Araştırma Translasyonel Araştırma Wallace H. Coulter Vakfı Erken Kariyer Ödülü tarafından desteklenmektedir. Tim Andrews, Pediatrik Hematoloji / Onkoloji, kan örneği toplama konusunda yardım için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Sam Wellhausen, Sitometrisi Core, James Graham Brown Kanser Merkezi, flow sitometri örnekleri çalışan yardım için teşekkürler.

Bölüm 1. Mikroakışkan cihaz imalat Mikroakışkan lizis cihazın bir silikon master kalıp, Louisville temiz Üniversitesi ekipman standart fotolitografik teknikleri kullanılarak yaratıldı [1]. AutoCAD (Autodesk Inc, San Rafael, CA) kanalları negatif kopyaları oluşturmak için bir saydamlık maskesi (Fineline Görüntüleme, Colorado Springs, CO) oluşturmak için kullanılır oldu. Elastomer poli (dimethylsiloxane) (Dow Corning, Midland PDMS) ile yumuşak litografik teknikleri kullanarak silikon ana kalıp mikroakışkan lizis cihaz üretildi. Çoğaltılmış kanalları ile elastomer piyasaya çıktı ve 20-gauge iğne (Küçük Parça, Miramar, FL.) Kanal erişim delikleri delikli edildi. PDMS gofret oksijen plazma ile geri dönüşümsüz bir bardak slayt gümrüklü ve deney için test edildi. Bölüm 2. Lizis cihazı çalıştırmak için Protokol Mikroakışkan cihaz imal ve test edildikten sonra, eritrosit lizis ile deneyler için hazırız. Aşağıdaki bölümde ayrıntıları mikroakışkan cihaz için protokol. 2.1 Örnek Toplama <ol><li> Iki adet 2 ml yeşil üst vaccutainers antikoagülan olarak heparin ile hastanın ön önkol ven, medyan kübital venden 4 mililitre kan örneği toplayın. </li><li> Yerinden olgun endotel hücreleri (yanlış pozitif) içeren ilk 2 ml tüp atın. </li><li> Aşağı yukarı torna ve kan heparin karıştırmak için ikinci tüp yeniden süspanse; buz üzerinde hemen kaydedin. </li><li> 1 ml kan 1.5 ml Eppendorf tüpüne aktarın. (Toplama bir saat içinde) kan örneği hemen işleyin. </li></ol> PBS ile 2.2 Başbakan mikroakışkan cihaz <ol><li> Cam bağlanmış bir mikroakışkan cihaz alın. Giriş ve çıkış (Şekil 1) biraz daha büyük çaplı press-fit erişim boru (Küçük Parça, Miramar, FL). </li><li> Makro mikro arayüzü sağlayarak, her girişler tüp için 30-gauge enjektör iğnesi (Küçük Parça, Miramar, FL) takın. </li><li> 1X PBS ile 1 ml şırınga doldurun ve şırınga iğnesi Flicking baloncuklar kurtulmak için emin olun. PBS yüklenmiş 1 ml şırınga mikroakışkan cihaz girişi 1 bağlayın. Çözüm girişi 2 akana kadar elle hafifçe 1X PBS içeren şırınga itin ve sonra hemen standart bir ofis bağlayıcı klip ile giriş 2 kelepçe </li><li> Ulaşıncaya kadar sıvı Mikroakiskan cihazın çıkış portu 1X PBS iterek devam edin. Çözüm çıkış dışarı akar sonra, başka bir bağlayıcı klip ile çıkış boru kelepçe. </li><li> 1 ml şırınga iterek 1X PBS girişi 3 akana kadar devam edin ve başka bir ofis bağlayıcı klip ile giriş portu 3 kelepçe. Mikroakiskan cihazı artık tamamen hazırdır. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 şematik ilgili çözümleri ve çıkış girişleri gösteren cihaz. 2.3 şırınga pompaları ve çözüm hazırlanması <ol><li> Pompaların kalibre etmek için şu adımları izleyin: <ol class="lalpha"><li> Büyük Harvard şırınga pompası (Harvard, PHD 22/2000 Part # 702,000): 22.5 mm, 600 ul / dak akış hızı çapı yapılandırmayı ayarlayın. </li><li> Küçük Harvard Şırınga pompası (Harvard, Pico Plus Bölüm # 702.213): çapı 4.61 mm, akış hızı yapılandırması ayarlama 20 ul / dak. </li></ol></li><li> Biri 30 ml şırınga steril deiyonize su ile doldurun. Bu 50 ml konik tüp doğrudan çözüm çekerek yapılabilir. (Şırınga Etiket) </li><li> 9. adımda belirtilen prosedürü kullanarak 2X, fosfat tamponlu salin (PBS),% 2 paraformaldehid (PFA) ile ikinci bir 30 ml şırınga doldurun. (Şırınga Etiket) </li><li> 9. adımda belirtilen prosedürü kullanarak, 15 ml konik tüpler içinde saklanan alikotları 1X PBS ile 1 ml şırınga doldurun. </li><li> Giriş 2 30 ml deiyonize su şırınga ve girişi 3 30 ml 2X PBS şırınga (tüp veya Mikroakiskan cihaz don t tuzak kabarcıkları emin olun) bağlayın. Girişler 2, 3 ve çıkış boru kelepçe çıkarın. Girişi 1 1X PBS 1 ml şırınga bağlayın. Şırınga iğnesi ile, sıvı dolum, şırınga bağlayan ve baloncuklar kurtulmak için şırınga iğnesi Flicking kabarcıkları tanıtan kaçının. </li></ol> 2.4 Eritrosit lizis <ol><li> Aşağıda belirtilen uygun Harvard pompalar tüm şırınga ayarlayın: <ol class="lalpha"><li> Büyük Harvard şırınga pompası birlikte iki 30 ml şırınga (biri steril, de-iyonize su ve 2X PBS,% 2 PFA içeren) ayarlayın. </li><li> Küçük Harvard şırınga pompası, 1 ml şırınga (1X PBS içeren) ayarlayın. </li><li> Bir atık toplayıcı çıkış boru (w etiketli 50 ml konik tüp yerleştirinizAste). </li></ol></li><li> Büyük Harvard şırınga pompası (30 ml şırınga ile) açın ve bir dakika boyunca çalışmasına izin. (Herhangi bir cihaz veya tüp kabarcıkları ve herhangi bir sızıntı olmadığından emin olun). </li><li> Küçük Harvard şırınga pompası açın ve ek bir dakika çalışmasına izin. (Herhangi bir cihaz veya tüp kabarcıkları ve herhangi bir