Ulm Üniversitesi ve SciMedia Ltd (Tokyo, Japonya), Newcastle Üniversitesi, Fen Bilimleri, Tarım ve Mühendislik Fakültesi Bilgisayar Bilim ve School destek kabul etmiş sayılırsınız.

1. Yengeç Stomatogastric Sinir Sistemi Hazırlanması Yetişkin Kanser pagurus L. (10 - 12 ° C) yerel kaynaklardan elde edilen (Newcastle Üniversitesi, Deniz Laboratories Dove) ve filtrelenmiş gazlı deniz suyu tutuldu. Diseksiyonu 40 dakika önce - Hayvanlar 20 buz ambalaj anesteziye edildi. Biz izole stomatogastric sinir sistemi (STNS 1) kullanılır. Soğutulmuş tuzlu su (10-13 ° C) - STNS (12 mg / dak 7) silikon elastomer kaplı (Elastosil RT-601, Wacker, Münih, Almanya) Petri kabı tutturulmuş ve sürekli superfused oldu. MgCl 2, 26; CaCl 2, 13; KCl, 11, trisma baz, 10 maleik asit, 5 NaCl, 440: serum fizyolojik (mMol * L-1) oluşuyordu. 13 ° C ve pH 7.4 - 7.6 Saline 11, sabit bir sıcaklıkta tutuldu. STNS diseksiyon ve hazırlık stomatoastric ganglion (STG) desheathing dahil olmak üzere ayrıntılı adımlar, vallahi Guttierez ve Grashow 1 makalede sunulmuştur. Bütün deneyler, 24 Kasım 1986 (86/609/EEC) ve Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi uyarınca yürütülmüştür. Şekil 1A ve Şekil 1B STNS bir şema, nöronlar ganglion arka kısmı düz bir yarım daire olarak düzenlenmiş olan tipik bir desheathed STG gösterir. Modelleme kil ile; STNS Petri kabı görüntüleme mikroskobu (Olympus, Tokyo, Japonya BW51 WI) işletim platformu sabittir. Her ikisi de, mikroskop sahne ve mikroskop optik kayıt sırasında hareket eserler önlemek için (Scientifica, Uckfield, Birleşik Krallık) bir titreşim izole masanın üzerine monte edilir. Stomatogastric ganglion (STG) üretilen motor desenlerini ekstrasellüler kayıtları kullanarak 2-4 izlenmektedir. Bu aşağıdaki adımları izleyin aracılığıyla yapılır: <ol><li> Vazelin tabanlı bir silindirik bölmesi, ana motor sinir (LVN) banyo (Petri kabı görüntüleme mikroskop işletim platformu üzerinde yerleştirilmeden önce bu diseksiyon aşamada yapılır sinir elektriksel olarak izole etmek için bir bölüm etrafında inşa edilmiştir .) </li><li> Bir, iki paslanmaz çelik elektrot tellerin diğeri bir referans elektrot olarak banyo, bu bölmeye yerleştirilir. </li><li> Diferansiyel sinyali kaydedildi süzülmüş ve bir AC diferansiyel amplifikatör (Univ. Kaiserslautern, Almanya) ile yükseltilir. </li><li> Ganglion motor aktivite, bir osiloskop (DL708E; Yokogawa, Tokyo, Japonya) kullanılarak takip edilir ve ayrıca bir veri toplama kartı (CED Güç, 1401, Cambridge Elektronik Tasarım, Cambridge, Birleşik Krallık) ve Spike 2 6.10 kullanılarak kaydedilen yazılımı (Cambridge Elektronik Tasarım, Cambridge, UK). Files Spike 2 6.10 (Cambridge Elektronik Tasarım, Cambridge, UK) kullanılarak analiz edilmektedir. </li></ol> 2. Boya Çözüm hazırlanması Biz, olumlu akım darbeleri kullanarak Mikroelektronlar ile boya yükleme kolaylaştıran bir çift pozitif yüke sahip floresan, voltaj duyarlı boya Di-8-ANEPPQ (Bioscience Cambridge) 5, kullandı. Boya çözüm, mümkün olduğu kadar çok ışık korunmalıdır. Boya çözüm şu şekilde hazırlanır: <ol><li> Boya 5 mg 1 ml, DMSO (Invitrogen) çözümü F-127 Pluronic asit ile karıştırılır. </li><li> Çözünmüş boya içeren plastik flakon Sigma Mikrosantrifüj 1-14 devir / dakika (Sigma, Osterode, Almanya) mikroelektrot tıkayabilir büyük boya parçacıkları ayırmak için 12.000 &#39;den az 20 dakika süreyle santrifüj. </li><li> Boya çözüm supernatant (üst 200 mcL) bir pipet ile ayrılmış ve ayrı bir plastik şişe içinde saklanır. Her ikisi de şişeleri Işığa maruz kalmasını önlemek için alüminyum folyo ile sarılır. </li><li> Boya çözüm -20 ° C&#39;de dondurulmuş </li><li> Önce boya çözüm kapalı ve sarılı flakon 10-15 dakika süreyle sıcak (25 ° C) su koyarak eritilir. </li></ol> 3. Hücre içi enjeksiyon kullanarak Sharp Mikroelektronlar Boya Yükleme Biz boya ile nöronların yüklemek için keskin Mikroelektronlar kullandı. MiCAM02 görüntüleme sistemi (SciMedia, Tokyo, Japonya) 6 kullandığımız boya yükleme kontrol etmek için. HS kamera görüntüleme sistemi, iki adet CCD kamera: İK kamera 1,4 ms olan en iyi temporal çözünürlük ile daha iyi uzaysal çözünürlüğü sağlayarak, daha büyük bir sensör çipi (6,4 mm x 4,8 mm), küçük bir (2,9 mm x 2,1 mm), ancak iyi temporal çözünürlük olarak 0,7 ms daha hızlı görüntüleme sağlayan hızlı sensör çipi. Boya yükleme adımları aşağıdaki gibidir: <ol><li> Mikroelektronlar ile çekilmiş bir P-97 Flaming - Brown (Sutter Instruments, Novato, CA, USA), 10 cm uzunluğunda kullanarak elektrot çektirme, filament (GB100TF 8P, Bilim Ürünler, Hofheim, Almanya) ile 1 mm dış çaplı cam tüpler. Elektrotlar, bir direnç çekti25 aralık - 40 MOhm 3M KCl (elektrot çektirmenin üreticisi tarafından sağlanan uygun çekerek parametre ayarları pipet yemek kitabı takip için). </li><li> Dondurulmuş boya çözüm erimiş ve bunun çok küçük bir miktar Microfil iğne (Microfil - 34g, Dünya Hassas