Bu çalışma NSF 1257923 ve NIH 1U01NS10837 tarafından desteklendi. Yazarlar Jean Wang'ın laboratuvardaki yardımını kabul etmek istiyor.

NOT: Aşağıda özetlenen iş akışı Şekil 2'de özetlenmiştir.
1. Titreşimi en aza indirin
<ol><li>Mümkünse, makinenin zemin katta olduğundan emin olun ve hava tablolarından daha geniş bir titreşim frekansı aralığını sönümleyen yay tabanlı bir izolasyon masası kullanın.</li>
	<li>Yay tabanlı bir tablo kullanıyorsanız, kayan olduğundan emin olun (her bir şey ekleniyorsa veya tablodan çıkarılıyorsa ayarlanması gerekir).</li>
	<li>Gerekirse görüntüleme sırasında hava akışını kapatacak ölçüde bile görüntüleme odasındaki titreşim tabanlı gürültüyü mümkün olduğunca azaltın. Perfüzyon sistemlerinde sıvı türbülansından kaynaklanan titreşimleri en aza indirin. NOT: Sinirsel hazırlık, satın alma sırasında hareket etmemelidir. Her türlü hareket, diyotlar boyunca kontrast kenarlarının kaymalarını üreterek artitsel sinyallere yol açtı. Prosedür satın alma sırasında bir uyaran içeriyorsa, hazırlık hareketini teşvik etmemelidir.</li>
</ol>2. Ganglion fotoğraflarının PDA verileriyle uygun hizalanmasını sağlamak için bir iğne deliği testi çalıştırın
<ol><li>Mikroskop kaydırağı üzerine 3 küçük delikli bir alüminyum folyo parçası yerleştirin. Parfokal fotoport'una monte edilmiş dijital kamera ile üç deliğin görüntüsünü alın.</li>
	<li>PDA ile birlikte gelen görüntüleme yazılımını kullanarak kısa bir dosya (ör. 5 sn) haline alın. Satın alma işleminin bir parçası olarak, pim deliklerinin kenarlarında çok görünür olacak titreşim yapıtlarını teşvik etmek için tabloya dokunun ve iğne deliklerinin görüntüsünün optik verilerle tam olarak hizalanabilmesini sağlar.</li>
	<li>Görüntüleme yazılımında ÜstYükleme işlevini kullanma, menü öğesinde bulunan "| görüntüle Sayfa Üst | Dış Görüntü | Üst Üste Bindirme Görüntüsü," diyot verilerini iğne deliklerinin fotoğrafına bindirmek ve ardından iğne delikleri diyot verilerindeki iğne deliği yapıtlarının tam üstüne oturana kadar fotoğraf için x, y ve büyütme ayarlarını yinelemeli olarak ayarlayın.<ol>
<li>Kamerayla çekilen hazırlık görüntülerini gelecekteki deneylerde diyot verileriyle hizalamak için bu sayıları kaydedin. NOT: PDA'nın iğne deliği hizalamasının, PDA mikroskop üzerine monte edildikten sonra, döndürülene veya çıkarılana kadar sadece bir kez yapılması gerekir, bu sırada tekrar yapılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Üç deniz gastropod türü için diseksiyonlar
<ol><li>Tritonia ve Aplysiagibi büyük boyuta büyüyen türler için, daha ince, daha az opak gangliyonlara sahip daha küçük bireylerle başlayın ve optimum sinyal-gürültü için yeterli ışık elde etmeyi kolaylaştırın.</li>
	<li>Diseksiyonlar ve görüntüleme deneyleri için tuzlu su olarak kullanılmak üzere hazır filtrelenmiş yapay deniz suyuna sahip olun. NOT: Protokolün sonraki tüm adımlarında "salin" yapay deniz suyunu ifade eder.</li>
	<li>Tritoni diomedinin diseksiyonu
	<ol>
<li>Bir hayvanı uyuşturmak için buzdolabına yaklaşık 20 dakika yerleştirin.</li>
		<li>Daha büyük hayvanlar için, hayvanı bir elinde tutarak beyni açığa çıkararak, başın ucunun "boynu" ortaya çıkarmak için baş ucunun baş ucunun baş parmağın üzerine örtülmasına izin verin. Daha küçük hayvanlar için, beyni açığa çıkarmadan önce sırtlarını balmumu kaplı bir diseksiyon kabına sabitle.</li>
		<li>Diseksiyon makası kullanarak, hayvanın dorsal tarafında, bukkal kütlenin üzerinde (vücut duvarından hissedilebilen) 3-4 cm orta çizgi kesiği yapın. NOT: CNS'nin kaynaşmış, bilateral serebropleural ve pedal gangliyonundan oluşan gerekli kısmı turuncudur ve çevre dokudan belirgindir; hemen rinoforların posterior ve bukkal kütlenin üzerinde uzanır.</li>
		<li>Hayvanın vücudunu içselleştiren sinirleri, sert ve mikrodiseksiyon makası kullanarak keserek CNS'yi genişletin, merkezi gangliyasyonu birbirine bağlayan tüm sinirleri sağlam tutun. Uzun bir pedal siniri 3 (PdN3) veya hangi sinir uyarılacaksa bırakın.</li>
		<li>Daha fazla diseksiyon için CNS'yi tuzlu su dolu elastomer kaplı bir yemeğin altına yapıştırmak için minutien pimleri kullanın. Peristaltik bir pompa kullanarak geri bildirim kontrollü, sıralı Peltier soğutma sistemi ile verilen salin ile yemeği perfüzyona sokarak hazırlık sıcaklığını 11 °C'de koruyun.</li>
		<li>Peripler ve mikrodiseksiyon makası kullanarak, bağ dokusunun gevşek yapışkan tabakasını CNS çevresinden dikkatlice çıkarın. İnce kılıfa gangliyona sıkıca bağlı bırak.</li>
		<li>Kısaca (~10 s) gangliyonu salin içinde% 0.5 glutaraldehit çözeltisi içine batırın. Gangliyonu salin perfüzyonlu elastomer kaplı yemeğe geri yerleştirin, böylece salin VSD boyamaya başlamadan önce glutaraldehiti yıkamasını sağlar. NOT: Bağ dokusunun ve iç kaslarının bu ışık düzeltmesi, görüntüleme sırasında hareketi önlemeye yardımcı olacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>Aplysia californica diseksiyonu
	<ol>
<li>Yaklaşık 40 g'lı bir hayvanı, 350 mM MgCl2'nin ~20 mL'lik kısmını ventral yüzeyden (ayak) vücuda enjekte ederek uyuşturun.</li>
		<li>Hayvan ventral tarafını balmumu kaplı bir diseksiyon kabına yerleştirmek için pimleri kullanın.</li>
		<li>Diseksiyon makası kullanarak, ayağın en ön kısmı boyunca 2-3 cm orta çizgi kesiği yapın. CNS ve bukla kütlesinin bir kısmını ortaya çıkarmak için ayağın kapaklarını kesiğin her iki tarafına sabitle. NOT: CNS'nin kaynaşmış serebral gangliyon ve yakından uygulanmış, bilateral plevral ve pedal gangliyonundan oluşan ihtiyaç duyulan kısmı sarı-turuncudur ve çevre dokudan belirgindir; soğanlı kaslı bukuzal kütleye dorsal ve posterolateral oturur.</li>
		<li>Beyin gangliyonlarını ortaya çıkararak buktal kütleyi dikkatlice parçalamak için emiş ve diseksiyon makası kullanın.</li>
		<li>Hayvanın vücudunu içselleştiren sinirleri, sert ve mikrodiseksiyon makası kullanarak keserek CNS'yi genişletin, merkezi gangliyasyonu birbirine bağlayan tüm sinirleri sağlam tutun. Uzun bir pedal siniri 9 (PdN9) veya hangi sinir uyarılacaksa bırakın.</li>
		<li>CNS'yi tuzlu su dolu elastomer kaplı bir tabağa yerleştirmek için minutien pimleri kullanın. Yemeği bir Peltier soğutma cihazından geçen salinle perfüzyon yaparak hazırlık sıcaklığını 15-16 °C'de koruyun.</li>
		<li>Tokmaklar ve mikrodiseksiyon makası kullanarak, CNS'den aşırı bağ dokusunu çıkarın ve görüntülenecek ganglion veya gangliyon üzerindeki kılıfın yüzeysel bir kısmını parçalara çıkarın. Bu işlem sırasında kılı daralarda bir delik açmamaya dikkat edin, bu da nöronların içinden dökülmesine neden olur.</li>
		<li>Kısaca (~20 s) gangliyonu salin içinde% 0.5 glutaraldehit çözeltisi içine batırın. Gangliyonu salin perfüzyonlu elastomer kaplı yemeğe geri yerleştirin, böylece salin VSD boyamaya başlamadan önce glutaraldehiti yıkamasını sağlar.</li>
	</ol></li>
	<li>Berghia stephanieae'nin diseksiyonu
	<ol>
<li>Bir hayvanı uyuşturmak için buzdolabına yaklaşık 20 dakika yerleştirin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında salinle dolu elastomer kaplı bir tabak kullanarak, minutien pimlerini hem kafaya hem de kuyruğa yerleştirin.</li>
		<li>Mikrodiseksiyon makası kullanarak, CNS'ye yüzeysel olarak 5-7 mm sırt kesisi yapın. NOT: Gözler, CNS'nin yanında hayvanın içinde bulunan koyu lekeler, çift taraflı olarak kaynaşmış serebropleural ve pedal gangliyonlarından oluşan ve bukkal kütlenin üzerine oturan gerekli porsiyon CNS'nin konumunu uygun bir şekilde işaretler.</li>
		<li>Hayvanın vücudunu içselleştiren sinirleri, kümes hayvanları ve mikrodiseksiyon makası kullanarak keserek CNS'yi genişletin. Herhangi bir siniri bir emme elektrot için yeterince uzun süre uyarılmış bırakın.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Hazırlığı voltaja duyarlı bir boya ile lekelenin
<ol><li>RH155 (NK3041 olarak da bilinir) veya RH482 (NK3630 veya JPW1132 olarak da bilinir) stok çözümleri hazırlayın.<ol>
<li>RH155: 5,4 mg katı boyayı 1 mL%100 EtOH'da çözün, 34 mikrosantrifüj tüpünün her birine 29 μL pipetleme. Her tüpün içeriği havaya maruz kalarak, karanlıkta gece boyunca kurumasını bekleyin. Her biri 0,15 mg içeren RH155'in elde edilen katı aliquotlarını -20 °C dondurucuya kaplayın ve yerleştirin.</li>
		<li>RH482: 100 μL DMSO'da 2 mg katı boya çözün, çözeltiyi her biri 0,1 mg RH482 içeren 5 μL'lik 20 aliquot'a bölün ve -20 °C dondurucuda saklayın. NOT: Tritonia ve Aplysiaiçin, VSD RH155'i hazırlıktaki nöronların zarlarına yüklemek için banyo perfüzyonu veya basınç uygulaması kullanılabilir. Basınç uygulaması, sadece VSD'ye görüntülenmekte olan ganglionu açığa çıkarmak avantajına sahiptir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Banyo perfüzyonu için, yukarıdaki katı RH155 ve girdap aliquotlarının her ikisine 5 mL salin ekleyin ve 0.03 mg/ mL RH155 içeren 10 mL'lik birleşik bir çözelti üretin.<ol>