sızıntı olmadığından emin olun). Pompaların durdurun. Mikroakiskan cihazı artık kullanıma hazır. </li><li> Küçük Harvard şırınga pompası 1X PBS içeren 1 ml şırınga çıkarın. </li><li> Bir kan örneği alındıktan sonra, herhangi bir baloncukları yakalama 0.05 ml steril 1X PBS ile 1 ml şırınga doldurun. Daha sonra, 0.5 ml Eppendorf tüp elde edilen kan şırınga doldurun. (1 ml şırınga artık bir son hacmi 0.55 ml kan ve 1X PBS içerecektir.) Not: 0.05 ml PBS kana karışmasını önlemek için doldururken, şırıngayı dik tutun. </li><li> Connect girişi 1 kan içeren şırınga ve küçük Harvard şırınga pompası (şırınga pompası içine dikey olarak monte edilir) (tüp yoluyla kan cihazın içine iterek önlemek) şırınga dikkatle monte. </li><li> Atık tüpten çıkış tüpünü çıkarın ve onun yerine temiz bir 50 ml santrifüj tüpüne koyun ve bir kova buz ayarlayın. </li><li> Ilk büyük Harvard şırınga pompası açın ve 1 dakika boyunca çalışmasına izin. 50 ml santrifüj tüpü içine prizden örnek toplamaya başlayın. </li><li> Küçük Harvard şırınga pompası açın. </li><li> 1 ml şırınga içinde kan örneği tamamen cihaz üzerinden seyahat sonra, her iki pompa da durdurmak. Bu yaklaşık 20 dakika sürer. </li><li> 5 dakika boyunca toplanan örnek fren kapalı oda sıcaklığında 350 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Beyaz pelet karşı tarafında pipet koyarak süpernatantı. Beyaz pelet rahatsız etmeden, mümkün, özellikle kırmızı hücre artıkları gibi çok supernatant olarak çıkarın. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme tarafından tekrar numune akışı, tampon 1 ml (1X PBS,% 1 BSA [sığır serum albumin],% 2 PFA) 1,5 ml Eppendorf tüp örnek aktarın. </li><li> 5 dakika oda sıcaklığında 4 xg&#39;de Mikrosantrifüj toplanan örnek. Süpernatant kaldırmak için daha önce olduğu gibi aynı hassasiyette kullanın. </li><li> Vorteks akışı, tampon 1 ml örnek tekrar </li></ol> Akım sitometri analizi için 2,5 hazırlanması <ol><li> Flow sitometri kullanılarak numune analizi için örnek bir akış sitometri tüp 100 ul ekleyin. </li><li> Örnek 100 ul için (doğru konsantrasyonunu sağlamak) belirtilen antikor ekleyin. </li><li> Örnek C. 40, 30 dakika boyunca inkübe izin verin </li><li> Flow sitometri önce akışı, tampon ile iki kez yıkayın. Yıkama adım akışı, tampon 250 ul ekleyerek karıştırın, 5 dakika boyunca 350 xg&#39;de santrifüj ve akış sitometri tüp bir sıvı dönüş ile süpernatant kaldırarak içerir. </li><li> 250 akış tampon ul pelletini tekrar. Flow sitometri ile analiz için örnek hazırdır. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Tam kan, eritrositlerin biniyordu ve zenginleştirici dolaşımdaki çekirdekli hücreleri (CNCs) mikroakışkan lizis cihaz ve post-processing protokol ile işletilmektedir. İdeal sonuçlar ayrı CNC nüfusa sahip bir temiz flow sitometri scatter plot verecektir. Şekil 2 ve 3 altında görüntülenir ve forward scatter (FSC) karşı tarafında dağılım (SSC) ışık gibi eksenleri ile mikroakışkan protokol eritrosit lizis ile eritrosit lizis olmadan tam kan örneği scatter plot karşılaştırmalar. Mikroakışkan zenginleştirme protokolü, temiz bir akış sitometri scatter plot elde etmek için gerekli olduğu görülmektedir. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 Flow sitometri scatter plot FSC ve SSC eksenleri ile eritrosit lizis olmadan tam kan örneği. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 FSC ve SSC eksenleri ile nüfusu etiketli mikroakışkan eritrosit lizis çekirdekli hücreleri dolaşımdaki akış sitometri scatter plot. 1. Bölge (kırmızı) granülositler temsil eden 3. Bölge (mavi), Bölge 2 (yeşil) temsil eden monositler, lenfositler temsil eder, ve 4. Bölge (mor) henüz karakterize edilebilir. Gerektiğinde protokolde pipet kırmızı hücre enkaz kaldırılması da önemlidir. Aşağıda Şekil 4 kırmızı hücre enkaz bir fazlalık gösteren bir scatter plot. Şekil 2&#39;de scatter plot karaltı olmasa da, bir veri analizi sırasında eritrosit enkaz nedeniyle etkinlikler için hesaba katmalısınız. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 Flow sitometri scatter plot kırmızı hücre artıkları, bir küme olarak tasvirBölge 5 (mavi) olayları. Belirli antikor fenotip işaretleri Boyama hücreler de karakteristik sonuçlar üretecektir. Lenfositler, monositler ve granülositler: Sayılarla, 3 farklı lökosit için antikor fenotip lekeler vardır. Şekil 5 eksenleri CD3 ve CD4 ile çizilen lenfosit toplulukları gösteriyor. Monositler ve granülositler sırasıyla, FSC karşı CD14 ve CD66b gibi balta ile 6-7 Rakamlarla gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5 Flow sitometri scatter plot, CD3 ve CD4 eksenleri ile lenfositlerin tasvir . <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig6.jpg" alt="Şekil 6" /> Şekil 6 Flow sitometri scatter plot FSC ve CD14 eksenleri ile monositler tasvir. <img src="/files/ftp_upload/1656/1656fig7.jpg" alt="Şekil 7" /> Şekil 7 Flow sitometri scatter plot FSC ve CD66b eksenleri granülositler tasvir.

