DA Coulter (CHOP) Biz bize, bize onun teknik uzmanlık paylaşımı için 2-foton videonun başında gösterilen resimler ve H. Takano elde etmek için 2-foton mikroskop kullanmak izin verdiği için teşekkür etmek istiyorum.

Bölüm 1: Doku hazırlanması <ol><li> 150-200g (eski 2-3 hafta), izofluran inhalasyonu ve dekapite ile anestezi edilmiştir Hartley kobay ince bağırsak sıralı diseksiyonu submüköz ve myenterik pleksus preparatları izole edilmiştir. Ötenazi sonra, küçük bağırsak eksize ve içeriği, sıcak, oksijenli çözümü ile lümen ateş basması kaldırılır. Biz Orta 199 25 mM HEPES, 37 önceden ısıtılmış olmuştur (7,4, şu andan itibaren, M199-DM olarak anılacaktır) için ayarlanabilir 5 mM NaHCO 3 ve 2 mM Glutamin ve pH, ° C ile desteklenmiş Ancak, protokolün tüm kalan adımları, oda sıcaklığında gerçekleştirilen olacaktır. </li><li> Bir intestinal segment uzunluğu 8-10 cm, mezenterik sınırı boyunca açılan M199-DM içeren bir Sylgard çanak transfer ve böcek pimleri kullanarak mukoza yan-bindi. Bu bağlantılarını sonra doku düzenli hizalanmış mukozal villuslar satırları ile dikdörtgen bir şekil sergiler, böylece hatta gerginlik korumak için son derece önemlidir. </li><li> Neredeyse yatay konumda düz ipuçları ince Dumont forseps kullanarak, kolay hazırlanması bir ucunda villuslar kapma ve doku uzunlamasına ekseni boyunca çekerek mukoza kabuğu. Örnek eşit tutturulmuş, mukoza şeritler submüköz ganglionlar ve submukozal damarsal içeren submukoza açığa bireysel birkaç vuruş ayrılmış olabilir. </li><li> Plexuses ince diseksiyon için, karanlık alan aydınlatma ile diseksiyon mikroskobu kullanmanızı öneririz. Aslında, bu tür aydınlatma tarafından oluşturulan sözde üç boyutlu etki, enstrüman zararınız böylece önlenmesi veya en aza indirmek, tek tek katmanların ayırt etmek için yardımcı olur. </li><li> Submukozal hazırlık yapmak için, biz gerektirir Hirst ve McKirdy 4 klasik prosedürü izleyin: a) dairesel kas liflerinin yönü takip submukozal katmanda bir kesim, bu (bir Moria gibi çok ince makas kullanarak elde edilebilir MC19 veya eşdeğeri); sirküler kas tabakası, ince makas kullanarak aşağı iterken b), çok ince pens ile hafifçe submukozaya kaldırırken; ayrılması, geri kalanını submukozaya kurtarmak için ilerledikçe c) uzunlamasına kenarlarında kesim Hazırlık; d) submukozal hazırlık son boyutu tanımlamak için ilk bir mesafe dairesel kas lifleri, yönünü takiben ikinci bir kesim yapmak. Sadece 30 - 50 mikron kalınlığında incecik bir görünüme sahiptir sonuçlanan submukozal segment, taze M199-DM, hafifçe tutturulmuş ve gerginlik olmadan içeren başka bir Sylgard çanak aktarılır ve daha sonra kullanmak üzere oksijenli odasında muhafaza edilebilir. </li><li> Orijinal bağırsak-segment, mukoza ve submukoza yoksun ve sirküler kas maruz kalan, hala bir myenterik pleksus hazırlık verim için kullanılabilir. Myenterik pleksus ortaya çıkarmak için, bir dairesel kas tabakası mümkün olduğu kadar ortadan kaldırmak gerekir. Bu, önceki adımlarda istihdam aynı düz ucu ince forseps kullanılarak elde edilebilir. Liflerini içeren demetler önce birini, sonra hazırlık diğer taraftan, nazikçe uzak çekilmiş olabilir. Maruz myenterik pleksus, kas ve altta yatan seroza longitudinal tabakasının ayrılamaz. Bu nedenle, ne myenterik pleksus hazırlık denir pimleri boyunca kesilebilir segment. Canlı kas içerdiğinden, bu fizyolojik bir deney başlayana kadar oksijenli M199-DM içeren çanak çok gevşek pin tavsiye edilir. </li><li> Mukoza ana ENS sensörü, ve tüm etkileyiciler da bağırsak duvarına gömülü olduğundan, tüm refleks yollar korumak sağlam yarı hazırlıkları incelemek mümkündür. Bu özel tasarlanmış hazırlıkları 1.3 &#39;de açıklanan adımları kombinasyonları gerektirir. 1,6, izole barsak segmentinin bitişik olan alanlarda uygulanabilir. </li><li> Birkaç dakika önce gerçek optik deney, seçim hazırlık gerginlik eşit olarak dağıtılmış ve doku Sylgard dibine tamamen düz yatıyor emin yapma, deney odasında monte edilir. Bu doku hasarına maruz kalmadan tüm çevresine yerleştirilmiş olabilir birden çok ince iğneler ile örnek tutarak elde edilir. </li></ol> Bölüm 2: optik kayıt için doku örneklerinin hazırlanması <ol><li> (Isteğe bağlı) artık düz kas ve bağ dokusu için bağlayıcı boya arka floresan önlemek için, her iki izole plexuses kollajenaz VII (≤ 50 U / ml) ve proteaz IX (≤ 0.5 mg içeren M199-DM 30-60 dakika süreyle inkübe olabilir / ml). Bir enzim tedavisi sonrasında hazırlıkları ile yıkanmış