<li>Karanlıkta (fotobleaching önlemek için) Tritonia için 11 °C'de 1 ila 1,5 saat ve Aplysiaiçin 16 °C'de perfuse. Perfüzyon çözeltisini bir Peltier soğutma sisteminden geçirerek sıcaklığı koruyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Basınç uygulaması için, RH155'in bir aliquotuna 500 μL salin ve 0,3 mg / mL boya konsantrasyonu üretmek için girdap ekleyin.<ol>
<li>Çözeltinin yaklaşık 200 μL'lik kısmını el tipi bir mikrodispenser kullanarak polietilen boruya çizin, bu da tüp çapı ile lekelenecek ganglionun çapı arasında iyi bir eşleşme olmasını sağlayın.</li>
		<li>Tüpün ucunun hedef ganglionun üzerine dikkatlice yerleştirilmesi için bir mikromanipülatör kullanın, ganglion üzerinde rahat bir mühür oluşturana kadar küçümseyin. Gangliyayı istenen sıcaklıkta tutmak için yukarıda açıklanan soğutma sistemi türünü kullanın.</li>
		<li>Fotobleaching önlemek için oda ışıklarını karartın ve ganglion üzerine daha fazla boya zorlamak için mikrodispenser aplikatör topuzunu her 5 dakikada bir çevirin.</li>
		<li>İyi bir leke oluştuğunu onaylamak için 30 dakikada kontrol edin ve ardından yaklaşık 1 saat boyunca toplam boyama süresine devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Berghia'daboyama için, RH482'nin donmuş bir aliquot'una 1 mL salin ve çözünecek girdap ekleyin.<ol>
<li>Bu çözeltinin 200 μL'sini 800 μL salin ve girdap içeren bir mikrosantrifüj tüpüne çözeltiye aktarın ve % 0,1 DMSO ile salinde 0,02 mg/ml RH482'lik son bir boyama çözeltisi üretin.</li>
		<li>Tüm CNS'yi mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, fotobleachingi önlemek için tüpü alüminyum folyoya sarın ve yaklaşık 1 saat boyunca her 5-6 dakikada bir elle çalkalayın. İlk çözeltinin kalan 800 μL'lik kısmını buzdolabında saklayın ve sonraki preparatları lekelamak için 3 güne kadar kullanın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Hazırlığı düzleştirin ve sinir stimülasyonu için ayarlayın
NOT: Bu bölümdeki adımlar, fotobleachingi en aza indirmek için minimum aydınlatma altında veya yeşil ışıkla yapılmalıdır.
<ol><li>Lekelemeden sonra, CNS'yi görüntüleme odasındaki saline batırın ve bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.</li>
	<li>Görüntülenecek ganglion/ganglionun soluna ve sağuna silikon parçaları (Tritonya veya Aplysiaiçin) veya petrol jölesi damlalarını (Berghiaiçin) yerleştirin.</li>
	<li>Uygun büyüklükte bir cam parçasına veya plastik örtüye bastırın ve düzleştirin. Sıkıca bastırın, ancak nöronlara zarar vermek için çok sert değil. NOT: Preparatın dışbükey yüzeyinin bu şekilde düzleştirilmesi, daha fazla sayıda nöron parfokal yapacak, böylece kaydedilen nöron sayısını artıracak ve ayrıca görüntüleme sırasında preparatın hareketsiz hale getirilmesine yardımcı olacaktır.</li>
	<li>Fiktif bir motor programı ortaya çıkarmak için bir siniri uyarıyorsanız, ön ucu yaklaşık olarak sinir çapı kadar geniş olan bir emme elektrodu hazırlayın. Bunu, pe-100 polietilen borunun bir bölümünü bir alevin üzerinde dikkatlice eriterek ve boru segmentinin her iki ucunu hafifçe çekerek ve ardından elde edilen konik istediğiniz noktada keserek gerçekleştirin.<ol>
<li>Bir polietilen emiş elektrodunun konik ucundan küçük bir miktarda salin çekin, ardından uyarılacak sinirin ucunu, elektrodun arka ucuna kalın duvarlı, esnek polimer boru uzunluğu takarak ve negatif basınç uygulamak için ağız emme kullanarak.</li>
		<li>Elektrottaki salinin elektrik iletimini kesebilecek kabarcıklardan yoksun olduğunu doğrulayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Görüntüleme için hazırlık ve optimizasyon
<ol><li>Odayı görüntüleme kulesine taşıyın. Salin perfüzyonunu kayıt odasından başlatın ve sıcaklık probunu preparatın yakınına yerleştirin. Görüntülenebilen türler için istenen sıcaklık için sıcaklık denetleyicisini ayarlayın (Tritonya, 11 °C, Aplysia, 15-16 °C veya Berghia, 26-27 °C için).</li>
	<li>Bir klorlu gümüş teli emme elektrodundan aşağı yerleştirin, elektrottaki salinle temas ettiğinden emin olun ve diğer Ag-AgCl telini (dönüş yolu) emme elektroduna yakın banyo salinine yerleştirin.</li>
	<li>Su daldırma lensini salin içine 2007'den fazla alçaltın. Taban diyaframını kapatın ve ardından substage kondenserini kaldırın veya kıtır kıtır ve diyaframın kenarları keskin netleme olana kadar odağı ayarlayın ve Köhler aydınlatması oluşturun.<ol>
<li>Görüntülenecek hazırlığın bölgesine odaklanın. Daha büyük nöronlardan kaynaklanan optik sinyaller, odak dışında olsalar bile daha küçük nöronlara göre kaydedilme olasılığı daha yüksek olduğundan, daha büyük nöronlar üzerinde daha küçük nöronlara odaklanan önyargı.</li>
		<li>Parfokal dijital kamera ile görüntülenecek ganglionun fotoğrafını çekin.</li>
		<li>Kontrol paneli kazanç anahtarı 1x olarak ayarlanmışken, "RLI" düğmesine tıklayarak ve diyotların ortalama RLI'sınıkontrol ederek görüntüleme yazılımındaki dinlenme ışığı yoğunluğunu (RLI) inceleyin. Bir uyarıcıdan LED lamba güç kaynağına gönderilen voltaj seviyesini ayarlayın ve ortalama RLI seviyesini istenen aralıkta (genellikle 3-4 V civarında) kontrol etmeye devam edin. NOT: PDA'da yaklaşık 3-4 V'ye karşılık gelen yüksek ILI'ler istenir. Işık ne kadar yüksek olursa, optik sinyallerin sinyal-gürültü oranı o kadar iyi olur, ancak bu, daha yüksek RLI'lerde daha hızlı bir fotobleaching oranına karşı dengelenmelidir. Yüksek NA objektif lensler kullanılarak bu risk en aza indirilür. Kullanılan suya daldırma objektif lensler 10x/0.6 NA, 20x/0.95 NA, 40x/0.8 NA ve 40x/1.15 NA'dır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kayıt için kontrol paneli kazanç anahtarını 100x olarak ayarlayın.</li>
	<li>Bir siniri uyarıyorsanız, istenen voltajı, frekansı ve süreyi ışık seviyesini ayarlamak için kullanılandan ayrı bir uyarıcıya ayarlayın. Kontrol paneli ve uyarıcı arasındaki TTL tetiklemesinin düzgün yapılandırıldığını onaylayın. NOT: Her türdeki örnek sinir uyaran parametreleri şunlardır: Tritonia PdN3, 2 s, 10 Hz nabız treni 5 ms, 10 V darbeler; Aplysia PdN9, 2.5 s, 5 ms 20 Hz darbeli tren, 8 V darbe; Bir Berghia pedal siniri, 2 s, 10 Hz nabız treni 5 ms, 5 V darbeler.</li>
	<li>Yay veya hava tablosunun yüzdüp yüzdüldüğünü iki kez kontrol edin.</li>
</ol>7. Optik kayıt
<ol><li>Tepegöz floresan aydınlatma da dahil olmak üzere oda ışıklarını kapatın veya karartın.</li>
	<li>İstediğiniz dosya süresini, yolu ve dosya adını ayarlayın ve ardından bilgisayarın kullanılabilir RAM kapasitesine kadar dosya almak için görüntüleme yazılımındaki "Veri Al" düğmesine tıklayın. Optik kayıt sırasında hareketsiz kalın, çünkü küçük titreşimler optik kayıt verilerine büyük eserler sokabilir. NOT: Bilgisayarın mevcut RAM'ini aşacak satın almalar için Georgetown Üniversitesi'nden Dr. Jian-young Wu aracılığıyla özel yapım bir C++ satın alma programı mevcuttur.</li>
	<li>Elde edildikten hemen sonra verileri görüntülemek için, görüntüleme yazılımındaki Superimpose işlevini kullanarak tüm 464 diyot tarafından toplanan verileri, hazırlık7'denönce çekilen ganglionun görüntüsü üzerine bindirmek için kullanın. Ayrı bir izleme ekranında kaydettiklerini genişletmek için yazılımda temsil edilen diyotlardan herhangi birine tıklayın.<ol>
<li>Daha önce iğne deliği testi tarafından belirlenen x, y ve büyütme faktörlerini girerek diyotların preparatla ilgili olarak tam hizalamasını elde edin.</li>
		<li>Eylem potansiyeli görünürlüğünü en üst düzeye çıkarmak ve sonraki ani sıralama14için nöron verimini artırmak için, hem düşük hem de yüksek frekanslı gürültüyü gidermek için 5 Hz ve 100 Hz kesmelere sahip bir bandpass Butterworth filtresi uygulayın (görüntüleme yazılımında mevcuttur).</li>