<ol>
	<li>White, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+application+of+microfluidic+leukocyte+enrichment+protocol+in+mild+phenotype+sickle+cell+disease+(SCD.">Clinical application of microfluidic leukocyte enrichment protocol in mild phenotype sickle cell disease (SCD.</a> Biomedical Microdevices. 11 (2), 477-483 (2009).</li><li>Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+Flow+Microfluidic+Device+for+Rapid+Erythrocyte+Lysis.">Continuous Flow Microfluidic Device for Rapid Erythrocyte Lysis.</a> Anal. Chem. 76 (21), 6247-6253 (2004).</li></ol>

Otomatik bir mikroakışkan kan lizis protokol bildirilmiştir. Protokol kapsamında fazlalaştı kritik adımlar. P.2.1 bölümü, örnek yerinden olgun endotel hücreleri içeren yanlış pozitif olarak hareket olarak toplanan ilk kan şişe atmak için önemlidir. Ayrıca toplama bir saat içinde kan örneği çalıştırmak için emin olun. Astar bölümü P.2.2 mikroakışkan cihaz, başlangıçta baloncuklar kurtulmak için önemlidir. Ayrıca, bir protokol boyunca iğne şırınga takarken kabarcıkları almaktan...

automated microfluidic blood lysis protocol for enrichment of circulating nucleated cells

