Yazarlar Gloria A Benavides teknik katkısını kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC) tarafından desteklenen, NIDDK Diyabetik Komplikasyonlar Konsorsiyumu (DiaComp, www.diacomp.org) hibe DK076169 (subaward VDU), ve O&#39;Brien Merkezi P30 DK079337 (VDU).

Kan toplama, izolasyonu ve analizi için bu yazıda anlatılan tüm protokoller Birmingham Alabama Üniversitesi&#39;nde gözden ve Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır. 1.. Hücre İzolasyon (Histopaque Sigma-Aldrich No&#39;lu Protokol&#39;ün 1119 ve Mıltenyı Bıotec microbead Pozitif ve Negatif Seçim Protokolleri Modifiye) <ol><li> Bir sallanan kepçeli rotor (ivme = 5-6, ve herhangi bir fren) olan bir santrifüj içinde 15 dakika boyunca 500 x g&#39;de (ACD ya da EDTA tüplerinde toplanmıştır) Santrifüj tam kan. </li><li> 1 cm hücre tabakası (eritrosit / beyaz tabaka) üzerinde kalır kadar bir transfer pipet ile trombosit açısından zengin plazma (PRP) içeren üst katmanı kaldırın. Daha sonraki işlem için oda sıcaklığında PRP koyun. </li><li> Bir steril 50 ml konik tüp ince beyaz tabakayı transfer, bazal RPMI ile 24 ml&#39;ye kadar seyreltilmesi ya da en azından başlangıç ​​ince beyaz tabaka hacmi 4x. Not: RBC tabakanın üst yarısı olabilir hBu orantılı olarak RPMI hacminin artırılması ile sonuçlanır, ancak dahil edilmesi için ave. </li><li> Üç 15 ml konik boruların (3 ml her biri) içinde, alt tabaka için 1.119 (1119) arasında bir özgül ağırlığa sahip üst tabaka ve yüksek yoğunluklu bir Ficoll için 1,077 (1077) özel bir ağırlığa sahip, düşük yoğunluklu Ficoll kullanılarak yoğunluk gradyan hazırlayın. Bu adımı gerçekleştirmek için, önce her tüpe 1077 ekleyin. 5 ml&#39;lik bir dar bir pipet kullanarak 1077 altında pipet yerleştirerek tüpün dibine 1119 ekleyin ve yavaş yavaş üst gradyanı ile karıştırılmadan reaktif serbest bırakın. Yoğunluk gradyan medya 6 ml&#39;lik bir toplam 3 mi işaretine ayırma görünür bir faz ile, bu aşamada mevcut olması gerekmektedir. </li><li> Otomatik bir pipet kullanarak, yavaşça gradyan katmanları rahatsız önlemek için düşük güç ayarını kullanarak her bir gradyan tüpüne (adım 1.3) ile seyreltilmiş kan 8 ml ekleyin. Toplam hacim, bu aşamada 14 ml olmalıdır. </li><li> Oda sıcaklığında (hızlanma 30 dakika boyunca 700 x g&#39;de santrifüj tüplerirasyon 6, hiçbir fren). Not: Bu aşamada, üç farklı hücre bantları açık (Şekil 1A) olmalıdır. (1077 ve plazma arasında) üst bantları polimorfonükleer hücreler (PMN) ve (1119 aşağıda) alt bant içeren mononükleer hücreler (ÇUŞ) ve trombositler ve (1007 ve 1119 arasında) orta bandını içeren alyuvarlar içerir. </li><li> Diğer hücre grupları bozmadan steril cam pipetler kullanılarak ayrı ayrı MNC&#39;yi ve PMN toplayın. Bir steril 50 ml konik tüp içine her tüpten MNC nüfus birleştirin. De PMN nüfus için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Yoğunluk gradyanı seyreltilmesi için sırasıyla MNC ve PMN içeren fraksiyonlar her tüpe RPMI 4 sayılarını. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 700 x g santrifüj tüpleri. </li><li> Süspanse MNC Hücre topağı ve% 0.5 ultra-saf yağ asidi içermeyen BSA (RPMI-BSA) ihtiva eden 1 ml RPMI PMN Hücre topağı ve 1.5 ml tüpler, steril aktarın. 30 için bir tezgah üstü picofuge kullanarak hücrelerin Peletsn. </li><li> Süpernatantı atın ve 80 ul RPMI-BSA her hücre pelletini. </li><li> Monositlerin pozitif seçim için MNC fraksiyonu içeren tüp manyetik boncuk etiketli-antiCD14 antikor 20 ul ekle. PMN hücre fraksiyonu ihtiva eden tüp için, nötrofillerin pozitif seçim için manyetik tane etiketlenmiş-antiCD15 antikor 20 ul ekle. 