Biz işbirlikçileri nazik boyalar sağlamak için bu tekniğin ilk geliştirme yanı sıra Leslie M. Loew katıldı Knut Holthoff, Arthur Konnerth ve Marco Canepari minnettarız. NSF hibe IOS-0817969, NIH hibe NS068407 ve M136043 tarafından ve Yale Üniversitesi Nörobilim Kavli Enstitüsü tarafından desteklenir.

1. Ekipman Ayarı 1.1 Adım. Görüntüleme kurulum Voltaj duyarlı boya sinyallerini kayıt etmek anahtarı uygun kurulum tasarımıdır. Biz üç kamera ile donatılmış bir dik mikroskop (BX51WI Olympus veya Zeiss AxioExaminer) kullanın. Kurulum Nikon 60X/1.0 NA veya Zeiss 63X/1.0 NA su daldırma hedefleri kullanarak epi-floresan, geniş alan mikroskopisi modunda ikaz ışığı ile beyin dilimleri aydınlatıcı bireysel nöronlar için tasarlanmıştır. Bizim mikroskoplar bir titreşim izolasyonu tabloya cıvatalı ve motorlu hareketli aşamaları ile donatılmıştır. Her bir mikroskop üç kamera portu ile donatılmıştır. Bir kamera bağlantı noktası Video-mikroskopi (IR-1000, Dage MTI, ABD) kızılötesi DIC için standart bir yüksek uzaysal çözünürlüklü CCD kameraya sahiptir. İkinci kamera bağlantı noktası nispeten düşük uzaysal çözünürlüğü (80 x 80 piksel) ama olağanüstü dinamik aralık (14 bit) ve okunması son derece düşük hızlı veri toplama makinesi (20 kHz&#39;e kadar kare hızı) vargürültü (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). Için konfokal görüntüleri z yığınları toplamak için kullanılan bir iplik-disk konfokal tarayıcı (CSU-10, Yokogawa, Japonya) üzerine monte; üçüncü kamera bağlantı noktası yüksek uzaysal çözünürlüklü bir CCD kamera (PCO AG, Almanya PixelFly, 1392x1024 piksel) sahip lekeli hücrenin ayrıntılı morfolojik rekonstrüksiyonu. Bir frekans katlamalı diyot pompalı Nd: 532 nm (MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, Çin) de YVO4 sürekli dalga lazer (400 mW) yayan uyarma ışık kaynağıdır. Çekim (LS6; Vincent Associates) tarafından kapı 2 mm çapında lazer ışını arkasına diyafram doldurmayın için tasarlanmış bir tek portlu Epifloresans kondansatör (Fotonik GmbH, Gräfelfing KADAR, Almanya) aracılığıyla mikroskop birleştiğinde bir ışık kılavuzu yönlendirilir objektif ve nesne düzlemi Eşit aydınlatmalı yakınında sağlayabilir. Lazer ışını tarafından V m-görüntüleme maksimize etmek için geleneksel bir Xenon ark lambası yerine kullanılmaktadır: (1) bir tek renkli ex kullanılarakboya 9, 10, (2), bir yay-lamba ile elde edilebilir seviyesinin ötesinde uyarma ışığın yoğunluğunu arttırmak V m maksimize etmek için absorbsiyon spektrumu ve kırmızı kanat alıntı ışık. Uyarma ışığı 560 nm ve kaydedilmiş bir floresan ışık 610 nm bariyer filtre (a Schott RG610) geçirildi ve bir orta dalga boyuna sahip bir dikroik ayna tarafından hazırlama yansıtılmıştır. Işık yoğunluğundaki artış ve en iyiye yakın monokromatik uyarma dalgaboyu kullanımının kombine etkisi önceki ölçümleri 6 kıyasla yaklaşık 50 kat gerilim görüntüleme duyarlılığı dramatik bir gelişme oldu. 1.2 Adım. Üniforma aydınlatma için ayarlama Bir floresan slayt standart (yeşil uyarma / kırmızı salma) kullanın. CCD doymuş değil böylece lazer ışını yolu uygun nötral yoğunluk filtreleri takın. Yüzeyinde hedef Odakslayt. Lazer başlatıcısı objektif önünde kuvars ışık kılavuz alma ucunun konumunu ayarlayın ve elde etmek için epi-floresan kondenser üzerindeki uygun aktüatörleri kullanarak mikroskop bağlı ışık kılavuz çıktısı sonu konumunu ayarlamak merkezli ve üniforma görüş alanının aydınlatılması. 