Aletler, Sarasota, FL, USA) - emdi emdi boya 2 / 3 &#39;üncü Microfil iğne etrafında doldurur . </li><li> Boya çözüm Microfil iğne, bir mikroelektrot ucu içine enjekte edilir. Mikroelektrot 15 dakika boyunca karanlık bir kutu yerleştirilir. </li><li> Mikroelektrot 3M KCl çözeltisi ile yeniden toprakla. Elektrot, başka bir 10-20 dakika sonra boya çözüm mikroelektrot hareket kılcal kuvvet emme elektrot ince ucu ulaşmak için izin karanlık bir elektrot saklama kutusu içine yerleştirilir. </li><li> Hazır mikroelektrot, bir elektrot tutucu yerleştirilir ve hücre içi amplifikatör (IA-251A, Warner Instruments Corporation, Hamden, CT, ABD) üzerine headstage sabittir. </li><li> Intrasellüler amplifikatör mikroelektrot akım darbeleri sürücüye bir darbe sinyali sağlar veri toplama kuruluna bağlıdır. </li><li> Mikroelektrot mikroelektrot manipülatör (PatchStar Scientifica Ltd Uckfield, İngiltere) kullanarak bir STG nöronun membran içine yavaşça yerleştirilir. 10x objektif çalışma mesafesi (UMPLFL10XW, NA 0.30, WD 3.3mm; Olympus Corporation, Tokyo, Japonya) bu yana görüntüleme mikroskop çok küçük mikroelektrot, eğik bir pozisyonda konumlandırılmış (yaklaşık 30 °) ve hareket edilmelidir doğru pozisyonda içine mikroelektrot mikroskop amacı yeniden odaklanma ve hareketli mikroelektrot birkaç adım gerektirir. Mikroelektrot başlatmak için ucu STG üzerinde olduğu gibi bir konuma taşınır. Mikroskop objektif, elektrot ucu odak görünene kadar indirilir. Sonra daha da düşürdü ama mikroelektrot dokunmak kadar değil. Mikroelektrot objektif odak yeniden görünene kadar indirilir. Bu adımlar, nöronlar objektif odak düzlemi açıkça ortaya çıkıncaya kadar tekrarlanır. Sonra bu dokunuşlar ve nazik bir şekilde seçilen STG nöron membranı deler kadar mikroelektrot indirilir. Bu osiloskop kullanılarak izlenebilir. </li><li> Intrasellüler elektrot nöron verilen faaliyet profili ve faaliyet ve ekstrasellüler elektrot 2,3,7 kaydedilen STG aktivite arasındaki ilişkiyi belirlemek amacıyla seçilen STG nöron aktivitesini kaydetmek için kullanılır. </li><li> Intrasellüler amplifikatör mevcut enjeksiyon moduna açıldığında ve 30 dakika 1 saniye için son mikroelektrot içine enjekte 1 saniye boşluklar ile ayrılmış olduğunu mikroelektrot içine pozitif geçerli adımları nA 10 enjekte etmek için kullanılır. Kaydedilen nöron içine enjekte güncel sürücüler, pozitif yüklü boya molekülleri. Donanımları mevcut ise aynı anda birden fazla nöron enjekte edilebilir. </li><li> Enjeksiyon dönemi içine enjeksiyon bitiminden sonra on dakika nöron içinde boya yayılmasını kontrol edilir. Filtre küp MSWG2 aracılığıyla, (Bunu yapmak için ultra-düşük dalgalanma halojen ışık kaynağı (Moritex, Tokyo, Japonya HL-151), 10x objektif ve aydınlatma MiCAM02 görüntüleme sistemi (SciMedia Ltd, Tokyo, Japonya) 480-550 nm eksitasyon filtresi; Olympus Corporation, Tokyo, Japonya). Görüntüleme sistemi, 192 x 128 piksel çözünürlük, 40 ms görüntüleme zaman, &#39;hbin&#39; modu ve görüntü oturum başına 10 kare ile İK kamera kullanmak üzere ayarlayabilirsiniz. Boya dolum başarılı olursa, mikroelektrot konum etrafında nöron görüntüleme boyalı yama göstermeli ve bu boyalı yama ve 30 dakika sonra 10 dakika sonra çekilen görüntüler arasında büyümek gerekir. 30 dakika sonra boyanın yayılması yeterli değilse, daha fazla enjeksiyon süresi verilir. Alternatif olarak, yeni bir boya elektrodu kullanılıyor olabilir. </li><li> Elektrot nöron çıkardı ve nöron en az 20-30 dakika dinlenmek için bırakılır. Bu süre içinde, bir sonraki nörona boya ile enjekte edilebilir. </li></ol> 4. Boyalı Nöronlar görüntüleme Tek nöron aktivitesini boya dolum işlemden sonra görüntülü olabilir. Alternatif olarak iki veya daha fazla nöron görüntü birkaç STG nöronların eş zamanlı aktivite dolu olabilir. Prensip olarak, çok sayıda ve büyük olasılıkla tüm STG nöronlar boya ile dolu olabilir. Nöron görüntüleme İK kamera kullanarak MICAM 02 görüntüleme sistemi ile yapılır. Görüntüleme prosedürü aşağıdaki gibidir: <ol><li> Mikroskop amacı değişti ve yüksek ışık iletim verimliliği 20x objektif (XLUMPLFL20XW/0.95, NA 0.95, WD 2.0mm; Olympus Corporation, Tokyo, Japonya) görüntüleme veri toplama için kullanılır. Bu hedef, 10x objektif ve de nöronların daha ayrıntılı görüntü sağlayan yüksek büyütme veren çok daha fazla ışık toplar. Bein<html> küçük miktarda boya yükleme zaten biz görüntüleme boya ile nöronların neden olabilecek potansiyel fotoğraf hasarı azaltmak için daha düşük ışık yoğunluğu da bu amaç ve görünür olduğunu g daha verimli ışık anlamına gelir. </li><li> Mikroskop işletim aşaması görüntülü olması gerekiyordu nöronların objektif görüş alanında olan ve amacı üzerine odaklanmıştır böyle bir konuma sahiptir. </li><li> Ekstraselüler kayıt verileri de MICAM 02 görüntüleme sistemi, analog giriş kanalı yoluyla beslenir. Bu analiz aşaması optik sinyalleri ve buna karşılık gelen motor