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca her bir hücre süspansiyonu inkübe </li><li> 1 ml RPMI-BSA ortamı ile her bir hücre süspansiyonu yıkayın ve daha önce olduğu gibi pelet ve 500 ul RPMI-BSA içinde her pelletini. </li><li> Etiketlenmiş hücreler (MACS) ayırıcının ayırma manyetik aktif hücrenin manyetik alan içinde ayrılır. Önce, hücre süspansiyonunun eklenmesinden RPMI-BSA 3 ml MACS ayırıcı ve çamaşır üzerinde sütun yerleştirerek MACS LS sütun (her bir hücre süspansiyonu için bir tane) hazırlayın. </li><li> Hücre süspansiyonları uygulandıktan sonra, RPMI-BSA medya 3 ml 3x (izin emin olun her sütun yıkayın medya drain tamamen yıkar arasında). Steril tüp içine hücre süspansiyonu akış ve sütun yıkamaları toplayın. </li><li> Monositleri ve nötrofilleri izole etmek için, son yıkamadan sonra manyetik alandan sütun kaldırmak ve sütun pistonu ile RPMI-BSA, 5 ml steril tüp içine pozitif olarak seçilen hücrelerin elute. </li><li> Lenfositler, 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de ikinci aşama 1.15 uluslu akış-through-yıkama fraksiyonu pelet izole etmek. Süpernatant atılır ve 80 ul RPMI-BSA içinde hücre pelletini. CD61 ve CD235a antikor 20 ul ilave edin ve 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu inkübe Daha önce olduğu gibi MACS ayrılması tekrarlayın ve lenfositleri içeren rağmen akışını toplamak. </li><li> (Adım 1.9) daha önce olduğu gibi, monositler, nötrofiller, lenfositler ve fraksiyonlar, santrifüj pelet ve silmek için, üst fazlar. Hücre peletleri sayımı için 1 ml hücre dışı ortam akış (XF-DMEM) içinde yeniden süspansiyon haline olmalıdır. &lt;Br /&gt; Not: Bütün kan 8 ml 1-5 x 10 6 monosit / ml ve 5.20 x 10 6 lenfositler ve nötrofiller / ml sonuç verir. </li><li> Oda sıcaklığında 1500 x g&#39;de 8-10 dakika boyunca trombositlerin, santrifüj PRP (adım 1.2) izole etmek için. Plazma çıkarın ve PBS 1 mg / ml PGI 2, repellet ile takviye edilmiş, 5 ml steril ile bir kez hücre pelletini yıkama ve PBS-PGI 2 tampon 1 ml nihai pelet askıya. </li><li> Walkowiak ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi trombosit spektrofotometre ile PBS-PGI 2 tampon maddesi içinde süspansiyon haline kez bulanıklık derecesi trombosit sayısını belirlemek için, aşağıdaki denklem kullanılarak: [6.23 / (2.016 - 800 Abs)] - 3.09 x seyreltme faktörü = # 8 x 10. trombosit / ml 12. </li></ol> 2. Hücre Kaplama <ol><li> Hücre-Tak (hücre yapışkan) hazırlanması: 180 ul, 90 ul hücre yapıştırıcı madde ekleyin diH 2 0, 0.1 N sodyum bi 540 ulkarbonat (pH 8.0) ve 1 N NaOH kullanılarak pH 7,2-7,8 ​​ayarlayın. Hazırlanan hücre yapıştırıcı 30 ul her bir oyuğa kaplanarak XF levhaları (24-çukurlu, V7 mikro) hazırlayın. Not: Hücre yapıştırıcı Her kullanım için taze hazırlanmalıdır. </li><li> 20-30 dakika sonra aspire hücre yapıştırıcı boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin ve iki kez PBS ile yıkayın kuyu (1 ml / çukur). </li><li> Izole edilmiş monositler, lenfositler, nötrofiller ve plateletler üzerinde bir hücre sayımı gerçekleştirmek ve monositler, lenfositler ve nötrofiller için de 250k hücre / bir tohumlama yoğunluğuna izin vermek için XF-DMEM kullanılarak uygun hacme getirmek ve 25 x 10 6 / oyuk plateletler için. Seçenek olarak ise, oksidatif patlama yanıtı ölçmek için, nötrofiller 125k hücre / oyuk olacak şekilde tohumlandı edilebilir. Her bir hücre süspansiyonu için son tohumlama hacmi 200 ul / oyuk olmalıdır. </li><li> Hiçbir frenli 1 sn boyunca 200 xg&#39;de plaka santrifüj. 300 x g hiçbir fren ile tekrar plakasını 180 ˚ ve santrifüj döndürün. </li><li> Nihai iyi vol getirinume XF-DMEM ile ve önceki XF tahlil için 30 dakika boyunca 37 º C&#39;de inkübe 660 ul. Not: kaplı hücreler önce ve sonra tahlil fotomikrografları yeterli bir kaplama sağlamak ve hücre ayrışması ekarte etmek için kullanılabilir. </li></ol> 3. Bir 24-yuvalı hücre dışı Flux Assay Plate hazırlanması (XF24) <ol><li> Hidrat XF, deneyden önce 2 saat arasında, en az bir kalibrant çözeltisi ile probes. </li><li> Yukarıdaki sırayla kartuş enjeksiyon portu içine 0.5 ug / ml