		<li>Filtre uygulanmış optik verileri bilimsel bir bilgi işlem platformunda daha fazla analiz için metin dosyası olarak kaydetmek için, önce görüntüleme yazılımındaki "Sayfa" ekranının hemen altındaki "TP filtresi" kutusunu seçin. Ardından, "Çıktı" sekmesinden "Sayfayı ASCII Olarak Kaydet" i seçin ve görüntülenen iletişim kutusuna istediğiniz dosya adını girin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miller, C. T., Hale, M. E., Okano, H., Okabe, S., Mitra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Principles+for+Next-Generation+Neuroscience.">Comparative Principles for Next-Generation Neuroscience.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13 (12), (2019).</li><li>Brenowitz, E. A., Zakon, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+from+the+bottleneck:+benefits+of+the+comparative+approach+to+modern+neuroscience.">Emerging from the bottleneck: benefits of the comparative approach to modern neuroscience.</a> Trends in Neuroscience. 38 (5), 273-278 (2015).</li><li>Bolker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+organisms:+There's+more+to+life+than+rats+and+flies.">Model organisms: There's more to life than rats and flies.</a> Nature. 491 (7422), 31-33 (2012).</li><li>Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+matters:+the+importance+of+comparative+studies+and+the+potential+for+synergy+between+neuroscience+and+evolutionary+biology.">Diversity matters: the importance of comparative studies and the potential for synergy between neuroscience and evolutionary biology.</a> JAMA Neurology. 69 (8), 987-993 (2012).</li><li>Chase, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Behavior and its neural control in gastropod molluscs. , (2002).</li><li>Salzberg, B. M., Grinvald, A., Cohen, L. B., Davila, H. V., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+neuronal+activity+in+an+invertebrate+central+nervous+system:+simultaneous+monitoring+of+several+neurons.">Optical recording of neuronal activity in an invertebrate central nervous system: simultaneous monitoring of several neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 40 (6), 1281-1291 (1977).</li><li>Frost, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Spiking+Activity+of+Many+Individual+Neurons+in+Invertebrate+Ganglia.">Monitoring Spiking Activity of Many Individual Neurons in Invertebrate Ganglia.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 859, 127-145 (2015).</li><li>Frost, W. N., Wang, J., Brandon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stereo-compound+hybrid+microscope+for+combined+intracellular+and+optical+recording+of+invertebrate+neural+network+activity.">A stereo-compound hybrid microscope for combined intracellular and optical recording of invertebrate neural network activity.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 148-154 (2007).</li><li>Frost, W. N., Wu, J. -. Y., Covey, E., Carter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dye+imaging.">Voltage-sensitive dye imaging.</a> Basic Electrophysiological Methods. , 169-195 (2015).</li><li>Brown, G. D., Yamada, S., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+component+analysis+at+the+neural+cocktail+party.">Independent component analysis at the neural cocktail party.</a> Trends in Neuroscience. 24 (1), 54-63 (2001).</li><li>Hill, E. S., Moore-Kochlacs, C., Vasireddi, S. K., Sejnowski, T. J., Frost, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+independent+component+analysis+for+rapid+spike+sorting+of+optical+recording+data.">Validation of independent component analysis for rapid spike sorting of optical recording data.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3721-3731 (2010).</li><li>Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+deconstruction+reveals+the+dynamical+and+physical+building+blocks+of+a+locomotion+motor+program.">Modular deconstruction reveals the dynamical and physical building blocks of a locomotion motor program.</a> Neuron. 86 (1), 304-318 (2015).</li><li>Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spiral+attractor+network+drives+rhythmic+locomotion.">A spiral attractor network drives rhythmic locomotion.</a> ELife. 6, 27342 (2017).</li><li>Hill, E. S., Bruno, A. M., Vasireddi, S. K., Frost, W. N., Naik, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICA+applied+to+VSD+imaging+of+invertebrate+neuronal+networks.">ICA applied to VSD imaging of invertebrate neuronal networks.</a> Independent Component Analysis for Audio and Biosignal Applications. , 235-246 (2012).</li><li>Jahan-Parwar, B., Fredman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+control+of+locomotion+in+Aplysia:+role+of+the+central+ganglia.">Neural control of locomotion in Aplysia: role of the central ganglia.</a> Behavioral and Neural Biology. 27 (1), 39-58 (1979).</li><li>Jin, W., Zhang, R. J., Wu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dye+imaging+of+population+neuronal+activity+in+cortical+tissue.">Voltage-sensitive dye imaging of population neuronal activity in cortical tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 115 (1), 13-27 (2002).</li><li>Neveu, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Configurations+of+Compression+and+Truncation+of+Neuronal+Activity+Underlie+l-DOPA-Induced+Selection+of+Motor+Patterns+in+Aplysia.">Unique Configurations of Compression and Truncation of Neuronal Activity Underlie l-DOPA-Induced Selection of Motor Patterns in Aplysia.</a> eNeuro. 4 (5), 17 (2017).</li><li>Cai, Z., Neveu, C. L., Baxter, D. A., Byrne, J. H., Aazhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+neuronal+network+functional+connectivity+with+directed+information.">Inferring neuronal network functional connectivity with directed information.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1055-1069 (2017).</li><li>Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Wang, J., Bruno, A. M., Frost, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+Formation+in+Tritonia+via+Recruitment+of+Variably+Committed+Neurons.">Memory Formation in Tritonia via Recruitment of Variably Committed Neurons.</a> Current Biology. 25 (22), 2879-2888 (2015).</li><li>Briggman, K. L., Abarbanel, H. D., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+neuronal+populations+during+decision-making.">Optical imaging of neuronal populations during decision-making.</a> Science. 307 (5711), 896-901 (2005).</li><li>Briggman, K. L., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dedicated+and+multifunctional+neural+circuits+generating+distinct+behaviors.">Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 26 (42), 10925-10933 (2006).</li><li>Tomina, Y., Wagenaar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+double-sided+microscope+to+realize+whole-ganglion+imaging+of+membrane+potential+in+the+medicinal+leech.">A double-sided microscope to realize whole-ganglion imaging of membrane potential in the medicinal leech.</a> ELife. 6, 29839 (2017).</li><li>Chang, P. Y., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+optimization+of+absorbance+and+fluorescence+signals+from+voltage-sensitive+dyes.">Interpretation and optimization of absorbance and fluorescence signals from voltage-sensitive dyes.</a> Journal of Membrane Biology. 196 (2), 105-116 (2003).</li><li>Parsons, T. D., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Raccuia-Behling, F., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+optical+recording+of+patterns+of+electrical+activity+in+ensembles+of+cultured+Aplysia+neurons.">Long-term optical recording of patterns of electrical activity in ensembles of cultured Aplysia neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 66, 316-333 (1991).</li><li>Katz, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+central+pattern+generators+and+rhythmic+behaviours.">Evolution of central pattern generators and rhythmic behaviours.</a> Transactions of the Royal Society of London, Series B. 371 (1685), 20150057 (2016).</li><li>Moroz, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiversity+Meets+Neuroscience:+From+the+Sequencing+Ship+(Ship-Seq)+to+Deciphering+Parallel+Evolution+of+Neural+Systems+in+Omic's+Era.">Biodiversity Meets Neuroscience: From the Sequencing Ship (Ship-Seq) to Deciphering Parallel Evolution of Neural Systems in Omic's Era.</a> Integrative and Comparative Biology. 55 (6), 1005-1017 (2015).</li><li>Frost, W. N., Tian, L. -. M., Hoppe, T. A., Mongeluzi, D. L., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+mechanism+for+prepulse+inhibition.">A cellular mechanism for prepulse inhibition.</a> Neuron. 40, 991-1001 (2003).</li><li>Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+neuronal+participation+in+stereotypic+motor+programs.">Variable neuronal participation in stereotypic motor programs.</a> PLoS One. 7 (7), 40579 (2012).</li><li>London, J. A., Zecevic, D., Cohen, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+optical+recording+of+activity+from+many+neurons+during+feeding+in+Navanax.">Simultaneous optical recording of activity from many neurons during feeding in Navanax.</a> Journal of Neuroscience. 7 (3), 649-661 (1987).</li><li>Wu, J., Cohen, L. B., Falk, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+during+different+behaviors+in+Aplysia:+A+distributed+organization.">Neuronal activity during different behaviors in Aplysia: A distributed organization.</a> Science. 263 (5148), 820-823 (1994).</li><li>Marder, E., North, G., Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+insight.">Searching for insight.</a> In Invertebrate Neurobiology. , 1-18 (2007).