desen veya ekstraselüler kaydedilen ani nispeten kolay ilişkin sağlar. </li><li> MICAM 02 sistemi, 2.2 ms görüntüleme süresi ya da 1,5 ms görüntüleme süresi ile 48 x 32 piksel çözünürlük ile 96 x 64 piksel çözünürlük kullanmak üzere ayarlayabilirsiniz. Her iki durumda da nöronların boyama çok güçlü değilse &#39;hbin&#39; ayarı kullanılabilir. </li><li> Işık seviyesi fotoğraf modülasyon ve kaydedilen nöronların foto hasarı önlemek için mümkün olduğu kadar düşük (yani nöronların boya hala görüntüleme için yeterli floresan oluşturmak gerekir) olarak ayarlanır. </li><li> Oda aydınlatma ve geriye kalan tüm ışık kaynakları kapatılır. Buna ek olarak, dış kaynaklardan gelen ışığa maruz önlemek için kayıt teçhizat etrafında siyah bir perde kapatılır. </li><li> 16 saniye uzunluğunda - görüntüleme oturumları 4 arasında ayarlanır. </li><li> Çeşitli görüntüleme oturumda boyalı nöronların spontan aktivitesi kaydedilir. </li></ol> 5. Optik Görüntü Veri Analizi MICAM 02 görüntüleme sistemi ile ilgili; görüntüleme verileri analiz etmek BVAna yazılımı (SciMedia Ltd, Tokyo, Japonya sürüm 10.08). Görüntüleme veri görselleştirme yazılımları destekler ve analiz araçlarının yanı sıra bir dizi sağlar. Veri analizi ve yorumlama adımları aşağıdaki gibidir: <ol><li> Kaydedilen her nöron ilgi uygun bir dairesel bölge seçilir. Genelde biz 2 - 3 nöronlar, 48 x 32 piksel çözünürlükte ve 6 araştırmak için ilgi piksel yarıçapı bölgeler - 96 x 64 çözünürlükte nöronlar soruşturma ilgi 8 piksel yarıçapı bölgelerde. </li><li> Verilerin geçici yumuşatma boya veri floresan (düşük arka plan değeri nispeten düşük miktarda üretir Bu durum, özellikle gerekli olabilir; kullanılan ışık seviyesi düşük ya da düşük seviyede boya yükleme nedeniyle olabilir, örneğin neurite kaydedilen nöron). Genellikle bu gibi durumlarda biz 3 zamansal yumuşatma - 5 zaman birimi. </li><li> Optik kayıtların yanı sıra biz de ekstraselüler kayıt ekranını görüntüleme sistemi analog giriş görüntülemek için seçerek. </li><li> Bilgisayar ekranında tüm kayıtları görmek için, optik veri ve analog giriş görselleştirme için parametreler uygun şekilde ayarlanması gerekir. </li><li> Nöronlar, LVN ekstraselüler kayıt ve önceki hücre içi kayıt dayalı nöron sınıflandırma optik kayıtları göz önüne alındığında, nöron kimliğini belirlemek ve kaydedilen sinirsel faaliyetleri için faaliyet ilişkilendirmek mümkün. sinir. </li><li> Optik kayıtları açıkça gösteriyor ki, beklenen ve gerek kalmadan çok benzer olaylar, ekstraselüler kaydedilen ani ve aynı zamanda, diğer nöronların aktivitesi ile oluşan inhibitör post-sinaptik potansiyeller gibi eşik altı olaylar karşılık gelen sinirsel faaliyetleri üzerinde ortalama. </li><li> BVAna yazılım veri ihracat özellikleri, ilgi seçilen bölge ve aynı zamanda LVN kayıt içeren analog giriş için hesaplanan optik kayıtları ihracat kullanılabilir. Ihraç veri işleme ve diğer veri analiz yazılımı (örneğin basit durumda, Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, ABD) ek görselleştirme ve veri işleme için kullanılan olabilir) kullanılarak analiz edilebilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 2 iki nöron (PD, pilorik dilatör nöron LP, lateral pilorik nöron) eş zamanlı kayıt LVN kayıt ile birlikte STG bir yengeç pilorik merkezi desen jeneratör gösterir. Intrasellüler kayıtları esas alınarak belirlenen LP ve PD nöronların optik kayıtları gösteriyor ki, LP ve PD nöronların ilgili ekstrasellüler kayıtları ile de gerçekten bu maç. Ganglion ve ekstraselüler kayıt sitesi arasında aksonal iletim gecikmesi nedeniyle tutarlı bir başak zirvelerinden optik ve LVN kayıtları arasında 12 ms gecikme (bkz. Şekil 2 iç) vardır. Sunulan veriler de açıkça saptanabilir kaydedilen nöronların ani karşılık soma nöral aktivitenin olduğunu gösterir. s/ftp_upload/2567/2567fig1.jpg &quot;alt =&quot; Şekil 1 &quot;/&gt; Şekil 1 A) stomatogastric sinir sistemi (STNS) şematik. Cog, commissural ganglion, RG, özofagus ganglion; STG stomatogastric ganglion; stn, stomatogastric sinir; LVN, lateral ventriküler sinir. B) yengeç stomatogastric ganglion (STG) - görüntü STG nöronların posterior semisirküler düzenleme gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2567/2567fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 LVN kayıt ile birlikte PD tek bir süpürme Eşzamanlı kayıt ve LP nöron. Veri ve optik sinir kayıtları çok iyi maç olduğunu ve sinir forma kaydedildi ani gelen sinirsel faaliyetleri belirlemek olduğunu gösterir. Optik ve elektriksel olarak kaydedilerek faaliyetler arasındaki maç gösteren ve ortalama hem optik ve elektriksel olarak kaydedilen içerlek bir bindirme LP aksiyon potansiyelleri çeşitli tarama gösterir. Optik kayıt yöntemi biz de 14 PD ve LP nöronlar için karakteristik yavaş membran potansiyel değişiklikleri kaydetmek için veri düşük frekanslı bileşenlerini süzmek olmadığı gerçeği nedeniyle.