oligomycin 10x hisse senetleri, 0,6 iM FCCP ve XF-DMEM&#39;de 10 uM antimycin A ve stok çözümleri yükü 75 ul hazırlayın. Oksidatif yarılma ölçümleri elde edilecekse, 100 ng / ml PMA 10x stoklar enjeksiyon antimycin-A sonra enjekte edilebilir. </li><li> Sulu ve yüklü kartuşu kalibre ve XF analizini gerçekleştirmek. Analiz ve oksijen tüketimi ve hem de pH değişiklikleri yorumlanması için ayrıntılı yöntemler, 9,13,14 önceki yayınlarda tarif edilmiş ve d değildirburada ayrıntılı iscussed. </li><li> Tahlil plaka hücrelerin kaybını önlemek ve 50 ul RIPA hücre liziz tamponu ekleyin ve normalizasyonu için bir protein deneyi gerçekleştirmek için sonra XF deneyinden sonra, XF-DMEM son 50 ul ama aspire. </li></ol>

<ol>
	<li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+cognitive+impairment,+and+Alzheimer's+disease.">Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease.</a> Int. J. Alzheimer's Dis. 2009, (2009).</li><li>Jin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy,+mitochondrial+quality+control,+and+oncogenesis.">Autophagy, mitochondrial quality control, and oncogenesis.</a> Autophagy. 2, 80-84 (2006).</li><li>Cordero, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+mitophagy+activation+in+blood+mononuclear+cells+of+fibromyalgia+patients:+implications+in+the+pathogenesis+of+the+disease.">Mitochondrial dysfunction and mitophagy activation in blood mononuclear cells of fibromyalgia patients: implications in the pathogenesis of the disease.</a> Arthritis Res. Ther. 12, R17 (2010).</li><li>Japiassu, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+failure+of+human+peripheral+blood+monocytes+in+patients+with+septic+shock+is+mediated+by+reduced+F1Fo+adenosine-5'-triphosphate+synthase+activity.">Bioenergetic failure of human peripheral blood monocytes in patients with septic shock is mediated by reduced F1Fo adenosine-5'-triphosphate synthase activity.</a> Crit. Med. 39, 1056-1063 (2011).</li><li>Widlansky, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+membrane+potential,+mass,+and+morphology+in+the+mononuclear+cells+of+humans+with+type+2+diabetes.">Altered mitochondrial membrane potential, mass, and morphology in the mononuclear cells of humans with type 2 diabetes.</a> Transl. Res. 156, 15-25 (2010).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ageing+and+Alzheimer's+disease+on+mitochondrial+function+of+human+platelets.">Effects of ageing and Alzheimer's disease on mitochondrial function of human platelets.</a> Exp. Gerontol. 43, 589-594 (2008).</li><li>Avila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+mitochondrial+dysfunction+is+evident+in+type+2+diabetes+in+association+with+modifications+of+mitochondrial+anti-oxidant+stress+proteins.">Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins.</a> Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120, 248-251 (2012).</li><li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets,+lymphocytes,+monocytes,+and+neutrophils,+and+the+oxidative+burst+from+human+blood.">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab. Invest. 93, 690-700 (2013).</li><li>Hill, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+cellular+bioenergetics+with+mitochondrial+quality+control+and+autophagy.">Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy.</a> Biol. Chem. 393, 1485-1512 (2012).</li><li>Hultqvist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+autoimmunity,+arthritis,+and+encephalomyelitis+in+mice+with+a+reduced+oxidative+burst+due+to+a+mutation+in+the+Ncf1+gene.">Enhanced autoimmunity, arthritis, and encephalomyelitis in mice with a reduced oxidative burst due to a mutation in the Ncf1 gene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12646-12651 (2004).