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Büyük ölçekli VSD görüntüleme yaklaşımımızı uygulamadaki en önemli ayrıntılardan biri, diyotlar boyunca kontrast kenarlarının hareketlerini üreten titreşimi en aza indirmek ve büyük yapısal sinyallerle sonuç vermektir. Absorbans VSD'leri eylem potansiyelleri ile ışık yoğunluğunda çok küçük yüzdeli değişiklikler ürettiğinden, titreşim eserleri, engellenmezse, ilginin nöronal sinyallerini gizleyebilir. Titreşim yapıtlarını en aza indirmek için çeşitli yöntemler kullanmaktadır. İlk olarak, görüntüleme odamız zemin katta yer almaktadır, bu da hazırlığı hava işleme ekipmanı ve diğer birçok kaynakla ilgili titreşimlerden izole eder. İkincisi, diğer PDA kullanıcılarının daha yaygın hava tablosu16'dandaha iyi titreşim sönümleme sağladığını onayladığı yay tabanlı bir izolasyon tablosu kullanıldı. Üçüncü olarak, yüzey dalgalanmalarından kaynaklanan görüntü dalgalanmalarını ortadan kaldıracak su daldırma hedefleri kullanılmıştır. Dördüncüsü, görüntülenen preparat, oda kapak alt kısmı ile silikon fişler veya petrol jölesi tarafından yerinde tutulan yukarıdan bastırılmış bir kapak parçası arasında hafifçe bastırılarak preparat daha da stabilize edildi. Bu aynı zamanda ganglion veya gangliyonun dışbükey yüzeyinin görüntülendiğini düzleştirerek, hedefin odak düzleminde daha fazla nöronla sonuçlanır ve bu da kaydedilen nöron sayısını arttırır.
Bir eylem potansiyelinden kaynaklanan VSD ışık emicilik derecesindeki çok küçük değişiklikler için sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için, PDA'ya hazırlık yoluyla neredeyse doygun ışığı elde etmek ve aynı zamanda boyanın fotobleachingini en aza indirmek önemlidir. Bu amaçla, genellikle 1x konumda PDA kontrol paneli kazanç anahtarı ile ölçüldüğü gibi 3-4 V dinlenme ışığı yoğunluğunda çalışırız (PDA'nın 464 amplifikatörü 10 V ışıkta doygunluğa sahiptir). Veri toplama sırasında bu kazanç faktörü 100x olarak değiştirilir. PDA tarafından ölçülen 3-4 V'ye ulaşmak için yeterli ışık almak çeşitli şekillerde gerçekleştirilebilir. İlk olarak, kullanılan emicilik boyasının emilim özelliklerine uygun bir dalga boyu sağlayan ultra uçucu bir LED ışık kaynağı kullanın. Buna göre, RH155 ve RH482'nin optimum emilim dalga boylarıyla örtüşen 735 nm LED kolimli lamba kullanıldı. İkincisi, gerekirse, LED ışık kaynağından daha küçük bir alana ışığı yoğunlaştırıcı bir flip-top substage kondenser kullanın. Üçüncü olarak, yüksek, hatta parlaklık ve maksimum görüntü kalitesi sağlayan Köhler aydınlatmasını elde etmek için kondenser yüksekliğini ayarlayın. Dördüncüsü, optik yolda LED lambanın 735-nm dalga boylarını hafifletebilecek ısı filtreleri olmadığından emin olun. Beşinci olarak, daha fazla ışık gerekiyorsa difüzörleri optik yoldan çıkarın. Altıncı olarak, yüksek uzamsal çözünürlük sağlayan ve daha düşük lamba yoğunluklarında PDA'ya yeterli ışık seviyelerinin ulaşmasını sağlayan yüksek NA hedeflerini kullanın. Bu, tüm dosyalarda aynı ışık yoğunluğunu kullanarak ve önemli bir sinyal genliği kaybı veya yeniden boyama ihtiyacı olmadan hazırlık başına 10-20 dakikalık birkaç alım dosyası elde edebileceğimiz ölçüde fotobleachingi en aza indirmemize izin verdi. En önemlisi, deneyci nöronları bu uzun dosyalar arasında izlemek istiyorsa, odak düzleminin değişmemesini ve hazırlığın hareket etmediğinden emin olun. Son olarak, PDA'ya yeterli ışığı yönlendirmenin ek bir yolu, daha ince ve dolayısıyla daha az opak gangliyona sahip daha genç hayvanları kullanmaktır.
Zaman zaman optik sinyallerin sinyal-gürültü oranının bozulduğunu ve/veya motor programı ritimlerinin yetersiz (örneğin, yavaş veya anormal) olduğunu görüyoruz. Bu tutarlı bir şekilde gerçekleşmeye başladığında, VSD'nin yeni çözümlerini karıştırıyoruz. VSD aliquots genellikle -20 °C dondurucuda yaklaşık 6 ay boyunca canlı kalır. İlgili olarak, Berghiaiçin şimdiye kadar emici VSD RH482 ile en iyi sonuçların elde edildiğini belirtmek gerekir. RH482, RH155'ten daha fazla lipofilik olduğundan, Berghia'nınnispeten daha küçük nöronlarını daha iyi lekeleyebilir veya bu tropikal türler için kullanılan daha yüksek kayıt salin sıcaklığında nöronal zarlarda daha etkili bir şekilde kalabilir.
Nöral aktivitenin PDA tabanlı görüntülenmesinin bir sınırlaması, 100x önamplifikasyon adımından önce donanımdaki voltaj sinyallerinin AC bağlantısı ile ilgilidir: bu, bu tekniğin gerektirdiği yüksek dinlenme ışığı seviyesinin ürettiği büyük DC ofsetini çıkarmak için gerekli bir özelliği temsil etse de, PDA'ya içsel olarak ac bağlantısı, membran potansiyelinde yavaş değişikliklerin ölçülmesine engeldir, sinaptik girişlerle ilişkili olanlar gibi. Yavaş veya sabit durumda potansiyel değişiklikler kaydetmek isteniyorsa, alt koruma etkinliğini yakalamak için DC bağlantılı bir CMOS kamera görüntüleme sistemi kullanılabilir. Byrne ve meslektaşları son zamanlarda Aplysia17,18buccal ganglion nöronların aktivitesini görüntüleyemek için RH155 ile böyle bir kurulum kullandılar. Her iki sistemi de kullandık ve CMOS kameranın, çok daha yüksek dedektör yoğunluğu (128 x 128) nedeniyle, aynı görüntüleme süresi için 50 kat daha büyük veri dosyaları ürettiğini gördük7. PDA'nın daha küçük dosyaları daha hızlı işleme ve analiz sağlar. Bu aynı zamanda genişletilmiş tek deneme kayıtlarına (Şekil 4) ve birden fazla denemeden elde edilen verilerin başak sıralamadan önce tek bir büyük dosyada birleştirilmesine izin veren öğrenme çalışmalarına olanak tanır ve öğrenme geliştikçe ağ organizasyonunun izlenmesini sağlar19.
Diğer kamera tabanlı araştırmalarda, floresan VSD'ler Kristan ve meslektaşları tarafından sülük segmental gangliyonunda ağ işlevini incelemek için kullanılmıştır. Etkili bir çalışmada bu, hayvanın yüzme veya emekleme kararında yer alan bir nöronun tanımlanmasına yol açtı20. Başka bir çalışmada, Kristan ve arkadaşları sülüklerin yüzme ve emekleme davranışlarının çok işlevli ve özel devreler tarafından ne ölçüde yönlendirilmelerini inceledi21. Daha yakın zamanda, Wagenaar ve meslektaşları, bir sülük segmental ganglion22'dekihemen hemen tüm nöronlardan kayıt yapmalarını sağlayan voltaj görüntüleme için iki taraflı bir mikroskop kullandılar. Birçok kamera tabanlı görüntüleme yönteminin aksine, PDA tabanlı görüntüleme yöntemimizin bir avantajı, sonuçların işlenmesi için nöronal sınırlar hakkında hiçbir karar içermeyen bir kör kaynak ayırma şekli olan ICA tarafından hızlı ve tarafsız ani sıralamadır.
VSD'lerin seçimi ile ilgili olarak, emici boyaların RH155 ve RH482'nin biravantajı,floresan VSD'ler için tipik olandan daha uzun kayıt süreleri sağlayan23,24ile ilişkili az veya hiç fototoksikliktir. Ayrıca, kullandığımız hızlı emici VSD'ler, gastropod preparatlarında genellikle genlikte 80 mV olan aşırı somatik eylem potansiyellerini kaydetmek için çok uygundur. Şekil 3G'degösterildiği gibi, optik yöntemimiz eylem potansiyeli az çekimlerini kaydedebilir (kayıtlarımızın hiçbiri izleme ortalamasına sahip değildir): bu, kullandığımız VSD'lerin bir dereceye kadar zayıflayan ve bu nedenle somaya ulaştıklarında aşırı çekim yapmayan diğer model sistemlerindeki eylem potansiyellerini ayırt edebilmesi gerektiğini göstermektedir. Bununla birlikte, optik yaklaşımımız soma'da kaydedildiğinde oldukça zayıflatılmış eylem potansiyelleri sergilediği bilinen türler için ideal olmayabilir.
Sinir ağları üzerine yapılan çok güncel araştırmalar az sayıda tasarımcı transgenik türe odaklanmıştır. Bununla birlikte, nörobilim filogenetik olarak farklı çok çeşitli türlerin çalışmasından yararlanır. Birçok farklı türü incelemek, devrelerin 25,26'yı nasıl evrimleştiğine dair içgörüler sağlar ve phyla1 ,2,3,4,27'deyaygın olabilecek ağ işlevi ilkelerini aydınlatır. Şimdiye kadar görüntüleme yöntemimizi Aplysia californica8 , 11 , 12,13,14,28, Tritonya diomedea8,9,11,14,19,28, Tritonia festiva28, dahil olmak üzere bir dizi gastropod türüne uyguladık. Pleurobranchaea californica (yayınlanmamış veriler) ve en son Berghia stephanieae (Şekil 5). Bu yaklaşımın bir çekiciliği, transgenik hayvanlara ihtiyaç duymadan birçok türe kolayca uygulanabilmesidir. Hızlı emici boyalar ve bir PDA ile VSD görüntüleme kullanımımızın, Navanax29 ve Aplysia30 hazırlıklarında yarı bozulmadan bunu başaran öncü çalışmaların izinden gittiğini kabul etmek istiyoruz. Yaklaşımımızın hızlılığına vurgumuz kısmen, birçok araştırmacının nörobilime geniş ilgi gösteren bilimsel soruları araştıramadan önce temel ağ organizasyonununu karakterize etmek için yıllarca çalışmanın gerekli olacağı korkusu nedeniyle yeni türlerde ağ çalışmaları başlatmakta giderek daha isteksiz olabileceği endişelerine bir cevaptır31. Bu nedenle, buradaki amacımız süreci büyük ölçüde hızlandıran bir teknik göstermektir - ağ organizasyonu hakkında tek bir hazırlıktan önemli aynı gün içgörüleri elde edilebilir.