olmalıdır, (streptomisin, penisilin, 100U/ml 100 mg / ml) M199-DM artı% 10 hayvan serumu (örneğin, at ya da sığır) ve antibiyotikler, gece boyunca devam kamara wi doymuşth% 95 O 2 ve% 5 CO 2. Farkedilir optik kayıtları sinyal-gürültü oranı artırır çünkü uzun yıllardır kullanılan bu prosedür, yeni başlayanlar için yararlı olmayabilir ve dikkatli bir şekilde kabul edilmelidir. Gerçekten de, diseksiyon sırasında zarar gören bir hazırlık enzim tedavisi sırasında dağılmakta riskini taşır. Bununla birlikte, enzim tedavisi yokluğunda bile, biz hazırlıkları serum ve antibiyotik M199-DM gecede korunması gerektiğini öneriyoruz. Bu adım, akut diseksiyon hasarı sonrası doku iyileşmesi teşvik ve örnek saydamlığı artırır. </li><li> Elektriksel aktivite Optik kayıtları kas sözleşme olduğu bir hazırlık elde edilemez. Myenterik pleksus, birkaç dakika önce M199-DM banyo doku 2 mcM nifedipin optik deney kaydederken Bu nedenle, kas kasılması önlemek. </li></ol> Bölüm 3: di-4-ANEPPDHQ ile Boyama <ol><li> Di-4-ANEPPDHQ liyofilize formu ticari olarak kullanılabilir. Biz, saf etanol içinde eriterek konsantre bir stok solüsyonu [örneğin, 15-20 mg / ml]. Bu stok, -20 ° C&#39;de muhafaza edildiğinde, son derece kararlı. Gerçekten de, laboratuar, biz sadece biz neredeyse 6 yıl önce yapmıştı bu boyanın bir stok solüsyonu son damlasına bitirdi. </li><li> M199-DM boyama çözüm hazırlanan ve protokol gerektiriyorsa 2 mcM nifedipin içermelidir. Boya final konsantrasyon 5 mg / ml gibi düşük olabilir ve 50 mcg / ml &#39;den yüksek olmamalıdır. Ancak, hisse senedi konsantrasyon bağlı olarak, belirli bir miktarda etanol boyama çözüm olacak ve dikkate alınmalıdır. Örneğin, 50 mg / ml ile boyama çözüm boya ~% 0.3 etanol içeren stok sadece 5 mg / ml &#39;lik bir konsantrasyon 15 mg / ml stok olsaydı, ancak% 1 etanol. </li><li> Boyama için, hazırlama, boya çözüm 10-30 dakika batık. Bu dönemden sonra, boya, taze yıkanıp ve değiştirilmesi. M199-DM oksijenli. Di-4-ANEPPDHQ sadece bir lipid ortamda fluoresces bir membran geçirgenliği olmayan boya olduğundan, lekeli bir enterik hazırlık sağlıklı nöronlar boş balon görünüme sahip olmalıdır. </li></ol> Bölüm 4: Elektrik stimülasyon <ol><li> Uyarım voltaj veya akım tarafından sürülebilir. Biz mevcut stimülasyon, kanal başına 16 mA maksimum çıkış, 4-kanal uyaran jeneratör kontrollü bir bilgisayar tarafından teslim kullanın. </li><li> Deneysel amacı, belirli bir deneyde kullanılmak üzere elektrot modeli belirlenir. Hedefi belirli bir nöronun uyarılması zaman intrasellüler pipetler veya yama elektrotlar kullanılabilir. Stimülasyon belirli bir ganglion birden fazla nöron aktif hale getirmek için tasarlanmıştır, bir bağ dokunmadan ekstraselüler elektrot kullanılıyor olabilir. Birbirine ganglionlar, büyük, düşük direnç elektrotlar ve / veya çoklu-element elektrod istihdam edilebilir çalışma için; Ancak, genel olarak mevcut stimülasyon kullanırken, çok eleman dizileri tek seçenek haline gelir. Ekstrasellüler elektrotlar, yanı sıra bazı lineer elektrot diziler, birçok model, ticari kaynaklardan temin edilebilir. </li><li> Elektrotlar farklı türleri mikromanipülatörler kullanarak yerleştirilmiş olabilir. Uzun ve ince varil kaynaklanan titreşim önlemek için, biz küçük mikromanipülatörler deney odasına bitişik yerleştirilmiş olabilir manyetik üsleri kullanarak ve ince fakat çok sert metal çubuklar tungsten elektrotlar esnek varil destekleyen lehine. </li></ol> Bölüm 5: Perfüzyon Biz oksijenli çözümler girişi için bir kanal, ve çıkışı için 2 kanal peristaltik pompa kullanırlar. Perfüzyon kaynaklanan mekanik bozuklukları ortadan kaldırmak için, optik veri alımı sırasında pompa açık-kapalı olduğunu. Bölüm 6: membran potansiyeli birden fazla site optik kayıt için aparat <ol><li> Optik bileşenleri: Membran potansiyeli birden fazla site optik kayıt için cihaz NeuroCCD-SM kamera (RedShirtImaging) ve dik bir mikroskop trinoküler tüp monte 1:10 demagnifier / röle lens oluşur. Mikroskop, bağımsız, aktif bir titreşim izolasyonu tablosunda üst katı sabit bir sahne XY tercümecisi hareket eder. Havadaki titreşimi en aza indirmek için, tüm cihaz ağır akustik perde ve bir folyo çatı çevrilidir. Epi-ultra-düşük-dalgalanma geribildirim stabilize güç kaynağı tarafından desteklenmektedir 100W tungsten halojen lamba ile aydınlatma sağlanmaktadır. Işık, ısı filtresi, yüksek-Q girişim filtresi (HQ530/50) ve 565 nm (50% iletim) dikroik ayna kullanarak yarı monokromatik yapılır. Floresans emisyon