</li><li>Rosa-Borges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency+with+recurrent+infections:+case+report.">Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency with recurrent infections: case report.</a> J. Ped. 77, 331-336 (2001).</li><li>Walkowiak, B., Kesy, A., Michalec, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microplate+reader--a+convenient+tool+in+studies+of+blood+coagulation.">Microplate reader--a convenient tool in studies of blood coagulation.</a> Thromb. Res. 87, 95-103 (1997).</li><li>Dranka, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+bioenergetic+function+in+response+to+oxidative+stress+by+metabolic+profiling.">Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling.</a> Free Radic. Biol. Med. 51, 1621-1635 (2011).</li><li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells.">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J. Vis. Exp.. (46), e2511 (2010).</li></ol>

VDU Denizatı Biyobilim Bilimsel Danışma Kurulu üyesidir.

Bu protokol, biyoenerji analizi için uygun olan bir şekilde kan hücre izolasyonu için çeşitli yaygın olarak kullanılan tekniklerin derleme temsil eder. Sunulan bitişik teknikleri izole edilmiş hücreleri üzerine yerleştirilmiş en az stres ile kontrol edilen ortam koşullarında hücrelerin çok sayıda izole etme kabiliyetleri açısından diğer izolasyon yöntemleri (örneğin, FACs analizi) avantajlıdır. Hatta az kesinti ile uzun izolasyonların dezavantajı vardır. Bu protokol, klinik ve translasyon araştırma içine ekstrapole edilebilir, insan hastalar, birincil kan hücrelerinin izolasyonu için bir temel olarak hizmet vermektedir. MACS ayırma tam kan ile irtibata hücrelerin izole edilmesi olanağını sunan güvenilir bir hücre izolasyonu bir tekniktir, ancak bu yöntem, antikorun daha fazla miktarda gerektirir ve bu yöntem de tarif edildiği gibi, dört farklı hücre tiplerinin izolasyonu için uygun değildir. B var olaneen bir kanıt aktivasyonuna MACS ayırma sonuçları ile lökositlerin, pozitif seçim eden izolasyon protokol kullanılarak olduğunu göstermek için kullanılır. MACS sütun 50 nm süperparamanyetik parçacıklar konjüge edilmiş antikorlar kullanılarak bir manyetik alan içinde işaretli hücrelerin tecrit edilmesiyle çalışır. Etiketli hücreleri, kolona kapalı elüte edilir. Pozitif ve negatif seçimleri hızlı izolasyon ve saflığı sağlamak için bu protokolü uygulanmaktadır. Vasat hücre sayıları izolasyonu elde edilen veya saflıkta söz konusu olduğunda ise, daha fazla antikor, yüksek saflıkta (Tablo 2) neden olabilir LS kolonu boyunca satıcının talimatları ve ikinci geçit göre numuneye ilave edilebilir. Bizim laboratuvar FACS analizi 8 ile son hücre süspansiyonları analiz ederek, mevcut protokolü kullanarak yüksek saflık ve kaplama verimliliği bulundu. Ekstrasellüler akı analizörleri ot o zamanla gerçek oksijen tüketimini ve medya asitleştirmenin hem izlemek için yeteneği varonun elektrotlar. DPI 8 ile engellenmesi ile gösterildiği gibi, monositler ve nötrofillerde oksidatif patlama tepki ile görüldüğü gibi, oksijen tüketimi, NADPH oksidaz bağlıdır. Biz uzun süreli izolasyonların veya genişletilmiş XF deneyleri ile oksidatif patlama kapasitesi bir zamana bağlı kaybını gördük. Bu protokol tasarlanmış ve geliştirilmiş XF24 üzerinde kullanım için değil, aynı zamanda, yaklaşık olarak üçte yoğunlukları tohumlama XF24 hücrenin bir yarısı (Şekil 3) XF96 uyumlu edildi. Bu protokolün tasarımında, her bir teknik için mevcut protokollere bağlılık sadece bioenergetic analizi için ortam koşullarını kontrol için yapılan değişiklikler ile optimum performans için gerekli oldu. Teknikleri mastering sonra, böyle bir protokol, tedavi stratejilerinin toksisite veya etkinliğini ölçmek hastalığı metabolik özelliklerini keşfetmek ve monosit ve neut&#39;ait oksidan üretimi için öteleme ve araştırma uygulamaları geniş bir yelpazede kullanılabilirenflamatuar koşullarda rophils.