Drosophila ve C. elegans gibi omurgasızların transgenik çizgilerinin gelişimi, davranışın sinirsel temellerinin optik olarak sorgulanabileceği ve manipüle edilebileceği güçlü sistemler sağlamıştır. Bununla birlikte, bu özel preparatlar, özellikle yeni türlerin sinirbilim araştırmalarına girmesiyle ilgili olarak, transgenik olmayan türlerin sinir devresi çalışmalarına olan coşkuyu azaltmanın olumsuz yanına sahip olabilir. Yalnızca bir veya iki model sisteme odaklanmak, ağ işlevinin genel ilkelerinin aranmasına zarar vericidir, çünkü karşılaştırmalı çalışmalar bu ilkelerin keşfedildiği temel bir rotayı temsil eder1,2,3,4. Buradaki amacımız, sinir ağı fonksiyonunun karşılaştırmalı çalışmalarını kolaylaştırmak amacıyla gastropod sinir ağlarının fonksiyonel yapısı hakkında hızlı bir fikir edinmek için geniş ölçekli bir görüntüleme yaklaşımı göstermektir.
Aplysia, Lymnaea, Tritonia, Pleurobranchaea ve diğerleri gibi gastropod yumuşakçaları uzun zamandır sinir ağı işlevinin ilkelerini araştırmak için kullanılmıştır, çünkü davranışları büyük ölçüde gangliyon yüzeyinde bulunan büyük, genellikle bireysel olarak tanımlanabilir nöronlar tarafından aracılık edilir ve kayıt teknikleri için kolayca erişilebilir hale getirir5.  1970'lerde, plazma zarına entegre olabilecek voltaja duyarlı boyalar (VSD'ler) geliştirildi ve kısa sürede birden fazla nöron tarafından üretilen eylem potansiyellerinin ilk elektrotsuz kayıtlarını sağladı6. Burada, sinirbilime yeni biri olan Berghia stephanieaede dahil olmak üzere çeşitli gastropod türlerindeki ağ aktivitesini incelemek için VSD'leri kullandığımızı gösteriyoruz. Görüntüleme cihazı, 1.600 kare /saniye(Şekil 1)hızında örneklenen ve hızlı emilim VSD'leri ile kullanıldığında, kaydedilen tüm nöronların eylem potansiyellerini ortaya çıkaran ticari olarak kullanılabilen 464 elementli bir fotodiyot dizisidir7. Tüm diyotlar tarafından kaydedilen sinyaller, satın alındıktan hemen sonra görüntülenir ve PDA alım yazılımındaki ganglionun bir görüntüsünün üzerine bindirilir, bu da aynı hazırlıkta keskin elektrotlarla ilgi çekici nöronların araştırılmasını mümkün hale getirir8,9.
Ham PDA verilerinde, birçok diyot büyük nöronları gereksiz olarak kaydeder ve birçoğu birden fazla nörondan karışık sinyaller içerir. Bir dönüm noktası, her ham 464 kanallı PDA veri kümesini, kaydedilen her nöronun yalnızca eylem potansiyellerini içeren ayrı bir izlemede göründüğü yeni bir izleme kümesine hızlı bir şekilde işlemek için bağımsız bileşen analizi kullanarak otomatik bir ani sıralama yönteminin geliştirilmesiydi10,11.
Bu yazıda, fotodiyot dizisi ve hızlı emilim VSD'leri ile gastropod sinir sistemlerinden büyük ölçekli eylem potansiyeli kayıtlarının eldeinde yer alan temel adımları özetliyoruz.  Ayrıca, optik olarak kaydedilmiş nöronların işlevsel topluluklarına göre kümelenmesi ve haritalandırılması ve ateşleme izlerinin basit bir şekilde incelenmesiyle genellikle belirgin olmayan popülasyon düzeyindeki özellikleri karakterize etmek için 12,13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1022px;" width="1022">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Achromat 0.9 NA swing condenser</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:248px;">N/A</td>
			<td style="width:332px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Bipolar temperature controller</td>
			<td style="width:196px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:248px;">CL-100 with SC-20</td>
			<td>Controls perfusion saline temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Chamber thermometer</td>
			<td style="width:196px;">Physitemp</td>
			<td style="width:248px;">BAT-12 with IT-18 microprobe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Digital camera</td>
			<td style="width:196px;">Optronics</td>
			<td style="width:248px;">S97808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Dissecting forceps</td>
			<td style="width:196px;">Dumont</td>
			<td style="width:248px;">#5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:196px;">American Diagnostic Corp.</td>
			<td style="width:248px;">ADC-3410Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Imaging microscope</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:248px;">BX51WIF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Imaging perfusion chamber</td>
			<td style="width:196px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:248px;">PC-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:196px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:248px;">SS6-25</td>
			<td>Makes 25 gallons at a time</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Master-8 pulse stimulator</td>
			<td style="width:196px;">A.M.P.I.</td>
			<td style="width:248px;">Master-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microdispenser</td>
			<td style="width:196px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:248px;">3-000-752</td>
			<td>Dye applicator for pressure staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microdissection scissors</td>
			<td style="width:196px;">Moria</td>
			<td style="width:248px;">15371-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Minutien pins (0.1 mm)</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:248px;">NC9677548</td>
			<td>For positioning and stabilizing CNS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Motorized microscope platform</td>
			<td style="width:196px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:248px;">GHB-BX</td>
			<td>Gibraltar platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">NeuroPlex imaging software</td>
			<td style="width:196px;">RedShirtImaging</td>
			<td style="width:248px;">NeuroPlex</td>
			<td>Compatible with the WuTech photodiode array</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Objective lenses</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:248px;">XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">PE-100 polyethylene tubing</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:248px;">63018-726</td>
			<td>Tubing to make suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Perfusion pump</td>
			<td style="width:196px;">Instech</td>
			<td style="width:248px;">P720 with DBS062SDBSU tube set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Petroleum jelly</td>
			<td style="width:196px;">Equate</td>
			<td style="width:248px;">NDC 49035-038-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Photodiode array with control panel</td>
			<td style="width:196px;">WuTech Instruments</td>
			<td style="width:248px;">469-IV photodiode array</td>
			<td>Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">RH155</td>
			<td style="width:196px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:248px;">sc-499432</td>
			<td>Voltage-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">RH482</td>
			<td style="width:196px;">Univ of Conn. Health Center</td>
			<td style="width:248px;">JPW-1132</td>
			<td>Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Silicone earplugs</td>
			<td style="width:196px;">Mack&#39;s</td>
			<td style="width:248px;">Model 7</td>
			<td>To be use for preparation compression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Staining PE tubing</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:248px;">63018-xxx</td>
			<td>Different sizes depending on fit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:196px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:248px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Thorlabs LED and driver</td>
			<td style="width:196px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:248px;">M735L2-C1, DC2100</td>
			<td>LED lamp and driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tygon tubing</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:248px;">14-171-xxx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vibration isolation table</td>
			<td style="width:196px;">Kinetic Systems</td>
			<td style="width:248px;">MK26</td>
			<td>Spring-based</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photodiode-based optical imaging for recording network dynamics with single-neuron resolution in non-transgenic invertebrates