dikroik ayna ve uzun bir geçiş filtresi (HQ572LP) ile ayrılır. Kütüphane olduğu söylenebilirışık sity nötral yoğunluk filtreleri kullanarak ayarlanır. Trans-aydınlatma, hazırlık parlak alan görüntülemek için, 0-55 V, 1-10, özel niteliklere sahip olmak gerekli değildir bir güç kaynağı tarafından tahrik ikinci bir 100 W tungsten halojen lamba ile sağlanır. </li><li> Yüksek hızlı kamera özellikleri: NeuroCCD-SM kamera, elektronik tasarım ve performans özellikleri ayrıntılı 3 tarif edilmiştir . Kısaca, (80x80 piksel) Marconi CCD39-01 çip arka aydınlatmalı, arka inceltilmiş kullanan soğutmalı, düşük çözünürlük, hassas, yüksek hızlı bir kamera. Sayısallaştırma 14-bit ve full frame oranı 2 kHz. Bununla birlikte, belirli amaçlar için, bir, çeşitli binning kombinasyonları kullanarak veya fonksiyonel piksel sayısını azaltarak 10 kHz maksimum kare hızı kadar artırabilir. Kamera son derece düşük okuma sesi (1 kHz 9 elektronlar 2 kHz&#39;de 23 elektron) önemli bir avantaja sahiptir. Buna ek olarak, kendi piksel, yüksek kare hızları orta derecede ışık şiddetlerinde izin, göreceli olarak büyük bir kuyu derinliği (215,000 elektron) var. </li><li> Veri Toplama ve Analiz Yazılımı: Optik deney Neuroplex, IDL platformu (Interactive Data Language) içinde bir uygulama olarak çalışır ve birden fazla, optik veri toplama, ekran ve analizi için gerekli özellikleri içerir RedShirtImaging, bir yazılım paketi tarafından kontrol edilir. </li><li> Ek kamera: Cihazın ayrılmaz bir parçası, bir çerçeve kapmak bağlı ikinci bir yüksek çözünürlüklü CCD kamera üzerine mikroskop röleleri hazırlanması bir görüntü trinoküler kafasına bir ışın ayırıcı. Global Lab Image / 2 yazılımı kullanılarak elde edilen ve depolanan görüntü, mekansal kökenli NeuroCCD-SM kamera tarafından yakalanan optik sinyalleri doğru bir harita oluşturmak için zamana bağımlı alt-milisaniye görüntü üzerine bindirilmiş optik gerilim sinyalleri kaydedildi. Bizim laboratuvarda, bu kamera için frame grabber fonksiyonel veri toplama sorumlu farklı bir bilgisayarda bulunan. Bu nedenle, görüntü dosyasını bir bilgisayardan diğerine aktarılacak, ve yüksek çözünürlüklü bir görüntü boyutu ve konumu küçük ayarlamalar önce iki kamera mükemmel bir kayıt elde gereklidir. </li></ol> Bölüm 7: Optik deneyleri <ol><li> Her fonksiyonel kayıt önce, biz (6.4 &#39;de gösterildiği gibi) optik yoluyla elektriksel aktivite kayıt planladığınız bölgenin yüksek çözünürlüklü siyah beyaz bir görüntü kazanır. Yüksek hızlı kamera piksel haritası üzerine bindirilmiş Bu görüntü, optik sinyallerin kaynağı yapılarını belirlemeye yardımcı olur. </li><li> Uygun sistem konfigürasyonu, Neuroplex (6.3 &#39;e bakınız) da deklanşöre kontrolleri, elektrik stimülasyonu tetikler. Yüksek hızlı veri toplama önemli bir bilgisayarın güç gerektirdiğinden, büyük miktarda ve yüksek kapasiteli sabit disk ile bellek adanmış bir bilgisayar kullanmak için, eğer mümkünse, tavsiye edilir. Ancak, önemsiz değildir. Kendi sistemi, örneğin, zaten birkaç yıldır eski, state-of-the-art bilgisayarlarda sığmayacak kadar büyük veri toplama kurulları kullanmaktadır. Bir uzlaşma olarak kabul edilen ve 500 GB sabit disk ve 4 GB RAM ile donatılmış bir Dell Precision 390 optik sistem adamıştır. Bu bilgisayar hala deneyler çalıştırmak için yeterli güç sağlarken, A / D ve D / A panoları, eski, ancak yeterli tutmak için izin verdi. </li><li> En kısa sürede satın alma olarak, Neuroplex çok tamamlayıcı formatları bunlardan bazıları aşağıda ayrıntılı sonuçları görüntüleyebilirsiniz: <ol class="lalpha"><li> Ekranın bir alanda, sayfa ekran, ayrı bir çerçeve olarak 80X80 yüksek hızlı kamera tarafından yakalanan hazırlama ham görüntüyü gösterir. Ilgi alanları belirlemek için ikinci bir kamera (6.4 ve 7.1 &#39;de açıklandığı gibi) ile elde edilen yüksek çözünürlüklü görüntü bu piksel haritası üzerine Süperpozisyon operatör yeteneği geliştirir. </li><li> Bu sayfayı görüntülemek piksel fare kontrolü altında seçildiğinde, Neuroplex zamanın bir fonksiyonu olarak bu piksel kayıtlı optik değişimin büyüklüğünü gösteren izleri otomatik olarak optik çıkış dönüştürür. (Örneğin, mesafe kadar taşınmış / F vs zaman). Operatör bu izleri tek tek piksel çıktı, ya da daha doğrusu, hazırlık belirli bir bölge üzerinde birden fazla lokusların uzay-ortalamalı çıktı yansıtacak karar verebilirsiniz. </li><li> Film formatında veriler de gösterilebilir. Ancak, bireysel deneysel çalıştırır yer alan tüm bilgiler tamamen ayıklanır