<ol>
	<li>Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+borealis+stomatogastric+nervous+system+dissection.">Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Bartos, M., Nusbaum, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercircuit+control+of+motor+pattern+modulation+by+presynaptic+inhibition.">Intercircuit control of motor pattern modulation by presynaptic inhibition.</a> J. Neurosci. 17, 2247-2256 (1997).</li><li>Blitz, D. M., Nusbaum, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+pattern+selection+via+inhibition+of+parallel+pathways.">Motor pattern selection via inhibition of parallel pathways.</a> J Neurosci. 17, 4965-4975 (1997).</li><li>Stein, W., Smarandache, C. R., Nickmann, M., Hedrich, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+consequences+of+activity-dependent+synaptic+enhancement+at+a+crustacean+neuromuscular+junction.">Functional consequences of activity-dependent synaptic enhancement at a crustacean neuromuscular junction.</a> J Exp Biol. 209, 1285-12300 (2006).</li><li>Loew, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potentiometric+dyes:+Imaging+electrical+activity+of+cell+membranes.">Potentiometric dyes: Imaging electrical activity of cell membranes.</a> Pure &#38; Appl Chem. 68, 1405-1409 (1996).</li><li>Tominaga, T., Tominaga, Y., Yamada, H., Matsumoto, G., Ichikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+optical+signals+with+electrophysiological+signals+in+neural+activities+of+Di-4-ANEPPS+stained+rat+hippocampal+slices.">Quantification of optical signals with electrophysiological signals in neural activities of Di-4-ANEPPS stained rat hippocampal slices.</a> J Neurosci Meth. 102, 11-23 (2000).</li><li>Heinzel, H. G., Weimann, J. M., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+behavioral+repertoire+of+the+gastric+mill+in+the+crab,+Cancer+pagurus:+an+in+situ+endoscopic+and+electrophysiological+examination.">The behavioral repertoire of the gastric mill in the crab, Cancer pagurus: an in situ endoscopic and electrophysiological examination.</a> J Neurosci. 13, 1793-1803 (1993).</li><li>Zecevic, D., Wu, J. -. Y., Cohen, L. B., London, J. A., H&#246;pp, H. P., Falk, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hundreds+of+neurons+in+the+Aplysia+abdominal+ganglion+are+active+during+the+gill-withdrawal+reflex.">Hundreds of neurons in the Aplysia abdominal ganglion are active during the gill-withdrawal reflex.</a> J Neurosci. 9, 3681-3689 (1989).</li><li>Briggman, K. L., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dedicated+and+multifunctional+neural+circuits+generating+distinct+behaviors.">Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors.</a> J Neurosci. 26, 10925-10933 (2006).</li><li>Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-systems+approach+to+motor+pattern+generation.">A small-systems approach to motor pattern generation.</a> Nature. 417, 343-350 (2002).</li><li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs.">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Ann Rev Physiol. 69, 291-316 (2007).</li><li>Grillner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+pattern+generation:+the+cellular+and+computational+logic+of+networks+in+motion.">Biological pattern generation: the cellular and computational logic of networks in motion.</a> Neuron. 52, 751-766 (2006).</li><li>Yuste, R., MacLean, J. N., Smith, J., Lansner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cortex+as+a+central+pattern+generator.">The cortex as a central pattern generator.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 477-483 (2005).</li><li>Stein, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+stomatogastric+rhythms.">Modulation of stomatogastric rhythms.</a> J Comp Physiol A. 195, 989-1009 (2009).</li></ol>