Belirtilebilir nöron setlerinin aktivitesinin ışıkla kaydedilebileceği ve manipüle edilebildiği transgenik omurgasız preparatların geliştirilmesi, davranışın sinirsel temelinin çalışmaları için devrimci bir ilerlemeyi temsil eder. Bununla birlikte, bu gelişmenin bir dezavantajı, araştırmacıları çok az sayıda "tasarımcı" organizmaya (örneğin, C. elegans ve Drosophila)odaklama eğilimidir ve ağ işlevinin genel ilkelerini tanımlamak için gerekli olan birçok türdeki karşılaştırmalı çalışmaların takibini olumsuz yönde etkileme potansiyeline sahiptir. Bu makale, transgenik olmayan gastropod türlerinin beyinlerinde voltaja duyarlı boyalarla optik kaydın, sinir ağlarının tek hücreli çözünürlükle işlevsel organizasyonunun özelliklerini hızlı bir şekilde (yani tek deneyler sırasında) nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Laboratuvarımız tarafından birden fazla gastropod türünün CNS'sinde davranışsal olarak ilgili motor programlar sırasında düzinelerce ila ~ 150 nörondan eylem potansiyeli izleri elde etmek için kullanılan diseksiyon, boyama ve kayıt yöntemlerini ayrıntılı olarak özetliyoruz, nörobilime yeni bir tane de dahil olmak üzere - nudibranch Berghia stephanieae. Görüntüleme, absorbans voltajı duyarlı boyalar ve kaydedilen nöronlar tarafından üretilen tüm eylem potansiyellerini yakalayacak kadar hızlı, saniyede 1.600 karede örneklenen 464 elemanlı fotodiyot dizisi ile gerçekleştirilir. Hazırlık başına çok az veya hiç sinyal ağartma veya fototoksiklik olmadan birden fazla birkaç dakikalık kayıt elde edilebilir. Açıklanan yöntemlerle toplanan ham optik veriler daha sonra çeşitli resimli yöntemlerle analiz edilebilir. Optik kayıt yaklaşımımız, çeşitli transgenik olmayan türlerdeki ağ aktivitesini araştırmak için kolayca kullanılabilir, bu da beyinlerin davranışı nasıl ürettiğine dair karşılaştırmalı çalışmalar için çok uygundur.

