekrarlayın. </li></ol></li><li> Konfokal mikroskobu ile lenf nodu cryosections hazırlanması ve incelenmesi. <ol><li> Bir IACUC hayvan protokolü onayladı göre uyarılan pnömotoraks ardından CO 2 boğulma ile fare, Euthanize. Bedoya 23 gösterilen protokole uygun olarak kasık lenf nodları ekstrakte edin ve 4 ° C&#39;de PBS içinde 1 ml dokuları yerleştirerek kan yıkayın. </li><li> Dokularıyla dokulardan PBS emilmesini ve doku cryomolds doku yer (10 x 10 x 5 mm3) Ekim ortamı 24 donan üstüne önceden doldurulmuş. Yapış tis dondurmak30 saniye için sıvı azot içinde blok dava. Seçenek olarak ise, 30 dakika boyunca kuru buz üzerinde doku bloğu yerleştirin. ° C derin dondurucuda -80 dondurulmuş doku saklayın. </li><li> -20 ° C&#39;de 24 ayarlanmış bir kriyostat 5-10 mikron kalınlığında doku bölümleri kesin. </li><li> Gerekirse, immunofloresan etiketleme gerçekleştirmek ve daha önce 24 gösterildiği gibi konfokal mikroskobu ile doku inceleyin. </li></ol></li></ol> Antijen-spesifik 3. İzleme Genişleme, Tüm Hayvan Görüntüleme ile Nanopartikül Aşı sonrası CD8 + T Hücreleri Lusiferaz-ifade <ol><li> OT-I / Luc transgenik farelerden OVA257-264-spesifik, lusiferaz sentezleyen CD8 + T hücrelerinin izolasyonu <ol><li> CO 2 boğulma ile bir OT-I / Luc transgenik fare Euthanize ve bir IACUC göre pnömotoraks hayvan protokolü onayladı neden olur. Pankreas 23 doku ayrılmakta dikkatle periton boşluğuna erişim ve steril bir şekilde dalak Hasat vedoku kültürü kaputu transferi için 4 ° C PBS +% 2 FBS içinde 5 ml bir yer. </li><li> (Bir seferde 3 dalak kadar) 50 ml konik santrifüj tüpü üzerinde 70 mikron naylon süzgeç üzerinde dalak yerleştirin. 3 ml şırınga bir dalgıç kullanarak, süzgeç vasıtasıyla hücrelere eziyet. </li><li> Piston ve PBS +% 2 FBS ile süzgeç yıkayın ve atın. 300 x g, 10 dakika boyunca, 10 ml / 50 ml tüp içinde dalak toplam hacmi getirmek hemositometre ile saymak için hücre süspansiyonu küçük bir örnek alır ve santrifüjlenir. </li><li> Ticari olarak mevcut olan manyetik negatif seçim seti kullanılarak, imalatçının talimatları izlenerek CD8 + T hücre popülasyonu izole eder. </li><li> Hücrelerin PBS ile yıkandıktan sonra, izole edilmiş CD8 + T hücrelerinin sayısı. Izole edilmiş CD8 + T hücrelerinin saflığını değerlendirmek için, daha sonra αCD8 APC antikorun 20 ul, 10 dakika süre ile, fare CD16 / 32 antikoru (0.025 mg / ml) 20 ul ~ 20.000-30.000 hücrelerin inkübe (0.005 mg / ml) ve 30 dakika boyunca inkübe edin. PeBSA a / h PBS içinde 4 ° C&#39;de +% 1 Bütün inkübasyonlar, rform. Akım sitometri analizi 25 gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Genişleme sonrası aşılama evlatlık izole CD8 + T hücrelerinin transferi ve görselleştirme <ol><li> Intravenöz kuyruk damarından 22 (gün -1) ile PBS içinde 200 ul hacim içinde 1-10 x 10 5 hücre uygulanmasıyla saf C57BL / 6 farelerine izole OT-I / Luc CD8 + T hücrelerinin adoptif transferini gerçekleştirir. C57BL / 6 farelerde bu kürk ve siyah deri yamaları dikkate alındığında bioluminescent sinyal engel olabilir, traş albino C57BL / 6 fareler bu çalışmalar için idealdir. </li><li> Daha önce (bölüm 2.2) açıklandığı gibi bir gün (gün 0) sonra aşı yönetmek. </li><li> Intraperitonal PBS 300 ul hacim içinde kg fare vücut ağırlığı başına luciferase 150 mg uygulayın. 