Elektrofizyoloji geleneksel yöntemler (hücre içi ve dışı elektrot kayıtları) ile birlikte nöronlar STG voltaj duyarlı boya görüntüleme 8,9, bu küçük, çok iyi bilinen ve hala karmaşık sinir sistemi çalışır gelişmiş bir anlayış sağlar . STG merkezi desen jeneratör (CPG) nöron ağları 10, 11, böylece daha iyi bir anlayış STG ortaya çıkan fonksiyonel özellikleri aynı zamanda genel olarak nasıl anlamak için yardımcı olacaktır (pilorik ve mide değirmen ritim ağları dahil olmak üzere) bir prototip . CPG ağları ağ seviyesi işlevselliği oluşturur. CPG ağlar ve aynı zamanda yüksek bilişsel işlevler 13 motor kontrolü 12 kritik bir rol oynamaktadır, dolayısıyla onların acil özelliklerinin daha iyi anlaşılması sinirbilimin birçok alanda önemli bir etkisi olabilir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>MiCAM02</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SciMedia Ltd, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Imaging system</td>
</tr>
<tr>
<td>BVAna v.10.08</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SciMedia, Tokyo, Japab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Data analysis software for the MiCAM 02 imaging system</td>
</tr>
<tr>
<td>HL-151</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Moritex, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ultra-low ripple halogen light source</td>
</tr>
<tr>
<td>BX51 WI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upright microscope for epifluorescence imaging</td>
</tr>
<tr>
<td>20x imaging objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>XLUMPLFL20XW/0.95</td>
<td>NA 0.95, WD 2.0mm</td>
</tr>
<tr>
<td>10x imaging objective </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>UMPLFL10XW</td>
<td>NA 0.30, WD 3.3mm</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter cube with 480-550 nm excitation filter and 590nm emission filter </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td>
<td>MSWG2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Antivibration table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientifica Ltd, Uckfield, UK</td>
<td>63-534</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PatchStar electrode manipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientifica Ltd, Uckfield, UK</td>
<td>PS-7000C</td>
<td>Micro-electrode manipulator</td>
</tr>
<tr>
<td>CED Power 1401</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Data acquisition board</td>
</tr>
<tr>
<td>DL708E Oscilloscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Yokogawa, Tokyo, Japan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intracellular amplifier</td>
</tr>
<tr>
<td>AC differential amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>University of Kaiserslautern, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Extracellular amplifier</td>
</tr>
<tr>
<td>P-97 Flaming &#x2013; Brown type electrode puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electrode puller</td>
</tr>
<tr>
<td>Sigma Microcentrifuge 1-14</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma, Osterode, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Centrifuge</td>
</tr>
<tr>
<td>Genex Pipettors Mline</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td>
<td>PIP7774</td>
<td>PIP7774</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass micropipette with filament</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Science Products, Hofheim, Germany</td>
<td>GB100TF 8P</td>
<td>Glass for microelectrodes</td>
</tr>
<tr>
<td>MicroFil &#x2013; 34G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microfil needle</td>
</tr>
<tr>
<td>Spike 2 v6.10</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electrophysiology software</td>
</tr>
<tr>
<td>Di-8-ANEPPQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cambridge Bioscience Ltd, Cambridge, UK</td>
<td>BT61014</td>
<td>Fluorescent voltage sensitive dye</td>
</tr>
<tr>
<td>F-127 Pluronic Acid, DMSO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen, Paisley, UK</td>
<td>P-3000MP</td>
<td>Solvent</td>
</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>S9888</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>CaCl2 . 2H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>C3881</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>P3911</td>
<td>Crab saline component, electrolyte solution</td>
</tr>
<tr>
<td>MgCl2 . 6H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>M9272</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Trizma base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>T1503</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Maleic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma &#x2013; Aldrich, Poole, UK</td>
<td>M0375</td>
<td>Crab saline component</td>
</tr>
<tr>
<td>Elastosil RT-601</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Wacker, Munich, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lining of Petri dishes</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