1.3 Adım. Titreşim gürültü belirleme Floresan kayar yüzeyi üzerinde bir küçük siyah mürekkep işareti koyun. Sürekli kayıt modunda NeuroCCD ile Tutanak ışık şiddeti. Siyah mürekkep işareti karanlık bir kenarında objektif odaklanın. 2 kHz kare hızında yaklaşık 100 msn için ışık yoğunluğu kaydedin. Üniform aydınlatılan alandan ve mürekkep işareti kenarındaki ~ 20 piksel arasında ışık alma ~ 20 piksel arasında kesirli ışık yoğunluğunu izleri (hızındaki / F) mekansal ortalama görüntüleyin. Yüksek kontrastlı kenarları piksel kayıtlarında aşırı gürültü titreşim gürültüsü yansıtırsistem. 1.4 Adım. Titreşim izolasyonu Bu deneysel kayıt koşullarına karşılaştırılabilir ışık şiddetlerinde atış gürültü altında bir seviyeye bir titreşim izolasyonu tablosunu kullanarak titreşimleri azaltmak için zorunludur. Görüntünün keskin kenar kapsayan piksel ışık yoğunluğundaki titreşim gürültü ihmal edilebilir kadar titreşim izolasyonu masa ayarlayın. Hareketli parçaları (mekanik panjurlar, fanlar) ile ekipmanlardan hiçbiri masaya monte edilebilir. Titreşim izole olmayan diğer bileşenlere bağlı masaya donanımdan gelen kabloların mikroskop mekanik titreşimlerin iletimi olmadığı gevşek öyle olmalı. 2. V m-Imaging için Uygun Nöron seçimi 2.1 Adım. Nöronların seçimi Standart prosedürlere göre beyin dilimleri olun. I tek tek sinir hücreleri EGFP ifade bir fare hattı kullanınfaiz. Bir dönen diske konfokal sistemi ile, dilim EGFP etiketli nöronlar görselleştirmek. Bozulmamış aksonal / dendritik ağaçları ile V m-görüntüleme için nöronlar seçin ve süreçlerin dilim yüzeyine paralel ve yakın çalışan. Akson ve ince dendritler, çoğunlukla, DIC mikroskop modunda görünür değildir çünkü bu wild-tip farelerde başarılı olamaz. 3. Voltaj duyarlı Boya ile yüklüyor Nöronlar 3.1 Adım. Yama pipet Dolum Elektrot konik 2/3 &#39;ü kadar yaklaşık 15 s için negatif bir basınç uygulayarak boya serbest hücre içi solüsyon ile ikinci ucu cam pipet yama doldurun. Uç boya serbest çözelti eşiğe artar ve önemli ölçüde sinyal gürültü oranı azalır dilim üzerine boya dökülme önlemek için gereklidir. Çözünmüş Membran geçirgenliği olmayan voltaj duyarlı boya JPW3028 içeren solüsyonu ile elektrot Back-dolguHücre içi çözelti (0.8 mM). JPW3028, hücre içi uygulama için en çok başarılı gerilim probu, yine mikroenjeksiyon için kullanılmak üzere yeterince çözünür su lipofilik stiril boyaların ANEP dizi iki kat bir pozitif yüklü bir analoğudur. Bu boya di-etil analog ve hemen hemen aynı özellikleri (voltaj-duyarlılık dahil olmak üzere) ve JPW1114 (bkz. Tablo 1) gibi ticari olarak temin edilebilir. Biz distile H 2 O 20 mM stok solüsyonu hazırlamak Stok çözelti 50 ul hacimde -20 ° C de donduruldu tutulur 0.8 mM nihai konsantrasyon boya için, stok solüsyonu 2 ul deney gününde hücre içi çözelti 50 ul içinde çözülür. Stok boya çözeltisi sabittir ve birkaç ay süreyle oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. Bu tükenene kadar Böylece, oda sıcaklığında bir 50 ul kısım tutun. 3.2 Adım. Hızlı bir giga-mühür Kurmak <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Patch daha önceden seçilmiş bir nöron ve 20-45 dakika süreyle tam hücreli yapılandırma soma bir somatik yama pipetle boya serbest difüzyona izin. Bu uç boya serbest çözelti miktarı küçük tutulabilir, böylece mümkün olduğu kadar hızlı bir mühür elde etmek için gereklidir. Elektrot boya kullanılmadan hızlı yama uygulayarak başlayın. Çevreleyen doku kirlenmesine olmadan uç boya içermeyen çözüm kullanarak az miktarda amacı ile boya ile İleri, uygulama yama ve yükleme nöronlar. Uygulama ile, 1-2 dk içinde bir mühür kurmak mümkündür. 