10 dakika sonra, (aşama 2.2.1 gibi) izofluran fareler anestezi ve 5-10 dakika w biyoışıldama sinyali alarak OT-I / Luc CD8 + T hücreleri görselleştirmekBir bütün hayvan görüntüleme sistemi i (IVIS, detaylı talimat Wilson 26 bakınız). Uzunlamasına çalışmalar için gerekli tekrarlayın. </li></ol></li></ol> Analiz PBMC&#39;ler 4. Peptid-MHC tetramer boyama antijene özgü CD8 + T hücreleri, Not: Aşağıdaki protokol prosedürü adoptif adoptif transfer olmadan OT-I / Luc CD8 + T hücreleri ya da C57BL / 6 fareler ile transfer C57BL / 6 fareleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. <ol><li> Aşılamadan sonra, arzu edilen bir zaman noktasında, K 2 EDTA ile kaplanmış bir tüp içine submandibuler kanama tekniği 27 vasıtasıyla farelerden kan yaklaşık 100 ul (4-6 damla) toplamak ve pıhtılaşmayı önlemek için birkaç kez ters çevirin. </li><li> Bir mikrosantrifüj tüpüne kan 100 ul aktarma liziz tamponu için 1 ml ekleyin ve kırmızı kan hücrelerini (RBC) ortadan kaldırmak amacıyla 2 dakika ila 3 inkübe edin. Santrifüj örnekleri 1,500 xg&#39;de 5 dakika boyunca ve supernatant çıkarın. Yine de pelet halinde(RBCs eksik kaldırılmasını belirtir) kırmızı ppears, lizis tamponu kısa bir inkübasyon (&lt;1 dakika) ile parçalama adımı tekrarlayın. </li><li> 5 dakika boyunca 1,500 x g&#39;de 1 (/ hac BSA, PBS +% 1) FACS tamponu ilave edildi ve santrifüj ile geriye kalan PBMC&#39;ler yıkayın. </li><li> Aspire süpernatan ve spesifik olmayan ve FcR aracılı antikor engellemek için fare CD16 / 32 antikorunun 20 ul örnek (0.025 mg / ml) yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 4 ml yuvarlak dipli FACS tüpler içine mikrosantrifüj tüpler hücreleri aktarın. Her bir örnek için, üreticinin spesifikasyonlarına göre OVA Tetramer-SIINFEKL-PE çözelti B, H-2K 20 ul eklenir ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Antikor kokteyli hazırlayın (örneğin, αCD8-APC, αCD44-FITC ve αCD62L-PECy7 antikorlar (sırasıyla 0.005, 0.005, ve 0.002 mg / ml konsantrasyon)). Her bir deney örneği 20 ul ekleyin ve buz üzerinde 20 dakika inkübe edilir. La tarafından tek fluorofor kontrolleri hazırlayınYukarıda belirtilen konsantrasyonda her florofor ile işaretlenmiş tetramer veya antikor ile hücreler Beling. </li><li> FACS tamponu ile 2 kez yıkanır ve DAPI 2 ug / ml ihtiva eden FACS tamponu nihai pelletini. analizi (ayrıntılar ve örnekler Scheffold 25 bulunabilir) sitometri hücreleri artık akışı için hazırız. </li></ol>