sağlamak için optik veri off-line analiz lehine. Bu analiz Temsilcisi sonuçlar mevcuttur. </li></ol></li></ol> Bölüm 8: optik bir deneyde teknik kalitesi elde etmek için nasıl The optik bir deney teknik başarı kayıtları sinyal-gürültü oranı, sonuçta ölçülür. Ayrıca, iyi bir sinyal-gürültü oranı, bir vahiy değil ama bir yolculuğa kaynaklanmaktadır. Bir opera performans olarak, nihai sonucu sinerjik etkileşim faktörlerin çokluğu ile belirlenir. Böylece, teknik açıdan sağlam bir optik deney ulaşmak için, bağımsız, optik aparat ve protokolün her bir adım için gerekli becerileri rafine esastır. Aşağıda potansiyel sorun alanlarının bir listesini ve her zaman 5 beklenen sorunları önlemek için bazı öneriler: <ol><li> Gürültü kaynakları Her zaman fizyolojik tepkileri yansıtan kesirli değişikliği (mesafe kadar taşınmış / F) (&lt;% 10 / bağırsak kayıtların çoğu 100 mV) nispeten küçük olması nedeniyle, voltaj duyarlı boya ile elektriksel aktivite kayıt ve gürültülü bir iz Mekanik ve optik istikrar çok önemli kötü bir sonuca işaret değildir. Bu nedenle, sinyal-gürültü oranını optimize etmek için, onu ortadan kaldırmak için zorunludur, ya da en azından en aza indirmek için, en kötü iki suçluların katkıları: a) mekanik titreşimler, ve b) ışık kaynağı dalgalanma. <ol class="lalpha"><li> Mekanik titreşimler kurulum yapılandırma, istikrar, motorlu ekipmanları, hava akımları, akustik gürültü, akıcı hareketler, ya da banyo çözüm yüzen parçacıklar yakınlığı gibi çok farklı olarak çeşitli kaynaklar tarafından oluşturulur. Iyi bir titreşim izolasyon sistemi ve aşırı durumlarda (örneğin, 5.1 açıklamasına bakın) için akustik perdeleri, büyük bir fark yaratabilir ve maliyet değerdir. Buna ek olarak, deney, ya da kurulum, küçük, hareketli parçalar için manyetik üslerin kullanımı kullanılan çözümler filtrasyon gibi sağduyu yaklaşımlar, oldukça etkili. </li><li> Işık kaynakları, yarı-maksimum yoğunluğu en istikrarlı. Bu nedenle, bir güç kaynağı için akım sınırı ayarlamak gerektiğini ve gerektiğinde gerilimi azaltarak ışık yolu yerine nötr yoğunluk filtreleri takarak ışık yoğunluğunu azaltmak. Ark lambaları özünde gürültülü. Tungsten-halojen ampul veya ışık yayan diyotlar çok daha istikrarlı ve tercih 6 olmalıdır. </li></ol></li><li> Hayvan yaş Yaşla birlikte bağırsak sertleştirdi içinde bağ dokusu gibi, afferent ve efferent süreçleri iki plexuses nöronlar üzerinde büyük hasara maruz kalmadan bireysel doku katmanlarına ayırmak için daha zor hale gelir, çünkü diseksiyonlarının genç hayvanların bağırsak kullanılarak yapılmalıdır çapraz katmanlı sınırları ve / veya gut uzunlamasına ekseni boyunca oldukça mesafe proje. Bu danışma, içi gangliyonik bağlantıları çalışılırken göz ardı edilebilir, deneysel amacı, inter-ganglion refleks yollarının devreleri ya da aktivasyon analizi büyük önem taşımaktadır. </li><li> Boya içselleştirilmesi Mümkün olduğunca düşük bir boya konsantrasyonu olarak kullanmak ve gereksiz ışık maruziyeti en aza indirmek için önemlidir. Hazırlanması sağlığı bozulur gibi, di-4-ANEPPDHQ diğer boyalar daha az fototoksik olduğu kanıtlanmış olmasına rağmen, sonunda, içselleştirilmiş alacak. Boya içselleştirilmesi, dramatik bir eşiğe 3 artırarak sinyal-gürültü oranı azalır . </li><li> Elektrot bakım <ol class="jove_lalpha"><li> Elektrotlar her bir deney sonrasında dikkatle ve iyice yıkanmalıdır. Organik mevduat tungsten elektrot ucunda elektrot direnci artırmak ve stimülasyon önlemek. </li><li> Piyasada bulunan tungsten elektrot yalıtım çok hassas ve hasar eğilimli. Stimülasyon etkinliğini yalıtımında bir kaçak akım şönt uzlaşma ve deneyin başarısı tehlikeye. </li></ol></li><li> Perfüzyon tehlikeleri Perfüzyon açıkken set-up yalnız bırakmayın. Akış ve peristaltik pompa akış düzgün dengeli değilse, iki katastrofik olaylar yer alabilir: <ol class="lalpha"><li> Bir sel mikroskop geri dönüşümsüz hasara neden olabilir. </li><li> Hazırlanması, deney sırasında kurumasına neden olabilir. </li></ol></li><li> Yazılım sorunlarını Bu satın alma gibi iyi analiz kontrol yazılımı ile kendini tanımak için çok önemlidir. Hızlı veri edinme ve / veya çok büyük dosyaları oluşturma sistemi arıza eşiğine sürücü eğilimindedir ve sınır koşulları saygı sürece oldukça affetmez Neuroplex, acımasızca çökmesine sebep olacaktır. Analizi ilgi sınırlı bölgelerde sınırlı zaman kolayca cevapsız kayıtları içinde incelikleri, kendilerini sık sık veri film görüntüler ortaya koymaktadır. </li></ol>