3.3 Adım. Boyama düzeyinin izlenmesi Tam hücreli yapılandırmada boya difüzyon sırasında, akım-klemp modunda uyarılmış aksiyon potansiyelleri kaydederek nöronun fizyolojik durumunu izlemek. Ayrıca, 2 k bir kare hızında hücre soma gelen dinlenme ışık yoğunluğunu (RLI) kaydederek boyanma miktarını izlemek<html> Hz ve nötral yoğunluk filtreleri (biz bir 400 mW lazer lazer ışık şiddetinin% 0.04 kullanan) ile düzeltilmiş tam ışık şiddetinin bir kısmını. Aksiyon potansiyeli elektrot boyutu ve direnç bağlı olarak genellikle 20-40 dakika sonra, genişletmek başlayana kadar boya yükleme işlemi devam edin. Başak genişletilmesi tamamen geri dönüşümlü ve somatik membran boya doymuş konsantrasyonunun kapasitif yük etkisi nedeniyle büyük olasılıkla. Boya konsantrasyonu nöron boyunca dengelenmiş sonra başak dalga tam olarak geri kazanılır. 3.4 Adım. Boya elektrot çıkarın Dönem boyanma sonunda, dikkatli bir şekilde dış çıkış yama konfigürasyonu için tüm-hücre geçiş işleminde elde edilmesini sağlamak voltaj kelepçesi konfigürasyonda soma uzağa yama pipet çekin. 3.5 Adım. Boya difüzyon bekleyin ent &quot;&gt; nöronal işlemleri içine yaymak için voltaj duyarlı boya için izin vermek üzere, oda sıcaklığında ilave 1.5-2 saat için inkübe dilim. aksonal ve dentritik süreçleri, dalga içine soma uzak boya difüze önemli bir miktarda sonra AP tamamen restore edilmiştir. 4. Optik Kayıt 4.1 Adım. Görüntüleme için hücresel bir bölme seçin Düşük ışık seviyeli floresans ve yeniden yama DIC altında bir standart (hayır boya) yama elektrot ile nöron altında lekeli nöronun soma bulun. Voltaj görüntüleme için CCD sürekli kayıt modunda 10-40 Hz kare hızı düşük ışık seviyesinin altında nöronal süreçleri gözünüzde canlandırın. Ilgi nesnesi görselleştirmek için gerekli minimum nötral yoğunluk filtreleri ile ışık seviyesini azaltın. Biz lekeli nöronun konumlandırma sırasında 400 mW lazer yoğunluğu 0.01% kullanabilirsiniz. Bir XY tablası kullanma, t ilgi nöronal süreci konumlandırmakgörüntüleme alanının ortasına diye. Mikroskop kısmen kapalı alana durak iris kullanarak uyarma ışık soma koruyun. Yüksek yoğunluklu uyarma ışık soma Koruyucu anlamlı kayıt sırasında fotodinamik hasarı azaltacaktır. Membran potansiyeli transientler ilgili 4.2 Tutanak optik sinyalleri Adım Bireysel dendritik dallarında backpropagated AP&#39;ler ilgili optik sinyalleri kaydedin. Akson AP&#39;ler ilgili optik sinyalleri kaydedin. Dendritik dikenler aplar backpropagating ilgili optik sinyalleri kaydedin. Sinyali dalga doğru rekonstrüksiyonu için uygun kare hızları kullanın ve ağartma boya ve fotodinamik hasarı en aza indirmek için kayıt dönemleri ve yüksek yoğunluklu uyarma ışığa maruz kalma mümkün olduğunca kısa tutun. Örneğin, akson tek aksiyon potansiyeli oluşumu ve ilerlemesi sırasını inceleyerek 5-10 msn kayıt süreleri gerektirir. Uyarma ışık yoğunluklarıkayıt sırasında lik bir taraftan, sinyal-gürültü oranı ve boya ağartma derecesi ve diğer taraftan fotodinamik hasarı arasında bir uzlaşmadır. Biz çapı 300 mikron bir alan aydınlatılır aksonların uzun bölümler arasından kayıt 400 mW lazer yoğunluğu% 100 kullanmaktır. Uyarma ışık dendritik omurga görüntüleme için 30 mikron çaplı alana odaklandığı zaman, biz lazer ışık yoğunluğunu% 10-25 oranında kullanın. Kayıt gerekli süresinin optimum uyarma ışık yoğunluğu önemli bir belirleyicisi olduğunu; kısa kayıt süreleri daha yüksek ışık yoğunluğuna izin verir. Optimal ışık yoğunluğu en her bir hazırlama ve ölçüm ayarları için ampirik olarak belirlenir. 