Perkin Elmer, bu makalenin yayınlanması sırasında katlanılan üretim maliyeti sağladı.

Bu makalede sağlanan protokol ICMVs olarak adlandırılan sentezi ve yeni bir lipid bazlı nanopartikül sisteminin karakterizasyonu açıklanmaktadır, ve antijene spesifik CD8 + T hücresi tepkilerini indükleme nanopartikül bazlı aşı formülasyonlarının etkinliğinin doğrulanması için bir işlem sağlar. ICMV sentezi genellikle kaybı ile sonuçlanan, tipik olarak hazırlanması için, organik çözücüler gerektiren diğer yaygın olarak kullanılan polimer nano partikül sistemleri (örneğin, p...

Geleneksel aşı geliştirme ağırlıklı deneme-yanılma ampirik bir yaklaşım uygulamaktadır. Ancak, biyomalzeme ve immün aktivasyon moleküler belirleyicileri keşif geniş bir yelpazeye son gelişme ile, bu rasyonel patojenlerin 1,2 türetilen biyofiziksel ve biyokimyasal ipuçları ile aşı formülasyonları tasarlamak artık mümkün. Özellikle, çeşitli parçacık halinde ilaç iletim platformları, lenf içinde bulunan bozunmadan, aşı bileşenleri korumak ve antijen sağlayan hücrelere (APC) kendi eş sevkini iyileştirmek, bu alt birim antijen ve immünostimülatör maddelerle birlikte yüklenebilecek aşı taşıyıcıları olarak incelenmiştir düğümler (LN), böylece bağışıklık uyarımı ve aktivasyonunu 3-5 maksimize. Daha önce güçlü bir aşı platfor olarak gösterilmiştir, bu yazıda, bir &quot;patojen taklit eden&quot; nanopartikül sisteminin sentezini tarif adlandırılan interbilayer-çapraz bağlanmış çok-lamelli veziküller (ICMVs),Sağlam sitotoksik T lenfosit (CTL) ve sistemik ve mukoza dokusu bölümlerinde 6-9 hem de humoral bağışıklık karşılıklarının ortaya çıkartıldığını m. Özellikle, ICMVs ile aşılama büyük oranda geleneksel yardımcı maddeler (örneğin, şap ve Montanide) 7 ile aşılama ile karşılaştırıldığında, bir sıtma antijene karşı serum IgG düzeyleri gelişmiş ve aynı zamanda tümör hücreleri ve fareler 9 viral meydan modellerine karşı güçlü CTL yanıtları ortaya başararak. Burada bir model aşı nanoparçacık sistemi olarak ICMVs kullanarak, biz partikül büyüklüğü ve zeta potansiyeli ölçümleri ve boşaltma LN parçacık ticareti izleme cryosectioned dokuların 7 konfokal görüntüleme kullanan (dLNs dahil) aşı nano-formülasyonlar karakterizasyonu için yöntemler açıklanmaktadır. Buna ek olarak, lusiferaz sentezleyen bir antijen-özgül CD8 + T hücrelerinin 9,10 adoptif nakli sonrasında farelerde CTL yanıtlarının genişleme analiz bir bütün hayvan görüntüleme tabanlı bir yöntem sunulmaktadır. Son olarak biz denanopartiküller 6,9 ile aşılanmış farelerde endojen T hücresi tepkilerinin uzunlamasına ölçümü için periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC), çizici tetramer boyaması. ICMVs daha sonra kimyasal olarak çapraz bağlayıcı ditiyol 6 lipid tabakaları içinde çapraz bağlama maleimid-işlevselleştirilmiş fosfolipid baş grupları tarafından stabilize edilir çok katmanlı yapılar, içine basit lipozomlar kontrol füzyon tarafından sentezlenen bir lipid bazlı nanopartikül formülasyonu vardır. ICMVs sentez edildikten sonra, nano partiküllerin küçük bir kısmı parçacık boyutuna ve zeta potansiyeli, dinamik ışık saçılımı (DLS) sistemi ve zeta potansiyeli analizcisi ile (parçacıkların, yani, yüzey yükü) belirlemek için kullanılabilir. Difüzyon katsayısı belirlenmesi ve parçacıkların 11 hidrodinamik boyutu izin parçacık süspansiyonları ışık saçılması DLS ölçer değişiklikler. Toplu sentezine toplu tutarlı parçacık büyüklüğü sağlanması önemlidirparçacık boyutu yana APCler 12,13 tarafından dLNs ve daha sonra hücre içine kabul edilmesine aşı parçacıkların lenf boşaltma etkileyen ana faktörlerden biridir. Buna ek olarak, zeta potansiyeli partikülleri ve partikül yüzey yükünün 11 elektroforetik hareketlilik belirlenmesini sağlayan bir elektrik akımı uygulanır parçacık hızını ölçerek elde edilebilir. Parçacıkların yüzey yükü depolama sırasında ve in vivo uygulama 14,15 sonra parçacık dağılım üzerinde doğrudan etkisi vardır koloidal istikrarı belirler çünkü parçacıkların tutarlı zeta potansiyeli değerlerin sağlanmasında çok önemlidir. DLNs partikül yerelleştirme izlemek amacıyla, ICMVs lipofilik boyalar ve kovalent etiketli antijenler de dahil olmak üzere istenilen floroforlar ile etiketli olabilir. Aşılamadan sonra, fareler, dLNs rezeke, çeşitli zaman noktalarında ötenazi cryosectioned ve konfokal mikroskobu ile analiz edilebilir. Bu teknik lenfatik DraI görselleştirme sağlarnanoparçacık aşı taşıyıcıları ve dLNs antijenin hem eğirme. Daha önce 7 gösterildiği gibi doku bölümleri ilave olarak antijen ve germinal merkezlerin oluşumu ile bağlantılı hücre türleri gibi floresan etiketli antikorlar ve daha fazla bilgi elde etmek için kullanılan ile boyanmış olabilir. Parçacık sentezi optimize edilmiştir ve dLNs insan ticareti onaylandıktan sonra, in vivo CTL genişleme aydınlatılması doğrulamak için önemlidir. Nanoparçacık aşılamaya verdikleri yanıt olarak antijene özgü CD8 + T hücrelerinin ortaya konmasını