<ol>
	<li>Costa, M. a. r. c. e. l. l. o., Furness, J. o. h. n. . B., Llewellyn-Smith, I. J., Johnson, L. e. o. n. a. r. d. . R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in Physiology of the Gastrointestinal Tract, edited by Leonard R. , 1-1 (1987).</li><li>Obaid, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+patterns+of+activity+in+an+intact+mammalian+network+with+single-cell+resolution:+optical+studies+of+nicotinic+activity+in+an+enteric+plexus.">Spatiotemporal patterns of activity in an intact mammalian network with single-cell resolution: optical studies of nicotinic activity in an enteric plexus.</a> J Neurosci. 19 (8), 3073-3073 (1999).</li><li>Obaid, A. L., Loew, L. M., Wuskell, J. P., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+naphthylstyryl-pyridinium+potentiometric+dyes+offer+advantages+for+neural+network+analysis.">Novel naphthylstyryl-pyridinium potentiometric dyes offer advantages for neural network analysis.</a> J. Neurosci. Methods. 134 (2), 179-179 (2004).</li><li>Hirst, G. D., McKirdy, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+potentials+recorded+from+neurones+of+the+submucous+plexus+of+guinea-pig+small+intestine.">Synaptic potentials recorded from neurones of the submucous plexus of guinea-pig small intestine.</a> J Physiol (Lond). 249 (2), 369-369 (1975).</li><li>Salzberg, B. M., Barker, J., McKelvy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Methods+in+Cellular+Neurobiology.">Current Methods in Cellular Neurobiology.</a> , 139-139 (1983).</li><li>Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-stable+non-coherent+light+source+for+optical+measurements+in+neuroscience+and+cell+physiology.">An ultra-stable non-coherent light source for optical measurements in neuroscience and cell physiology.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141, 165-16 (2005).</li><li>Obaid, A. L., Nelson, M. E., Lindstrom, J., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+studies+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subtypes+in+the+guinea-pig+enteric+nervous+system.">Optical studies of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in the guinea-pig enteric nervous system.</a> J Exp Biol. 208 (Pt 15), 2981-2981 (2005).</li><li>Obaid, A. L., Zou, D. J., Rohr, S., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+with+single+cell+resolution+from+a+simple+mammalian+nervous+system:+Electrical+activity+in+ganglia+from+the+submucous+plexus+of+the+guinea-pig+ileum.">Optical recording with single cell resolution from a simple mammalian nervous system: Electrical activity in ganglia from the submucous plexus of the guinea-pig ileum.</a> Biol. Bull. 183, 344-344 (1992).</li><li>Salzberg, B. M., Davila, H. V., Cohen, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+impulses+in+individual+neurones+of+an+invertebrate+central+nervous+system.">Optical recording of impulses in individual neurones of an invertebrate central nervous system.</a> Nature. 246 (5434), 508-508 (1973).</li></ol>