5. Veri Analizi 5.1 Adım. Bilinen hatalar için ham verileri düzeltin Verilerin analizi ve gösterimi IDL (ITT Görsel Bilgi Solut yazılmış NeuroPlex programı (RedShirtImaging) kullanılarak yapılmıştıriyonları, Boulder, Colorado) ve özel bir Visual Basic yordamları. Düşük ışık koşulları altında, arka plan floresan hızındaki / F sinyalinin büyüklüğü önemli bir belirleyici olmaktadır. Ham veriler öncelikle dilim üzerinde bir boyanmamış alan belirlenen ortalama floresan yoğunluğu arka plan çıkarılması ile bu etki için düzeltilmiştir. Daha sonra, sinyal hizalama yazılım AP başlatma bölgesindeki zamansal kaymayı yanı sıra ortalama sırasında hazırlanması için olası küçük hareketleri için düzeltmek için kullanılmıştır. Zamansal etki alanında, AP sinyallerinin ortalama başlangıç ​​(Şekil 1B) iktisap referans sinyali her denemede elektriksel olarak kaydedilerek AP çapraz korelasyon hale getirilmiştir. Mekansal etki alanında, görüntülerin hazırlanması olası küçük yanal hareketleri telafi etmek için görüntü çapraz korelasyon iki boyutlu çevrimdışı hizalanmış edildi. Z-boyut görüntünün doğru odaklama her duruşma öncesinde doğrulandı; smal<html> l ayarlamalar çoğu zaman gerekli idi. Şekil 1B &#39;de gösterildiği gibi uzaysal ve zamansal olarak hizalanmış sinyalleri ortalamaları alınmıştır. Boya ağartma dolayı ışık yoğunluğundaki değişiklik yavaş yok uyarım (Şekil 1B) ile kayıt çalışmalardan elde edilen uygun bir çift üstel fonksiyon tarafından veri bölünmesi ile düzeltilmiştir. AP sinyalin dalga Kübik Spline İnterpolasyon, her veri noktası üzerinden geçen bir parçalı sürekli eğrisi kullanarak veri noktaları bir dizi yeniden inşa edildi. Voltaj-duyarlı boya sinyali milisaniye ölçeğinde önemli bir bozulma olmadan zar potansiyeli parça olduğunu doğrulamak için, soma elde edilen elektrik sinyali AP Şekil 3B &#39;de gösterildiği gibi bitişik akson tepecik ikinci optik sinyalin AP ile karşılaştırılmıştır. Iki sinyal optik kayıt atış gürültü için izin, çok yakından üst üste. les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Veri analizi (Animasyon). (A) Üst panel: Kayıt pozisyonunda akson ile lekeli bir nöronun yüksek çözünürlüklü konfokal görüntü. Kayıt elektrot soma ve şematik olarak gösterilmiştir bazal dendrit yanındaki ekstraselüler uyarıcı elektrot bağlı. Aksiyon potansiyelleri ekstraselüler, sinaptik uyarılması tarafından uyarılmış. Alt panel:. V m görüntüleme için kullanılır (B) soma (siyah iz) den Elektrot kayıtları, AIS (kırmızı iz) dan optik kayıtları ve Ranvier düğümü (yeşil iz) den CCD ile elde akson düşük uzaysal çözünürlüğü floresan görüntü . Üst izleri: AP başlamasında zamansal jitter gösteren 9 çalışmalarda elde edilen ham veriler. Izleri İkinci sıra: zamansal sinyalleri hizalanır. Izleri Üçüncü satır: ortalamalı sinyali. Izleri Dördüncü satır: bleach düzeltme. Alt izleri: zamansal yumuşatma tek geçişe sahip kübik spline interpolasyon.