Tritonia Denizyıldızı avcısı ile cilt teması, Tritonia diomedea'nın kaçış yüzmesini tetikler, onu güvenli bir yere iten ritmik bir dizi tüm vücut fleksiyondan oluşan (Şekil 3A). İzole beyin preparatlarında, sinir 3'ü (PdN3) pedallamak için kısa bir uyaran, pedal gangliyonundan optik kayıtlarda kolayca tanınabilen bu davranış için ritmik yüzme motor programını (SMP) ortaya çıkarır. Şekil 3B, PDA'nın konumlandırılmış olduğu sol Tritonia pedal ganglionunun dorsal yüzeyindeki nöronların ateşleme aktivitesini kaydetmek için tasarlanmış bir VSD görüntüleme deneyinin düzenini, SMP'yi ortaya çıkaran kontraseptif (sağda) PdN3'e bir uyarıcı olarak tasvir eder. PdN3'ün uyarılmasından önce, sırasında ve sonrasında 20 diyot kayıt aktivitesinden ham ve filtrelenmiş veriler (bandpass Butterworth filtresi, 5 ve 100 Hz kesmeler) sırasıyla Şekil 3C,D'de gösterilmiştir. Sinir uyaranı 2 dakika dosyasına 20 sn teslim edildi. Satın alındıktan hemen sonra, kayıt dizisinin tüm 464 diyotları tarafından ölçülen sinyaller, görüntüleme yazılımındaki preparatın bir görüntüsü üzerinde topoğrafik olarak görüntülenebilir (Şekil 3E). Bu noktada, birçok iz aynı nöronlardan gereksiz yere kaydedilen sivri uçları içerir ve bazı izler birden fazla nörondan sivri uçlar içerir. Filtrelenmiş diyot izlerini ICA ile basamak sıralayan 53 benzersiz nöronal iz elde edildi, bunların 30'u Şekil 3F'degösterilmiştir. Şekil 3G Şekil 3G'detek tek sivri uçların kinetiği takdir edilebilir Şekil 3F'den (kırmızı kutu) dört izden bir alıntıyı genişletir; ICA ani sıralama algoritmasının doğruluğu daha önce eşzamanlı keskin elektrot kayıtları kullanılarak doğrulanmıştır, bu da sıralanmış izlerdeki tüm ani artışların hücre içi olarak kaydedilen tek tek nöronlardan gelen ani artışlara karşılık geldiğinigöstermiştir 11,14.
Aplysia Aplysia californica'ya güçlü bir şekilde averik bir kuyruk uyaranı, kalıplaşmış iki parçalı ritmik bir kaçış tepkisi ortaya çıkarır15. Yanıtın ilk aşaması, hayvanı hızlı bir şekilde ileriye doğru hareket ettiren birkaç kafa akciğeri ve kuyruk çekme döngüsünden oluşan bir dörtnaladır. Bunu tipik olarak, hayvanı birkaç dakika daha yavaş bir hızda ileriye doğru yönlendiren tekrarlanan kafadan kuyruğa kas kasılma dalgalarını içeren bir emekleme dönemi izler (Şekil 4A). Optik kayıtlarda bu kaçış motoru programlarını yakalamak için, PDA izole bir beyin preparatında sağ pedal ganglionunun dorsal yüzeyine odaklandı ve kontralateral (sol) pedal siniri 9'a (PdN9; Şekil 4B). Sürekli 20 dakikalık optik kayıtta bir dakika (Şekil 4C), PdN9 dörtnala tarama motor programı dizisini ortaya çıkarmak için uyarıldı. Kaydedilen 81 nöronun tümünden gelen sinyallerin olasılıksal Gauss mekansal dağılımları ganglion üzerine eşlenmiştir (Şekil 4D). Tam kayda uygulanan boyutsallık azaltma, kaçış programının dörtnala (siyan) ve gezinme (koyu mavi) aşamalarının farklı alanları işgal ettiğini ve ana bileşen alanında sırasıyla spiral ve döngü benzeri farklı yörüngeler oluşturduğunu ortaya koydu (Şekil 4E).
Şekil 4'te gösterilen Aplysia kaydına dayanan üç video, bu tür veri kümelerinde gerçekleştirilebilecek diğer analiz türlerini göstermektedir. Video 1, kaydedilen tüm nöronların kaydın tam süresi boyunca ateşlenmesine animasyonludur. Kaçış motor programının ilk uyarıcı sonrası dönemi, gangliondaki aktivitenin farklı fonksiyonel kümelerin alternatif patlamasıyla işaretlenen bir dörtnala ile karakterize edildi (Video 2). Dörtnala daha sonra, nöronal kümeler boyunca aktivitenin geniş ölçüde vurgulu kaldığı, ancak ganglion içinde saat yönünün tersine dönme yörüngesini üstlendiği bir taramaya geçiş yaptı (Video 3). İkinci iki video ayrıca, kaçış yanıtının dörtnala ve tarama aşamaları için farklı işlevsel toplulukların ateşlenmelerini ve konumlarını ayrı ayrı ortaya çıkaran konsensüs kümelemelerini içerir. Hem dörtnala hem de gezinme aşamalarında aynı kümeye atanan birçok nöronun, önceki bulgularla tutarlı olarak ganglion içinde birbirine fiziksel yakınlık sergilediğini unutmayın12.
Berghia Aeolid nudibranch Berghia stephanieae (Şekil 5A) sinirbilim için yeni bir model sistemini temsil eder. Tipik bir Berghia deneyi için görüntüleme kurulumu Şekil 5B'de gösterilmiştir. Geniş ölçekli nöronal aktiviteyi ortaya çıkarmak için, en belirgin sol pedal sinirine bir emme elektrodu yerleştirildi ve bir sinir uyaranı 2 dakikalık bir kayda 30 sn iletildi. ICA tarafından işlenen izler 55 nöronda hem spontan hem de uyaran çağrışımlı aktiviteyi ortaya çıkardı (Şekil 5C). Konsensüs kümeleme yoluyla topluluk algılama, şekil 5D'de bir ağ grafiğinde ve Şekil 5E'de gösterilen ve kümeleme atamalarına göre Şekil 5C'de gösterilen izleri yeniden düzenleyen on farklı işlevsel topluluk tanımladı. Kaydedilen tüm nöronlardan gelen sinyallerin Gauss dağılımları, kaydedilen 55 nöronun tüm konumlarını belirtmek için Şekil 5F'deki preparatın bir görüntüsü üzerine bindirilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig1.jpg"> Şekil 1: Optik görüntüleme teçhizatı ve fotodiyot dizisinin (PDA) görünümleri. (A) PDA, dijital kamera, mikroskop ve sahne içeren optik görüntüleme donanımı. (B) Fiber optiklerin görüntüleme diyaframını 464 fotodiyotlara bağladığı PDA'nın iç tasarımı. Fotodiyotların üzerinde bir sıra amplifikatör bulunur. (C) Görüntüleme diyaframının altıgen yüzü, görüntülenen alanın odaklandığı yerdir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig2.jpg"> Şekil 2: Optik kayıtların eldeinde temel iş akışını gösteren bir akış çizelgesi. VSD görüntüleme protokolündeki, diseksiyon ve boyamadan görüntülemenin ayrıntılarına kadar temel adımlar bu akış çizelgesinde tasvir edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig3.jpg"> Şekil 3: Tritonia diomedeasonuçları , ham, filtreed ve çivi sıralanmış verileri gösterir. (A) Yırtıcı deniz yıldızı Pycnopodia helianthoides'ten kaçan tritonia, vücudun alternatif dorsal ve ventral fleksiyonlarından oluşan yüzmesiyle. (B) Görüntüleme kurulumunun şeması. Ce=serebropleural ganglionun serebral lobu; Pl = serebropleural ganglionun plevral lob; Pd = pedal ganglion. (C) 20 fotodiyottan elde edilen ham veriler, sol pedal ganglionunda kontraseteral PdN3'ün (okla gösterilen uyaran) uyarılmasına kadar aktivite gösterir. (D) C'dekiyle aynı diyotlardan süzilmiş veriler (5 ve 100 Hz bandpass Butterworth filtresi). (E) Tüm 464 diyot tarafından toplanan sıkıştırılmış izlerin preparatın bir görüntüsünün üzerine topografik olarak bindirildiği görüntüleme yazılımı çıktısı. İzleri C ve D olarak gösterilen 20 diyotun konumları kırmızı ile vurgulanır. (F) ICA ile başak tasnif yoluyla oluşturulan otuz seçilmiş tek nöron izi. (G) F'dekikırmızı kutuya karşılık gelen dört tek nöron izinin genişletilmiş görünümü, eylem potansiyellerini daha yüksek zamansal çözünürlükte görüntüler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig4.jpg"> Şekil 4: Aplysia californicasonuçları , uzun süreli kayıt, sinyal haritalama ve boyutsallık azaltmayıgösterir. (A) Aplysia'nın sıralı kaçış motor programının iki aşaması, dörtnala ve emekleme. (B) Görüntüleme kurulumunun şeması. Ce = beyin ganglionu; Pl = plevral ganglion; Pd = pedal ganglion. (C) Sağ pedal ganglionunda 81 nöronun 20 dakikalık kaydı, kontralatör PdN9'a (okla gösterilir) bir uyarana yanıt verir. İzlerin altındaki yeşil, siyan ve koyu mavi çubuklar sırasıyla kaçış motor programının ön uyaran süresini, dörtnala ve tarama aşamalarını gösterir. (D) ICA tarafından tanımlanan 81 nöronal sinyal kaynağının tüm konumlarının haritalanmış olasılıksal Gauss dağılımları ile preparatın bir görüntüsü. Yeşil anahat, PDA'nın altıgen yüzünün ganglion ile ilgili konumunu temsil eder. Her Gaussian'daki sayılar C'dekieser sayılara karşılık gelir. (E) 20 dakikalık dosya boyunca ilk üç ana bileşeni birbirine karşı çizerek ana bileşen analizini kullanarak boyutsallık azaltma. Uyarıcı öncesi taban çizgisi, dörtnala ve gezinme dönemleri sırasıyla yeşil, siyan ve koyu mavi renkte gösterilir. Bu kayda karşılık gelen nöronal ateşleme animasyonları için Videolar 1-3'e bakın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig5.jpg"> Şekil 5: Berghia stephanieaesonuçları , sinirbilim için yeni bir tür, ağ grafiklerini, fonksiyonel kümelemeve ikili sinyal haritalamayıgöstermektedir. (A) Bir Berghia örneği. (B) Görüntüleme kurulumunun şeması. Ce = serebropleural ganglionun serebral lobu; Pl = serebropleural ganglionun plevral lob; Pd = pedal ganglion; Rh = gergedan ganglionu. (C) Serebropleural gangliyondaki 55 bilateral nöronun spontan ve uyaranla uyarılmış aktivitesini gösteren izler (uyaranın teslimi okla gösterilir). (D) Konsensüs kümeleme yoluyla tanımlanan, her biri benzersiz bir renk atanmış on işlevsel topluluğu görüntüleyen bir ağ grafiği. Bu çizimdeki düğümler, ağ uzayındaki mesafenin topluluklar içinde ve arasında ateşleme korelasyon derecesini temsil ettiği nöronları temsil eder. (E) C'deki izler yeniden düzenlenir ve renk kodludur (D'ninrenk düzenini takip ederek) fonksiyonel topluluklar halinde. (F) Kaydedilen her nörondan gelen sinyallerin eşlenen konumlarını ve karşılık geldiği C ve E'deki eser numaraları gösteren preparatın görüntüsü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 1: Tam animasyon, 20 dakikalık Aplysia kaçış lokomotor programı. Sağ pedal ganglionunda (sol panel) 81 ayrı nöronun üzerinde bulunan beyaz şekillerin opaklığı, karşılık gelen nöronal izler (sağ panel) tarafından yönlendirildi ve ortalama yükselme hızının bir işlevi olarak doğrusal olarak değişti (kayıtta her 0.61 sn'ye binned). Her nöron için, tam opaklık kayıt süresi boyunca maksimum atış hızına normalleştirildi. Videoda geçen sürenin bir saniyesi 12,2 sn gerçek zamanlıyı temsil eder. Ölçek çubuğu, sırasıyla kaçış lokomotor programının ön uyaran taban çizgisini, dörtnala ve gezinme aşamalarını gösteren izlerin altındaki yeşil, siyan ve koyu mavi çizgilerle gerçek zamanlıya karşılık gelir. Dörtnala aşamasının etrafındaki sarı kutular ve gezinme aşamasının bir kısmı, Videolar 2 ve 3'tekianimasyonları oluşturmak için kullanılan kayıt alıntılarını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/Video1(Full)_reduced.mp4" target="_blank">Bu videoyu görüntülemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
Video 2: Aplysia kaçış lokomotor programının dörtnala aşamasının animasyonu. Konsensüs kümelenmesi, motor programının sadece dörtnala aşamasında kaydedilen 81 nöronun hepsinde fonksiyonel toplulukları türetmek için, açıklanan ve ref.12'deaçıklanan ve kullanıma sunulan yaklaşım ve yazılım kullanılarak gerçekleştirildi. Kaçış programının bu aşamasında büyük ölçüde tonik veya düzensiz ateşleme paternleri sergileyen nöronal topluluklar bu videodan çıkarıldı. Siyah ve zeytin yeşili topluluklara ait nöronların eylem potansiyelleri, videonun ses parçasında, ilgili nöronlar ve izler vurgulanarak duyulabilir. Ortalama ani artış oranları Video 1'de olduğu gibi ve eşdeğer zaman binning ile normalleştirildi; Videoda geçen 1 sn gerçek zamanlı 6.1 sn'ye karşılık gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/Video2(Gallop).mp4" target="_blank">Bu videoyu görüntülemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
Video 3: Aplysia kaçış lokomotor programının tarama aşamasının animasyonu. Fonksiyonel toplulukları türetmek için motor programının sadece emekleme aşamasında kaydedilen 81 nöronun hepsinde konsensüs kümelenmesi gerçekleştirildi. Motor programının bu aşamasında büyük ölçüde tonik veya düzensiz ateşleme desenleri sergileyen topluluklar bu videodan çıkarıldı. Ortalama artış oranları Video 1 ve 2'de olduğu gibi normalleştirildi ve eşdeğer zaman binning ile; Videoda geçen 1 sn gerçek zamanlı yaklaşık 12,2 sn'ye karşılık gelir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/Video3(Crawl)_reduced.mp4" target="_blank">Bu videoyu görüntülemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates at JoVE.com