Bağışıklık hücreleri (monositler, lenfositler, nötrofiller) ve kandan trombositler bioenergetic sağlık izleme bireyin genel bioenergetic sağlığını değerlendirmek için potansiyel olarak yararlı bir tanı aracı olarak bir süre için kabul edilmiştir. Kanser, kardiyovasküler hastalıklar ve mitokondriyal disfonksiyon 1,2 &#39;nörodejeneratif hastalıklar gibi bir dizi hastalıkların atfederek edebiyat yükselen bir vücudu var. Mitokondriyal işlev bozukluğu pro-inflamatuar sinyal yolları teşvik etmek ya da hücre ölümüne yol açan hücresel olaylar bir dizi başlatabilir, bu durum klinik açıdan önemlidir. Pek çok çalışma, fibromiyalji, diyabet, septik şok, ve Alzheimer hastalığı gibi durumlarda 3-7 periferal kan tek-çekirdekli hücreleri ve trombositler mitokondriyal fonksiyonu tanımlanmıştır. Örneğin, yeni bir çalışma, mitokondriyal işlevi için bir işaretleyici olarak, trombositler &#39;in biyo enerjisini değerlendirildi ve bulunan Tip 2 Diabet gelen trombositleric hastalar mitokondriyal oksijen tüketimi 7,8 azalmıştı. Bu bulgular ve diğerleri, onlar sistemik dolaşıma anket, yerel ve global metabolik değişiklikleri yansıtıyor olabilir beri monositler, lenfositler, nötrofiller, trombositler ve patolojik koşullar altında Bioenerji değişikliklerin vekil belirteçleri hizmet açıktır. Bu yaklaşım prognostik veya tanısal değeri yüksek bir verimlilik analizi yöntemi ve hücre hazırlanması için tutarlı bir yöntem gereklidir olup olmadığını belirlemek için. Lökosit ve platelet mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için yöntemler daha önceleri sağlam hücrelerde 4,9 hücresel biyoenerjitiklerin mitokondri veya değerlendirme izolasyonunu kapsamıştır. Bir hücre dışı akı (XF) analizör kullanılarak cep bioenergetic değerlendirme avantajı hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu, proton kaçak ve maksimal solunum gibi endojen substratların ve solunum parametreleri ile kurulmuş olmasıdırkapasitesi tespit edilebilir. Biz ve diğerleri trombositlerde bioenergetic profiller, insan kanından izole edilen monositler ve lenfositler kurulmuş ve hücre tipleri 8 arasında karşılaştırılabilir olduğunu göstermek için bu teknolojiyi kullanmıştır. Buna ek olarak, hem nötrofiller ve monositler NADPH oksidazlar aktive edildiği bir oksidatif patlama kapasitesine sahip ve süperoksit oluşturulması için oksijen tüketir. Önemlisi, bu yolun doğal bağışıklığın önemli bir bileşenidir ve sistemik inflamasyon ile modüle edilir. Örneğin, oksidatif patlama kapasitesinde değişiklikler, multipl skleroz, artrit, ve tekrarlayan enfeksiyonlar 10,11 gibi çeşitli oto-bağışıklık hastalıkları ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Şu anda klinik örneklerde oksidatif patlama ölçmek için uygun herhangi bir yüksek verimli deneyler, nicel vardır. Nötrofil ve monositlerin oksidatif patlama kapasiteleri karakterize ayrıca çeşitli patolojiler için önemli bir teşhis aracı olarak hizmet edebilir çünkü bu önemlidirara yüzleri. Anahtar teknik zorluklar, geleneksel polarografik teknikler kullanılarak oksijen tüketiminin ölçülmesi ve daha duyarlı mikroplâka florometrik teknikleri kullanırken bağlı hücreleri kullanmak için ihtiyacı için düşük duyarlılık olmuştur. Bu pratik video, biz bu sorunlara teknik çözüm açıklar. Bu detay monositler, lenfositler, nötrofiller ve monositler ve trombositler ve İnsan kanından nötrofil oksidatif patlama biyoenerjitiklerin izolasyonu, kaplama ve ölçüm için yöntemler. Bu yöntem sahip araştırmacılara biyoenerjitiklerin ve oksidatif patlama, klinik değerlendirme için uygundur bir hasta popülasyonu ve taze kan örnekleri elde etmek için yeteneği erişim.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="860">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-094-833</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;"><a name="RANGE!A3">CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human</a></td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-050-501</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD61 MicroBeads, human&#160; for platelets</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-051-101</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD14 MicroBeads, human&#160; for monocytes</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-050-201</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">CD15 MicroBeads, human&#160; for granulocytes</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-046-601</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">LS Columns</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-042-401</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">BD Vacutainer ACD Blood collection tubes</td>
			<td style="width:215px;">Fisher</td>
			<td style="width:215px;">02-684-26</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:215px;">Gibco</td>
			<td style="width:215px;">11835-030</td>