<ol>
	<li>Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+recording+from+mossy+fiber+terminals+in+hippocampal+slices.">Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices.</a> Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).</li><li>Cohen, L. B., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+measurement+of+membrane+potential.">Optical measurement of membrane potential.</a> Ann. Rev. Neurosci. 1, 171-182 (1978).</li><li>Cohen, L. B., Canepari, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Historical+overview+and+general+methods+of+membrane+potential+imaging.">Historical overview and general methods of membrane potential imaging.</a> Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).</li><li>Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+signals+from+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons+during+coincident+pre-+and+post-synaptic+activity:+a+combined+voltage-+and+calcium+imaging+study.">Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study.</a> J. Physiol. 580, 463-484 (2007).</li><li>Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D., Canepari, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+submillisecond+membrane+potential+changes+from+individual+regions+of+single+axons,+dendrites+and+spines.">Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines.</a> Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).</li><li>Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage+imaging+from+dendrites+of+mitral+cells:+EPSP+attenuation+and+spike+trigger+zones.">Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones.</a> J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).</li><li>Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+time-course+of+action+potentials+in+spines+and+remote+dendrites+of+mouse+visual+cortical+neurons.">Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons.</a> J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).</li><li>Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+initial+segment+Kv1+channels+control+axonal+action+potential+waveform+and+synaptic+efficacy.">Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy.</a> Neuron. 55, 633-647 (2007).</li><li>Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+of+Stark-shift+voltage-sensing+dyes+by+one-+or+two-photon+excitation+near+the+red+spectral+edge.">High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge.</a> Biophysical J. 87, 631-639 (2004).</li><li>Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+characterization+of+electrochromic+membrane+probes.">Design and characterization of electrochromic membrane probes.</a> J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).</li><li>Loew, L., Canepari, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+use+of+organic+voltage+sensitive+dyes.">Design and use of organic voltage sensitive dyes.</a> Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).</li><li>Palmer, L. M., Stuart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site+of+action+potential+initiation+in+layer+5+pyramidal+neurons.">Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons.</a> J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).</li><li>Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatio-temporal+characteristics+of+action+potential+initiation+in+layer+5+pyramidal+neurons:+a+voltage+imaging+study.">The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study.</a> J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).</li><li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+absorption,+fluorescence,+dichroism,+and+birefringence+in+stained+giant+axons:+optical+measurement+of+membrane+potential.">Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential.</a> J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).</li><li>Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+action+potential+initiation+in+neocortical+pyramidal+cells:+evidence+from+whole+cell+axon+recordings.">Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings.</a> J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).</li><li>Wu, J. -. Y., Cohen, L. B., Mason, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+multisite+optical+measurement+of+membrane+potential.">Fast multisite optical measurement of membrane potential.</a> A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. , 389-404 (1993).</li><li>Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dendritic Spines. , (2010).</li></ol>