analiz etmek amacıyla, detaylı bir immünolojik analizler sağlar OVA 257-264 peptit (SIINFEKL) immünodominant CD8 + T hücre epitopu ile bir model antijen, ovalbümin (OVA) kullanmıştır Başlangıç ​​aşı geliştirme 16,17 için antijen-spesifik T hücresi tepkilerinin. Özel olarak, genleşme ve antijene özgü CD8 + T hücrelerinin göç dinamiklerini sorgulamak için, biz oluşturulan adresT-hücresi reseptörü (H-2K ile birlikte b) SIINFEKL için spesifik (TCR) ile CD8 + T hücreleri sahip OT-I transgenik farelerin transgenik fareler (Luc), lusiferaz sentezleyen ateşböceği geçerek çift transgenik fare modeli. Bu OT-I / Luc Farelerden, lusiferaz sentezleyen, OT-I, CD8 + T hücreleri, izole edilebilir ve saf C57BL / 6 farelerine adoptif transfer için hazırlanmıştır. Tohumlanmış sonra, OVA-içeren nanopartiküller ile başarılı bir aşı, bir bütün hayvan görüntüleme sistemi 9,10 ile biyoışıldama sinyalinin izlenmesi ile takip edilebilir şekilde nakledilen T hücrelerinin genişlemesine neden olur. Bu non-invazif tüm vücut görüntüleme tekniği uzunlamasına bir şekilde periferal dokularda T hücresi lenfoid dokularda genişleme ve yayılması ilgili işlemleri ifşa son 18-20 diğer viral veya tümör antijenleri ile kullanılmıştır. Adoptif transfer antijene özgü CD8 + T hücre analizi, tamamlayıcı, endogenoBize T hücresi tepkileri kullanıldığında, aşılama dört florofor ile işaretlenmiş MHC-sınıf I molekülleri içeren bir peptit-MHC kompleksi tetramer, peptit epitopları ile yüklü olan peptid ana histokompatibilite kompleksi (MHC) tetramer denemesi 21 ile incelenebilir yayınlamak bir antijen-spesifik bir şekilde, TCR ve etiket, CD8 + T hücrelerini bağlamak için. peptid-MHC tetramer denemesi lenfoid ve periferik dokularda antijen spesifik CD8 + T hücrelerini teşhis etmek için, terminal Otopsi çalışmaları ya da seri kan çekilir elde edilen periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC) ile uzunlamasına çalışmalarda da gerçekleştirilebilir. Peptid-MHC tetrameri ile lenfositlerin boyama sonra, akış sitometri analizine CD8 + T-hücreleri arasında kendi frekans CTL&#39;lerin fenotipinde veya nicelenmesine detaylı analizler için gerçekleştirilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>870012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>850375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD&#8482;) (MPLA)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, INC.</td>
			<td>699800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass vials</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>0334125D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Symphny Vacuum Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin (OVA)</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>3054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris Propane (BTP)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q125 Sonicator (125W/20kHz)</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>Q125-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH)</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SH-2000-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&#160;</td>
			<td>Malvern</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer Cuvettes</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>DTS1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#39;-Dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A37571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT freezing medium&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cryomolds</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albino C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-1 C57BL/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>003831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep&#8482; Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS&#174; whole animal imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2EDTA tubes</td>
			<td>BD</td>
			<td>365974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A10492-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD16/32 Fc Block</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>14-0161-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H-2Kb OVA Tetramer</td>
			<td>MBL</td>
			<td>TS-5001-1C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD8-APC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD44-FITC</td>
			<td>BD</td>
			<td>553133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD62L-PECy7</td>
			<td>Ebioscience</td>
			<td>25-0621-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>D8417-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyAn Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>FlowJo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-animal imaging and flow cytometric techniques for analysis of antigen-specific cd8+ t cell responses after nanoparticle vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