Bu raporda, otomatik bir mikroakışkan kan parçalama cihaz için protokol ayrıntılı. Lökosit ve endotel hücreleri içeren çekirdekli hücreleri (CNCs), Sirkülasyon, bireyin bağışıklık durumuna güncelleştirilmiş bir durum için ideal bir platform sağlar. Mikroakışkan protokolü, seçici hücre kaybı ve kullanıcı-aracılı adımları nedeniyle numune hazırlama değişkenliği olmadan CNCs zenginleşmesine olanak sağlar. Kısaca, protokol cihaz imalat, örnek toplama, cihaz kurulumu ve mikroakışkan haznesinden kan çalıştıran içerir. Cihaz içinde tam kan hızla yaklaşık 10 saniye 50 mikron x 150 mikron mikroakışkan kanal için deiyonize su ile karıştırılır. Bu süre içinde a eritrositlerin hipotonik koşulları nedeniyle parçalanmış. Kanalın alt Herringbone yapıları tam karıştırma ve sabit bir ortama hücreleri maruz kalma sağlar. Kalan hücreleri izotonik koşulları, cihazın çıkışında iade, 2% paraformaldehid kullanarak sabit CNCs eritrosit enkaz ayırmak için santrifüj ve akışı, tampon boyama ve flow sitometri ile analiz için askıya. Sonuçlar kaydedilir CNC nüfusa sahip temiz akış sitometri dağılım araziler göstermektedir. Bu cihaz ve protokol önemi CNC popülasyonlarının analizi ile hastalığın patogenezinde çalışma ve anlayış geliyor. Bu nedenle, otomasyon, etkinliği ve mikroakışkan protokol basitliği göstermiştir.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells at JoVE.com

Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Çekirdekli hücre zenginleştirme hücre kaybı olmadan yüksek kaliteli örnek izolasyonu sağlar eritrosit lizis ile periferik kan dolaşımını sağlamak için otomatik bir mikroakışkan cihaz geliştirildi.

Çekirdekli Hücreler Sirkülasyon zenginleştirilmesi için Otomatik mikroakışkan Kan Lizis Protokolü

In this report the protocol for an automated microfluidic blood lysis device is detailed. Circulating nucleated cells (CNCs), including leukocytes and ...

automated-microfluidic-blood-lysis-protocol-for-enrichment

Research

JoVE Journal

Biology

12.3K Görüntüleme.  University of Louisville. Çekirdekli hücre zenginleştirme hücre kaybı olmadan yüksek kaliteli örnek izolasyonu sağlar eritrosit lizis ile periferik kan dolaşımını sağlamak için otomatik bir mikroakışkan cihaz geliştirildi.

Video: Automated Microfluidic Blood Lysis Protocol for Enrichment of Circulating Nucleated Cells

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

İnsan Kanı StemCell Teknolojileri RosetteSep Kit ile gelen NK Hücreleri zenginleştirilmesi

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Biyoloji

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Çözünür Sinyal aracılı Etkileşimleri Araştırılması için Epitel Hücreleri ve Bakteriler mikroakışkan Co-kültür

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Endojen ve İmmünofloresan Analizi ve Eksojen Sentromer-kinetochore Proteinler

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Gen kullanmak için bir protokol translasyonel araştırma için uygun hayvan modeli belirlemek için zenginleştirme çözümlemesi ayarla

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

CD4 yalıtım+ T-hücreleri ve T foliküler Yardımcısı (cTfh) hücre alt kümeleri üzerinden periferik kan kullanarak 6-renk Akış Sitometresi Analizi, dolaşan

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Quantification of Circulating Pig-Specific DNA in the Blood of a Xenotransplantation Model

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a problem for physicians and researchers. This manuscript describes a simple and effective method to monitor immune rejection in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. Circulating DNA is a potentially non-invasive biomarker for organ damage. In this study, circulating pig-specific DNA (cpsDNA) was monitored during xenograft rejection by quantitative real-time PCR (qPCR). In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Species-specific primers were then used to quantify cpsDNA by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models. The value of this method suggests that it can be used as a simple, convenient, low cost, and less invasive method to monitor the immune rejection of xenotransplantation.

In this protocol, porcine specific primers were designed, plasmids-containing porcine specific DNA fragments were constructed, and standard curves for quantitation were established. Using species-specific primers, cpsDNA was quantified by qPCR in pig-to-mouse cell transplantation models and pig-to-monkey artery patch transplantation models.

Knenotransplantasyon Modelinin KanLarında Dolaşan Domuza Özgü DNA'nın Ölçülmesi

Xenotransplantation is a feasible method to treat organ failure. However, how to effectively monitor the immune rejection of xenotransplantation is a ...