Dejan Zecevic o LLC RedShirtImaging bir eş sahibi., Voltaj duyarlı boya kayıt kullanılan yüksek hızlı, düşük gürültü CCD kameralar konusunda uzmanlaşmış bir şirket olduğunu beyan eder. Diğer tüm yazarlar hiçbir mali çıkarlarının veya geçerli çalışma ile ilgili potansiyel çıkar çatışmaları rapor.

Bu makalede, alt-mikrometre ve alt milisaniyelik zamanmekansal çözünürlük ile bireysel nöronların elektriksel aktivitesini izlemek için bir voltaj duyarlı boya kayıt yöntemi açıklanır. Yakın optimum dalgaboyu (sinyal boyutu ile ilgili) de Lazer uyarılma ~ 50 önceki yaklaşımlar üzerinde bir faktör tarafından kayıt hassasiyeti artırıldı. Yürürlükteki duyarlılık dendritler, akson, akson teminatlar ve akson terminallerinin yanı sıra bireysel dendritik dikenler dahil bireysel nöronlar, her y...

<table border="1"><tbody><tr><td> Bileşenin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Kurulum bileşenleri </td></tr><tr><td> Upright Mikroskop </td><td> Olympus A.Ş. </td><td> BX51WI </td><td> Üç kamera yuvaları ile </td></tr><tr><td> Motorlu Hareketli Sahne </td><td> Siskiyou </td><td> MXOPi.2 </td><td></td></tr><tr><td> Olympus BX51 için Epi-floresans Kondenser </td><td> Fotonik KADAR </td><td> 0000-560-11659 </td><td></td></tr><tr><td> Upright Mikroskop </td><td> Carl Zeiss, LLC </td><td> AxioExaminer D1 </td><td> Üç kamera yuvaları ile </td></tr><tr><td> Motorlu Üst Plaka </td><td> Scientifica Sınırlı </td><td> MMBP </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Zeiss AxioExaminer için Epi-floresans Kondenser </td><td> Fotonik KADAR </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Veri Toplama Makinesi </td><td> RedShirtImaging LLC </td><td> NeuroCCD-SM </td><td> Yüksek hız, düşük okuma sesi </td></tr><tr><td> IR-DIC için CCD </td><td> Dage-MTI </td><td> IR-1000 </td><td></td></tr><tr><td> İplik-Disk Konfokal Tarayıcı </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-10 </td><td></td></tr><tr><td> Konfokal Tarayıcı Yüksek Uzaysal Çözünürlük CCD </td><td> PCO AG </td><td> PixelFly </td><td> 1392x1024 piksel </td></tr><tr><td> DPSS CW Lazer (532 Nm) </td><td> CNI Optoelektronik Tech. Co, Ltd </td><td> MLL-III-532 400mW </td><td> Uyarma ışık kaynağı </td></tr><tr><td> Multi-Mode Fiber Launcher </td><td> Siskiyou </td><td> SM-CFT </td><td></td></tr><tr><td> Işık Kılavuzu </td><td> Fotoğraf KADARNIC </td><td> 0000-515-11524 </td><td></td></tr><tr><td> Panjur </td><td> Vincent Associates </td><td> LS6 </td><td></td></tr><tr><td> Titreşim İzolasyonu Tablo </td><td> Eksi k Teknolojisi </td><td> MK26 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Belirli reaktifler </td></tr><tr><td> Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> D-6923 </td><td> Gerilimi hassas boya </td></tr><tr><td> Crym-EGFP Fare Hattı </td><td> GENSAT (MMRRC) </td><td> STOK Tg (Crym-EGFP) GF82Gsat/Mmcd </td><td> Seyrek Katman 5 kortikal nöronlarda EGFP ifade </td></tr></tbody></table>

voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices

Biyofiziksel özellikleri ve tek nöronların fonksiyonel organizasyon anlama ve nasıl işlem bilgileri beynin nasıl çalıştığını anlamak için esastır. Herhangi bir sinir hücresinin temel işlevi, genellikle birden fazla kaynaktan gelen elektrik sinyalleri, işlemek için. Nöronal süreçlerin elektriksel özellikleri detaylı ölçümler yokluğunda tahmin etmek için olağanüstü, kompleks dinamik ve genel durumda, imkansızdır. Biri olur böyle bir ölçüm elde etmek için, ideal, onlar nöronal süreçleri ve aksiyon potansiyeli inisiyasyon etkileme belirli yerlerde summate ilgili menşe sitelerinden giderken, birçok bölgeden, eşikaltı olayları izlemek edebilmek istiyorum. Bu hedef elektrotlar istihdam ölçümleri teknik sınırlamaları nedeniyle herhangi bir nöron elde edilmemiştir. Bu dezavantajı ortadan kaldırmak için, bu geniş paralel recordin izin görüntüleme teknikleri ile yama elektrot yaklaşımı tamamlayıcı çok arzulanan bir durumdurBir nöronun her yerinden gs. Alt-milisaniye ve alt-mikrometre çözünürlük ile karakterize - Organik voltaj duyarlı boyalar (V m-görüntüleme) ile membran potansiyeli Transientlerin optik kayıt - İşte, biz böyle bir tekniği tanımlar. Bizim metodumuz voltaj duyarlı moleküler problar 2 öncü çalışmalarına dayanmaktadır. İlk teknolojinin birçok yönü sürekli onlarca yıl 3, 5, 11 den fazla geliştirilmiştir. Ayrıca, daha önceki çalışmaları V m-görüntülemenin iki temel özellikleri belgelenmiştir. Öncelikle, floresan sinyalleri tüm fizyolojik aralığı (; 10, 14, 16 +100 mV -100 mV) üzerinde membran potansiyeli doğrusal orantılıdır. İkincisi, burada kullanılan voltaj duyarlı boya (JPW 3028) ile yükleme nöronlar saptanabilir farmakolojik etkisi yoktur. Kaydedilen boya yükleme sırasında başak genişletilmesi, 7 4 tamamen düzelir. Buna ek olarak, deneysel kanıtlar elde etmenin mümkün olduğunu göstermektedirherhangi bir tespit fototoksik etkilerini 4 öncesinde kayıt önemli bir sayısını (yüz), 6, 12, 13. Şu anda, biz V m-görüntüleme tekniğinin hassasiyetini maksimize etmek için yakın uygun dalga boyunda bir lazer ışık kaynağı parlaklık ve istikrar yararlanmak. Yürürlükteki duyarlılık akson ve akson teminatlar, terminal dendritik dalları ve bireysel dendritik dikenler içeren bir nöronun her yerinden gelen V m Transientlerin birden fazla site optik kayıtları verir. Sinyal etkileşimleri Elde edilen bilgiler, aynı zamanda, bir film şeklinde doğrudan doğruya görselleştirildiği gibi nicel olarak analiz edilebilir.

Başarılı konfokal mikroskopi dilim yüzeyine yakın ve odak bir düzlemde bulunan bozulmamış nöronal süreçleri net bir şekilde belirlenmesi izin vermelidir. Önce voltaj duyarlı boya yükleme gerilim görüntüleme için uygun olan sinir hücrelerinin seçimi önemlidir. Kortikal bir dilim (Crym transjenik fare çizgisi) olarak ifade EGFP L5 piramidal nöronların konfokal görüntüleri bir örneği, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Bireysel nöronların akson açıkça görülebilir. Dilim ...

Watch this Scientific Journal Video about Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices at JoVE.com

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Alt-mikrometre mekansal ve alt milisaniyelik zamansal çözünürlüğe sahip membran potansiyeli değişiklikleri izleme için bir görüntüleme tekniği tarif edilmiştir. Gerilim karşı hassas boyaların lazer uyarma göre yöntem, aksonların ve akson kollateral, terminal dendritik dalları, ve bireysel dendritik omurga sinyallerin ölçümleri sağlar.

Aksonlar, Dendrit ve Beyin Dilimleri Bireysel Nöron Dendritik Spine kaynaklanan voltaj duyarlı Boya Kaydı

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

voltage-sensitive-dye-recording-from-axons-dendrites-dendritic-spines

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K Görüntüleme.  Yale University School of Medicine. Alt-mikrometre mekansal ve alt milisaniyelik zamansal çözünürlüğe sahip membran potansiyeli değişiklikleri izleme için bir görüntüleme tekniği tarif edilmiştir. Gerilim karşı hassas boyaların lazer uyarma göre yöntem, aksonların ve akson kollateral, terminal dendritik dalları, ve bireysel dendritik omurga sinyallerin ölçümleri sağlar.

Video: Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Nörobilim

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

Gerilim duyarlı Boyalar ile Yengeç Stomatogastric Ganglion Nöronlar Optik Görüntüleme

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Kültür Hipokampal Nöronlar Dendritik Spine Floresan Takip edilen Proteinler Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Morfolojik analiz Drosophila</emGenetik Mozaikler> Larvaların Periferik Duyusal Nöron Dendritler ve Aksonlar

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Transgenik Balık Sağlam Beyin Tespit Edilen nöronlar Elektrik Aktivitesi Kayıt

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Yapısal Aydınlatma Mikroskobu kullanılarak Rat İlköğretim hipokampalinden Dentritik Spine görüntüleme

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Lamprey Reticulospinal Aksonlar Akut Ayrılma Bireysel Fonksiyonel Presinaptik Terminalleri Yayın Yüz Membranından Kayıt Enable

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.