Bu protokol, iki gol düşünülerek yazılmıştır. Bunlardan birincisi, son on yılda pek çok teknolojik gelişmeler, voltaj duyarlı boyalar kullanılarak elektriksel aktivite optik kayıt sayesinde sağlam nöron ağları eğitim için en güçlü, güvenilir ve uygun fiyatlı yöntemler biri haline gelmiştir ki, diğer araştırmacılar ikna etmeye; gerçekten kolayca mütevazı kaynaklara sahip bir laboratuvarda bile uygulanan olabilir. Ikinci golü, moleküler ve hücresel olayların iki nöronal plexuses ve b...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Medium 199</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
<td>M3769</td>
<td>With Earle&#x2019;s salts Without L-Glutamine, Phenol Red and Sodium Bicarbonate</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corp., Midland, MI</td>
<td>184 silicone elastomer kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insect pins used for dissection</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>F.S.T., Foster City, CA</td>
<td>26001-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>F.S.T., Foster City, CA</td>
<td>11203-23 or 11200-33</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Moria MC19/B Pascheff-Wolff Spring Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>F.S.T., Foster City, CA</td>
<td>15371-92</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pins to hold the tissue during the experiment</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seirin Corp., Shizuoka, Japan</td>
<td>Seirin Spinex</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase VII</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
<td>C0773</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protease IX</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
<td>P6141</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
<td>10439-016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PenStrep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO, BRL</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO, BRL</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nifedipine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Di-4-ANEPPDHQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes, Eugene, OR</td>
<td>D36802</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4-Channel Stimulus Generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Multi Channel System MCS GmbH, Reutlingen, Germany</td>
<td>2000 Series</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Peristaltic pump</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rainin, Woburn, MA</td>
<td>2-channel Dinamax RP-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High-speed camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RedShirtImaging, LLC Decatur, GA</td>
<td>NeuroCCD-SM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1:10 demagnifier / relay lens</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Optem, Qioptiq Linos, Inc., Rochester, NY</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Upright microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Optical Co., Tokyo, Japan</td>
<td>BX61TRF</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gibraltar fixed stage with motorized X-Y translator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibraltar, Burleigh Instruments, EXFO, Quebec, Canada</td>
<td>PSSG--BX2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Linear matrix electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FHC, Inc., Bowdoin, ME</td>
<td>Custom made</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Active vibration-isolation table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Halcyonics,Inc., Menlo Park, CA</td>
<td>Micro 60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra-low-ripple feedback stabilized power supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kepco, Flushing, NY</td>
<td>ATE 75-15M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heat filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Schott Optical Glass, Duryea, PA</td>
<td>KG-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High-Q interference filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma, Inc., Rockingham, VT</td>
<td>HQ530/50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic mirror</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma, Inc., Rockingham, VT</td>
<td>565 nm (50% transmission)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Long-pass filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chroma, Inc., Rockingham, VT</td>
<td>HQ572LP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acoustic curtains</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Acoustical Surfaces, Inc.</td>
<td>BSC-25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neuroplex</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>RedShirtImaging, Inc., Decatur, GA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IDL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High-resolution CCD camera, with its own camera controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu Photonics, KK, Hamamatsu City, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Frame-grabber for high-resolution camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Data Translation, Marlboro, MA</td>
<td>DT3120K-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging software for high-resolution camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Data Translation, Marlboro, MA</td>
<td>Global Lab Image/2</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