			<td style="width:215px;">with L-glutamine and without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Prostaglandin I2, sodium salt</td>
			<td style="width:215px;">Cayman</td>
			<td style="width:215px;">18220</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">1.5 ml semi-micro cuvettes</td>
			<td style="width:215px;">Phenix Research Products</td>
			<td style="width:215px;">SC-2410</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Histopaque density gradient, specific gravity 1.077</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">10771</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Histopaque density gradient, specific gravity 1.119</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">11191</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td style="width:215px;">Roche</td>
			<td style="width:215px;">3117405001</td>
			<td style="width:215px;">fatty-acid ultra-free</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">P8139</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">XF24 FluxPak</td>
			<td style="width:215px;">Seahorse Biosciences</td>
			<td style="width:215px;">100850-001</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DMEM</td>
			<td style="width:215px;">Fisher</td>
			<td style="width:215px;">MT90113PB</td>
			<td style="width:215px;">w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">L-Glutamine, 200mM (100x)</td>
			<td style="width:215px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:215px;">25030-081</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">G7528</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">P8574</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Cell-Tak (cell adhesive)</td>
			<td style="width:215px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:215px;">CB-40242</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Oligomycin</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">O4876</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">A8674</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td style="width:215px;">Sigma</td>
			<td style="width:215px;">C-2920</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent A</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0113</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent S</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0015</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">DC Protein Assay Reagent B</td>
			<td style="width:215px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:215px;">500-0114</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Equipment</td>
			<td style="width:215px;">Vendor</td>
			<td style="width:215px;">Product #</td>
			<td style="width:215px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Seahorse</td>
			<td style="width:215px;">Seahorse Biosciences</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td>
			<td style="width:215px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:215px;">130-090-976 and 24039</td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:215px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
			<td style="width:215px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets

Mitokondriyal işlev bozukluğu örneğin ateroskleroz, diyabet, septik şok, ve nörodejeneratif hastalıklar ama zordur hastalarda bioenergetic fonksiyonunda değişikliklere değerlendirilmesi gibi patolojik durumların bir çok önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. , Diyabet ya da mevcut ateroskleroz gibi hastalıkların klinik spesifik organ yetmezliği, hiperglisemi ya da iltihap gibi patoloji sistemik bileşenleri, lökositler veya trombosit dolaşan bioenergetic işlevini değiştirebilir olsa da. Bu kavram, bir süre için kabul edilmiştir ancak yaygın uygulama bioenergetic analiz için gerekli birincil hücrelerin büyük sayısına göre kısıtlanmıştır. Bu teknik bir kısıtlama hücrelerin mikro aktivasyon olmadan bağlı izin manyetik boncuk ayırma teknikleriyle, hücre yapışma teknikleri özgünlüğünü birleştirerek üstesinden gelmek olmuştur ve yeni teknolojilerin hassasiyeti yüksek kapasiteli mikrofon için tasarlanmışroplate Respirometrik. Bu cihazın bir örneği dışı akı analizörü. Bu alet, tipik olarak daha sonra metabolizması ile ilgili olabilir yapışık hücrelerindeki bu parametreleri değişim oranlarını ölçmek için oksijen ve pH duyarlı probları kullanır. Burada ayrıntılı insan kanı ve bu hücrelerde mitokondriyal bioenergetic işlevinin analizi, aktivasyon olmaksızın, monositler, lemfositler, nötrofiller ve trombositlerin izolasyonu ve kaplama için YÖNTEM. Buna ek olarak, monositler ve nötrofillerde oksidatif patlama aynı örneklerde ölçülebilir gösterilmektedir. Bu yöntemler, sadece 8-20 ml insan kanı kullandıkları bir klinik ortamda reaktif oksijen türlerinin üretimi ve biyo enerjisini izleme için potansiyele sahiptir.