ICMVs sentezinde yer alan basamaklar, Şekil 1 &#39;6&#39;da tasvir edilmiştir. Kısaca, bir lipofilik ilaçlar ya da floresan boyalar ihtiva eden bir lipid filmi hidrofilik ilaçların mevcudiyetinde hidratlanır. Örneğin Ca2 + gibi iki değerli katyonlar, çok katmanlı vezikülleri içine anyonik lipozomların füzyon sürmek için ilave edilir. DTT gibi, yağ katmanları apposing, ve son olarak, dış maleimid grupları, kalan &quot;elyaf&quot; maleimid işlevselleştirilmi?...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination at JoVE.com

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

whole-animal-imaging-flow-cytometric-techniques-for-analysis-antigen

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.1K Görüntüleme.  University of Michigan. We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Video: Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident cells. A key mechanism of this inflammatory response is the migration of circulating immune cells to the ischemic brain facilitated by chemokine release and increased endothelial adhesion molecule expression. Brain-invading leukocytes are well-known contributing to early-stage secondary ischemic injury, but their significance for the termination of inflammation and later brain repair has only recently been noticed.
Here, a simple protocol for the efficient isolation of immune cells from the ischemic mouse brain is provided. After transcardial perfusion, brain hemispheres are dissected and mechanically dissociated. Enzymatic digestion with Liberase&#160;is followed by density gradient (such as Percoll) centrifugation to remove myelin and cell debris. One major advantage of this protocol is the single-layer density gradient procedure which does not require time-consuming preparation of gradients and can be reliably performed. The approach yields highly reproducible cell counts per brain hemisphere and allows for measuring several flow cytometry panels in one biological replicate. Phenotypic characterization and quantification of brain-invading leukocytes after experimental stroke may contribute to a better understanding of their multifaceted roles in ischemic injury and repair.

Inflammation plays a central role in the pathogenesis of ischemic stroke. Increasing evidence suggests that it acts as a double-edged sword which exacerbates early brain injury, but also contributes to later repair. This protocol describes the isolation of immune cells from the ischemic brain and their subsequent flow cytometric phenotyping.

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and reproducibility of this assay can be considered unstable, either because of user&#39;s errors or because of the sensitivity of NK cells to experimental manipulation. To eliminate these issues, a workflow that reduces them to a minimum was established and is presented here. To illustrate, we obtained blood samples, at various time points, from runners (n = 4) that were submitted to an intense bout of exercise. First, NK cells are simultaneously identified and isolated through CD56 tagging and magnetic-based sorting, directly from whole blood and from as little as one milliliter. The sorted NK cells are removed of any reagent or capping antibodies. They can be counted in order to establish an accurate NK cell count per milliliter of blood. Secondly, the sorted NK cells (effectors cells or E) can be mixed with 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine Perchlorate (DiO) tagged K562 cells (target cells or T) at an assay-optimal 1:5 T:E ratio, and analyzed using an imaging flow-cytometer that allows for the visualization of each event and the elimination of any false positive or false negatives (such as doublets or effector cells). This workflow can be completed in about 4 h, and allows for very stable results even when working with human samples. When available, research teams can test several experimental interventions in human subjects, and compare measurements across several time points without compromising the data&#39;s integrity.

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

İnsan Endoservikal Gamma Delta T Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in B-cell and plasma-cell production of antibodies, and detecting and eliminating cancer cells. The development of MHC-tetramer staining of antigen-specific T cells analyzed by flow cytometry has revolutionized our ability to study and understand the immunobiology of T cells. While extremely useful for determining the quantity and phenotype of antigen-specific T cells, flow cytometry cannot determine the spatial localization of antigen-specific T cells to other cells and structures in tissues, and current disaggregation techniques to extract the T cells needed for flow cytometry have limited effectiveness in non-lymphoid tissues. In situ MHC-tetramer staining (IST) is a technique to visualize T cells that are specific for antigens of interest in tissues. In combination with immunohistochemistry (IHC), IST can determine the abundance, location, and phenotype of antigen-specific CD8 and CD4 T cells in tissues. Here, we describe a protocol to stain and enumerate antigen-specific CD8 T cells, with specific phenotypes located within specific tissue compartments. These procedures are the same that we used in our recent publication by Li et al., entitled &#34;Simian Immunodeficiency Virus-Producing Cells in Follicles Are Partially Suppressed by CD8+ Cells In Vivo.&#34; The methods described are broadly applicable because they can be used to localize, phenotype, and quantify essentially any antigen-specific CD8 T cell for which MHC tetramers are available, in any tissue.