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

Bu protokol, transgenik olmayan omurgasız türlerde, absorbans voltajı duyarlı boyalar ve bir fotodiyot dizisi kullanılarak nöronal popülasyon aktivitesini tek hücreli çözünürlükle görüntüleme için bir yöntem sunar. Bu yaklaşım, görüntüleme ve analizin tek bir gün boyunca takip edilebildiği hızlı bir iş akışı sağlar.

Transgenik Olmayan Omurgasızlarda Tek Nöron Çözünürlüğü ile Ağ Dinamiklerini Kaydetmek için Fotodiyot Tabanlı Optik Görüntüleme

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...

photodiode-based-optical-imaging-for-recording-network-dynamics-with

Research

JoVE Journal

Biology

2.8K Görüntüleme.  Rosalind Franklin University of Medicine and Science. Bu protokol, transgenik olmayan omurgasız türlerde, absorbans voltajı duyarlı boyalar ve bir fotodiyot dizisi kullanılarak nöronal popülasyon aktivitesini tek hücreli çözünürlükle görüntüleme için bir yöntem sunar. Bu yaklaşım, görüntüleme ve analizin tek bir gün boyunca takip edilebildiği hızlı bir iş akışı sağlar.

Video: Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biyoloji

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard cuticle which makes it difficult to use protocols of classical histology. In addition, histological sectioning destroys the sample and can therefore not be used for unique material. Hence, a non-destructive method is desirable which allows to view inside small samples without the need of sectioning.
We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (France) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows us to reconstruct the internal organization in its natural state without the artefacts produced by histological sectioning. These date can be used for quantitative morphology, landmarks, or for the visualization of animated movies to understand the structure of hidden body parts and to follow complete organ systems or tissues through the samples.

We used synchrotron X-ray tomography at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) to non-invasively produce 3D tomographic datasets with a pixel-resolution of 0.7&micro;m. Using volume rendering software, this allows the reconstruction of internal structures in their natural state without the artefacts produced by histological sectioning.

Sinkrotron-X-ray tomografi Sub-mikron Çözünürlük ile Non-invaziv 3D Görselleştirme

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Mikroskop Uygun Bakım ve Temizlik

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Işık Mikroskobu Binbaşı Bileşenleri

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Faz Kontrast ve Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Mikroskopi

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Yüksek çözünürlüklü Time-lapse Görüntüleme ve Yaşayan İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde Mikrotubul Dinamiği Otomatik Analizi

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

Fare Pankreas Adacık Hücrelerinin Alt Popülasyonlarında Görüntüleme Kalsiyum Dinamiği

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Ile Canlı Hücrelerdeki Hücre Yüzey Reseptörlerinin Oligomerizasyon Dinamiği Sayı ve Parlaklık Analizi ile Birlikte

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...