Kan hücrelerinin biyo enerjisini değerlendirmek için, tam kan, EDTA vacutainer ACD ya da bir toplama tüpü içinde damar delme ile insan deneklerden toplanır. Protokol ayrıntılı olarak lökositlerin, kan toplama aşağıdaki plakalarının izolasyon işlemi Şekil 1A görüntülenmiştir. Tüm kan numuneleri hücre ölümü ve aktivasyonunu önlemek için toplama 8 saat içinde işlenir. 8 saat daha fazla genişletilmiş depolama kez test edilmiş değil ama değişmiş Bioenerji yol ve fizyolojik koşulların daha az temsilcisi olabilir. Asit sitrat dekstroz (ACD-8 mi) ve EDTA vacutainer tüpler izole edilmiş hücrelerin bioenergetic fonksiyonu üzerinde gözlenen etkisi ile hücre izolasyon için kullanılmıştır. Pıhtılaşması, elde edilen hücre sayısını azaltmak Ficoll gradyan santrifüj sırasında doğru faz formasyonu engelleyebilir ve santrifüj serum elde edilen herhangi bir trombositler az neden olarak antikoagülanlar gereklidir. Tüm kan biyolojik bir temsil edernik tehlike ve uygun kişisel koruyucu ekipmanlar hücre popülasyonları izole edilir veya hücre lizatlan oluşturulur sonra bile tüm prosedür boyunca uygulanması gerekmektedir. Örnekleri kurumun insan atık bertaraf standartlarına uygun olarak bertaraf edilmelidir. Tam kan buffy coat, lökositleri içeren sadece dolu kırmızı kan hücreleri üzerindeki beyaz tabakadan platelet bakımından zengin plazma ayırmak için santrifüj edilir. İnce beyaz tabaka yoğunluk dereceleri uygulanabilir ve periferal kan mononükleer hücreleri (monositler ve lenfositler) ve polimorfonükleer hücreleri (granülositler) elde etmek için santrifüjlenir. Bireysel MNC ve PMN hücre fazların RBC kirlenmesi bu aşamada ortak ve MACS saflaştırılması sırasında çözülmesi gerekir. Çeşitli hücre tipleri daha sonra saf elde etmek üzere, manyetik antikorlar ile kuluçkaya yatırılması ile elde edilir. Monositler CD14, t ileri akış ile PBMC fraksiyonu inkübasyon ile toplanıro da eritrosit ve trombosit tükenmiş lenfositler, monositler içerir. Nötrofiller CD15 antikoru (Şekil 1A) ile polimorf hücre tabakasının kuluçkaya yatırılması ile elde edilir. Bundan sonra, trombositler trombosit açısından zengin plazma santrifüj ile topaklanır ve diğer plazma bileşenleri çıkarmak için yıkanabilir. Bu seçimler sonra trombositler, CD14 +, monositler, lemfositler, CD15 + nötrofil oksidatif patlama biyoenerjitiklerin ve analizi için bir hücre yapışma orta kaplı XF analiz plaka üzerinde sayılır ve kaplama olabilir. Prosedürün her bir aşaması, steril koşullarda gerçekleştirilmelidir ve monositler ve nötrofillerde oksidatif patlama tepkisinin vaktinden önce aktivasyonunun engellenmesi için teşvik edilmektedir. Bazal koşullar altında herhangi bir oksijen tüketimine az olması, nötrofiller,, yüksek OCR ölçümleri ile hücre dışı akı tahlili başlar izolasyonu sırasında, steril koşullar altında bir göstergesi belirgin olduğunuyavaş yavaş artırmak veya tahlil boyunca düşüş. Biz bir aktivasyon morfolojik işaretleri önce tahlil meydana gelmiş olmasını sağlamak için 200X veya daha fazla bir ışık mikroskobu kullanarak hücrelerin görüntülenmesi önemini vurgulamak. Şekil 1B &#39;de görüldüğü gibi, örneğin, nötrofiller, normal belirgin hücre sınırları ile düzensiz bir şekle yuvarlak