optical imaging of neurons in the crab stomatogastric ganglion with voltage-sensitive dyes

Gerilim duyarlı boya görüntüleme nöron nöron ağları nasıl organize edilir anlamak için anahtar bir metodoloji ve katılan nöronların eş zamanlı aktivite nasıl ayrılmaz bir ağ işlevselliğini ortaya çıkmasına yol açar. Burada tespit desen üreten nöronların yengeç stomatogastric ganglion bu tekniğin uygulama metodoloji mevcut. Biz gerilim duyarlı floresan boya Di-8-ANEPPQ ile bu nöronların yükleme göstermek ve nasıl görüntü MiCAM02 yüksek hız ve yüksek çözünürlüklü CCD kamera görüntüleme sistemi kullanarak boya yüklü nöronların faaliyet göstermektedir. Biz MiCAM02 görüntüleme sistemi ile ilişkili BVAna görüntüleme yazılımı kullanarak kaydedilen görüntüleme verileri analiz göstermektedir. Yengeç stomatogastric ganglion birden fazla nöron detaylı bir faaliyetin eşzamanlı voltaj duyarlı boya görüntüleme ile birlikte geleneksel elektrofizyoloji teknikleri (hücre içi ve hücre dışı kayıtları) merkezi desen nasıl jeneratör sinir ağları çalıştığını anlamak için radikal yeni fırsatlar açar uygulanır.