optical recording of electrical activity in guinea-pig enteric networks using voltage-sensitive dyes

Enterik sinir sistemi (ENS) izolasyon karmaşık davranışları gerçekleştirme yeteneğine tespit fonksiyonları ile kendi kendine yeten bir ağdır. Onun nöron (çapı 10-25 mikron), bağırsak duvarı farklı düzlemler ile sınırlı plexuses düzenlenmiştir<sup&gt; 1</sup&gt;; Myenterik pleksus uzunlamasına ve sirküler kas tabakaları ve sirküler kas tabakası ve mukoza arasında submüköz pleksus arasında bulunabilir. Bu plexuses efektör sistemleri bu yana (epitel taşıma, endokrin hücreleri, bağışıklık elemanları, kan damarları ve düz kas) aynı zamanda bağırsak duvarının içinde yer alan, yarı sağlam hazırlıkları çeşitli refleks yollar bireysel bileşenleri korumak disseke edilebilir. Efektör sistemlerin davranış, uyum içinde hareket eden submüköz ve myenterik pleksuslar tarafından kontrol edilir. Bu nedenle, ganglionlar içinde ve arasında, ve pleksuslar arasındaki iletişimi sinaptik etkileşimlerinin ayrıntılı bilgi, normal gastrointestinal fonksiyon anlamak için esastır. ENS, sağlam bir sinir sistemi gibi, moleküler ve hücresel olayların bir nöronal ağ elektrik davranış ve fizyolojik çıkışları ile ilişkili olan eşsiz bir deneysel model. Çünkü onun plexuses yarı-iki-boyutlu bir organizasyon, ENS özellikle de voltaj duyarlı boyalar istihdam birden fazla site optik kayıt teknikleri kullanılarak yapay sinir ağları çalışma için uygundur<sup&gt; 2,7,8,9</sup&gt;. Biz burada nispeten yeni bir naphthylstyryl-piridinium boya (di-4-ANEPPDHQ) kullanımını göstermek<sup&gt; 3</sup&gt; Önceki modellerine göre çok düşük bir fototoksisite yavaş hızı, içselleştirme ve olağanüstü kimyasal kararlılık dahil olmak üzere birden çok avantajlar sunmaktadır. Alt milisaniye çözünürlüğü izin veren bir kamera ile birlikte kullanıldığında, bu boya bize 100X büyütmede ~ 2.5 mm maksimal uzaysal çözünürlüğü ile görüş alanı içindeki tüm nöronların elektriksel aktivitenin izlemenize olanak sağlar. Düşük büyütme (10X veya 20X), tek hücreli çözünürlük kurban arası ganglion devresi inceliklerini ifşa, perspektif içinde bir kazanç ile telafi edilir.