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

Here, we describe a method that combines in situ MHC-tetramer staining with immunohistochemistry to determine localization, phenotype, and quantity of antigen-specific T cells in tissues. This protocol is used to determine the spatial and phenotypic characteristics of antigen-specific CD8 T cells relative to other cell type and structures in tissues.

Situ MHC-tetramer boyama ve kantitatif fenotip antijen spesifik CD8 T hücre dokularında, bereket ve konumunu belirlemek için analiz

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

En iyi duruma getirilmiş Interferon-gamma ELISpot tahlil ölçü birimi T hücre yanıtları sonrasi hipererjik eskiden şiling şimdi domuz modelinde

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

Anti-vektör ve Anti transgene özel CD8 eşzamanlı miktar+ T hücreleri MHC ile ben Tetramer sonrasi hipererjik bir Viral vektör ile boyama

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the key steps to investigate TRMs. There are slight variations in lymphocyte isolation protocols for different organs. Kidney is an essential non-lymphoid organ with numerous immune cell infiltration especially after pathogen exposure or autoimmune activation. In recent years, multiple labs including our own have started characterizing kidney resident CD8+ T cells in various physiological and pathological settings in both mouse and human. Due to the abundance of T lymphocytes, kidney represents an attractive model organ to study TRMs in non-mucosal or non-barrier tissues. Here, we will describe a protocol commonly used in TRM-focused labs to isolate CD8+ T cells from mouse kidneys following systemic viral infection. Briefly, using an acute lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) infection model in C57BL/6 mice, we demonstrate intravascular CD8+ T cell labeling, enzymatic digestion, and density gradient centrifugation to isolate and enrich lymphocytes from mouse kidneys to make samples ready for the subsequent flow cytometry analysis.

Isolation of Mouse Kidney-Resident CD8+ T cells for Flow Cytometry Analysis

Following viral infection, kidney harbors a relatively large number of CD8+ T cells and offers an opportunity to study non-mucosal TRM cells. Here, we describe a protocol to isolate mouse kidney lymphocytes for flow cytometry analysis.

Akış Sitometri Analizi için Fare Böbrek-Resident CD8+ T hücrelerinin izolasyonu

Tissue-resident memory T cell (TRM) is a rapidly expanding field of immunology research. Isolating T cells from various non-lymphoid tissues is one of the ...

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine (BrdU) marks cells that are in or recently completed S-phase, and carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) detects daughter cells after division. However, these dyes do not allow identification of the cell cycle phase at the time of analysis. An alternative approach is to exploit Ki67, a marker that is highly expressed by cells in all phases of the cell cycle except the quiescent phase G0. Unfortunately, Ki67 does not allow further differentiation as it does not separate cells in S-phase that are committed to mitosis from those in G1 that can remain in this phase, proceed into cycling, or move into G0.
Here, we describe a flow cytometric method for capturing a &#34;snapshot&#34; of T cells in different cell cycle phases in mouse secondary lymphoid organs. The method combines Ki67 and DNA staining with major histocompatibility complex (MHC)-peptide-multimer staining and an innovative gating strategy, allowing us to successfully differentiate between antigen-specific CD8 T cells in G0, in G1 and in S-G2/M phases of the cell cycle in the spleen&#160;and draining lymph nodes of mice after vaccination with viral vectors carrying the model antigen gag of human immunodeficiency virus (HIV)-1.
Critical steps of the method were the choice of the DNA dye and the gating strategy to increase the assay sensitivity and to include highly activated/proliferating antigen-specific T cells that would have been missed by current criteria of analysis. The DNA dye, Hoechst 33342, enabled us to obtain a high-quality discrimination&#160;of the G0/G1 and G2/M DNA peaks, while preserving membrane and intracellular staining. The method has great potential to increase knowledge about T cell response in vivo and to improve immuno-monitoring analysis.

Clonal expansion is a key feature of antigen-specific T cell response. However, the cell cycle of antigen-responding T cells has been poorly investigated, partly because of technical limitations. We describe a flow cytometric method to analyze clonally expanding antigen-specific CD8 T cells in spleen and lymph nodes of vaccinated mice.

Aşılanmış Farelerde Antijene Özgü CD8 T Hücrelerinin Hücre Döngüsü Analizi için DNA/Ki67 Tabanlı Akış Sitometrisi Tahlili

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...