Watch this Scientific Journal Video about Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes at JoVE.com

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Burada yengeç stomatogastric ganglion nöronlar detaylı aktivite, hızlı ve yüksek çözünürlüklü floresan voltaj duyarlı boya görüntüleme için bir metodoloji mevcut.

Gerilim duyarlı Boyalar ile Yengeç Stomatogastric Ganglion Nöronlar Optik Görüntüleme

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

optical-imaging-neurons-crab-stomatogastric-ganglion-with-voltage

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.9K Görüntüleme.  Ulm University. Burada yengeç stomatogastric ganglion nöronlar detaylı aktivite, hızlı ve yüksek çözünürlüklü floresan voltaj duyarlı boya görüntüleme için bir metodoloji mevcut.

Video: Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Nöromodülasyon ve Mitokondrial Ulaştırma: Uzun Süreleri içinde Hipokampal Nöronlar Canlı Görüntüleme

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Nörobilim

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Aksonlar, Dendrit ve Beyin Dilimleri Bireysel Nöron Dendritik Spine kaynaklanan voltaj duyarlı Boya Kaydı

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Floresan Boyalar Yetişkin Zebra balığı Retina Ganglion Hücreleri retrograd Etiketleme

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Optik Koherens tomografi: Fare retina Ganglion hücreleri Vivo içinde görüntüleme

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Gerilim duyarlı boya kullanarak beyin dilimleri geniş alan tek foton optik kayıt

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.