Watch this Scientific Journal Video about Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes at JoVE.com

Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

Bu protokol, boyalar, ayarlanabilir bir çözünürlüğe sahip, sağlam sinir ağları gibi kobay enterik sinir sistemi plexuses gibi optik kayıt sağlayan elektriksel aktivitenin ne kadar voltaj duyarlı göstermektedir ki, tek hücrelerden çok ganglion devre arasında değişmektedir.

Gerilim duyarlı Boyalar kullanarak Gine domuzu Enterik Ağları Elektrik Faaliyet Optik Kayıt

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons ...

optical-recording-electrical-activity-guinea-pig-enteric-networks

Research

JoVE Journal

Biology

9.9K Görüntüleme.  University of Pennsylvania-School of Medicine. Bu protokol, boyalar, ayarlanabilir bir çözünürlüğe sahip, sağlam sinir ağları gibi kobay enterik sinir sistemi plexuses gibi optik kayıt sağlayan elektriksel aktivitenin ne kadar voltaj duyarlı göstermektedir ki, tek hücrelerden çok ganglion devre arasında değişmektedir.

Video: Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biyoloji

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Mikroskop Uygun Bakım ve Temizlik

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Faz Kontrast ve Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Mikroskopi

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of almost all intracellular signaling. Moreover, they play an important role in environmental adaptation and drug treatment, and are often involved in disease pathogenesis and pathology (1). Protein-protein interactions are intrinsic to signaling pathways, and to gain more insight in these complex biological processes, sensitive and reliable methods are needed for studying cell surface proteins. Two-dimensional (2-D) electrophoresis is used extensively for detection of biomarkers and other targets in complex protein samples to study differential changes. Cell surface proteins, partly due to their low abundance (1 2% of cellular proteins), are difficult to detect in a 2-D gel without fractionation or some other type of enrichment. They are also often poorly represented in 2-D gels due to their hydrophobic nature and high molecular weight (2). In this study, we present a new protocol for intact cells using CyDye  DIGE Fluor minimal dyes for specific labeling and detection of this important group of proteins. The results showed specific labeling of a large number of cell surface proteins with minimal labeling of intracellular proteins. This protocol is rapid, simple to use, and all three CyDye DIGE Fluor minimal dyes (Cy 2, Cy 3 and Cy 5) can be used to label cell-surface proteins. These features allow for multiplexing using the 2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (2-D DIGE) with Ettan  DIGE technology and analysis of protein expression changes using DeCyder  2-D Differential Analysis Software. The level of cell-surface proteins was followed during serum starvation of CHO cells for various lengths of time (see Table 1). Small changes in abundance were detected with high accuracy, and results are supported by defined statistical methods.

A simple and specific method was demonstrated for fluorescent labeling and enhanced detection of cell surface proteins without a fractionation step. Differential abundance in cell surface proteins was analyzed using two-dimensional (2-D) electrophoresis and Ettan&#x2122; DIGE technology.

Hücre yüzey Proteinlerin CyDye Dige Fluor Minimal Boyalar kullanarak Seçici Etiketleme

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

Plazmid kökenli Uygulama Kimyasal Reaksiyon Ağları için DNA Strand Deplasman kapıları

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase synthesis using standard phosphoramidite chemistry. Oligonucleotides are post-synthetically labeled by two new photostable cyanine dyes using copper-catalyzed click-chemistry. The synthesis of both donor and acceptor dye is described and is performed in three consecutive steps. With the DNA as the surrounding architecture, these two dyes undergo an energy transfer when they are brought into close proximity by hybridization. Therefore, annealing of two single stranded DNA strands is visualized by a change of fluorescence color. This color change is characterized by fluorescence spectroscopy but can also be directly observed by using a handheld ultraviolet (UV) lamp. The concept of a dual fluorescence color readout makes these oligonucleotide probes excellent tools for molecular imaging especially when the described photostable dyes are used. Thereby, photobleaching of the imaging probes is prevented, and biological processes can be observed in real time for a longer time period.

Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.

Işığa siyanin boyası kullanarak Dalgaboyu değiştiren DNA Hibridizasyon Sondalar Sentezi

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Hazırlama ve Optik Koherens Mikroskobu Kullanımı In Vivo Kalp Fonksiyonu Boyuna Görüntüleme (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Divergence of Root Microbiota in Different Habitats based on Weighted Correlation Networks

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, which can effectively explore the interaction relationship or co-occurrence model of different microbial species in different environments. The purpose of this manuscript is to provide details on how to use the weighted correlation network algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in microbial communities due to different ecological environments. All analysis of the experiment is performed in the WGCNA package. WGCNA is an R package for weighted correlation network analysis. The experimental data used to demonstrate these methods were microbial community data from the NCBI (National Center for Biotechnology Information) database for three niches of the rice (Oryza sativa) root system. We used the weighted correlation network algorithm to construct co-abundance networks of microbial community in each of the three niches. Then, differential co-abundance networks among endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil were identified. In addition, the core genera in network were obtained by the "WGCNA" package, which plays an important regulated role in network functions. These methods enable researchers to analyze the response of microbial network to environmental disturbance and verify different microbial ecological response theories. The results of these methods show that the significant differential microbial networks identified in the endosphere, rhizoplane and rhizosphere soil of rice.

Network analysis was applied to evaluate the association of various ecological microbial communities, such as soil, water and rhizosphere. Presented here is a protocol on how to use the WGCNA algorithm to analyze different co-occurrence networks that may occur in the microbial communities due to different ecological environments.

Ağırlıklı Korelasyon Ağlarına Dayalı Farklı Habitatlarda Kök Mikrobiyotasının Ayrışması

The root microbiome plays an important role in plant growth and environmental adaptation. Network analysis is an important tool for studying communities, ...