gösterir. Bununla birlikte, bu hücreler aktive edildiğinde, plakanın yüzeyine karşı düzleştirmek ve ayrı hücre morfolojisi kaybeder. Biz daha önce bu protokolü kullanarak aktive lökositlerin ve trombositlerin morfolojik değişiklikler rapor ve aktivasyonunu 8 karşılaşmadan ise ek önlemler steril koşulları sağlamak için alınmalıdır. Protokolün basitleştirilmiş bir şeması, hücre izolasyonu, XF plaka hazırlanması ve XF tahlilin temel adımlar ayrıntılı olduğu bir zaman çizelgesi, Şekil 2&#39;de görülmektedir. İzolasyon yoğunluk gradyan hücre tiplerinin ayrılması ve oluşmaktadırmanyetik ayırma ile takip edilir. Hücre izolasyon sürecine paralel, XF plaka hazırlama hücre kaplama veya XF tahlil başlayan gecikmeleri önlemek için gereklidir. Önemli gecikmeler hücre aktivasyonu ve azalmış biyoenerjetiğin parametreleri yol açabilir, çünkü bu önemlidir. Izolasyondan sonra yetersiz hücre konsantrasyonları ortak bir sorun ve her santrifüj işleminin optimizasyonu hücre kaybını önlemek için gerekli bulunmaktadır. Başarılı izolasyon kan az 6 ml kadar gerçekleştirilen ancak değişiklikler arzu edilen hücre tipi dolaşım konsantrasyonları bağlı olarak yapılabilir. Yoğunluk gradyan yanlış hazırlanmış ise, farklı hücre fazlar görünür olmayabilir ve hücrelerin kaybı (bir görsel gösteri için vallahi öğretim video) oluşabilir. PRP izole yetersiz trombosit nadirdir fakat izolasyon oda sıcaklığının altında yer alırsa yıkama tamponu PGI 2 içeren veya yoksa oluştu. Platelet a riskitrombosit izole edilmesi son hücre olup olmadığını ctivation genellikle engellenmektedir; trombosit uzun bir süre için yıkama tamponu içinde kalır, ancak, biyoenerji etkilenecektir. 1.500 xg santrifüj sırasında pelet vermedi ve bu hücrelerin biyoenerji yoğun karakterize edilmemiştir küçük trombosit nüfus örneği olmuştur. Daha eksiksiz bir sorun giderme kılavuzu için Tablo 2&#39;ye bakınız. Lökositlerin ve trombositlerin bioenergetic profilleri, invaziv olmayan hücrelerde gerçek zamanlı O 2 tüketimini ölçer XF analiz kullanılarak belirlenebilir. Şekil 3A&#39;da gösterildiği gibi, her bir hücre tipi beş kez tekrarlanmış olan XF24 plaka üzerine yerleştirilir. Tablo 1 göstermektedir Oyuk başına deneyde ve ortalama protein konsantrasyonları sırasında hücre tipi tarafından beklenen bazal ve oksidatif patlama değerleri. Daha yüksek verim sağlayan teknolojiler, XF96 olarak mevcutturŞekil 3B&#39;de gösterildiği gibi, eş zamanlı olarak değerlendirilmelidir dört donör. Deneyinden sonra, veriler uygun XF yazılımı ve Microsoft excel kullanarak analizi için bir çalışma istasyonu bilgisayara ihraç edilmektedir. OCR değerleri tekabül eden gözleri içindeki toplam protein muhtevasına göre normalize ve pmol / dak / mg protein olarak ifade edildi. Her hücre tipinin temsilcisi bioenergetic-oksidatif patlama profilleri son zamanlarda bizim grupta 8 tarafından bildirilmiştir. Daha önce gösterildiği ve aşağıda tarif edildiği gibi, 8 deneyi (bazal, ATP-bağlı, proton sızıntı, maksimal, nonmitochondrial ve oksidatif patlama) arasında bioenergetic parametrelerinin daha fazla analizi, her bir gözeneğinden için hesaplanabilir. Şekil 4A&#39;da gösterildiği gibi, taban oksijen tüketim hızı (OCR) ilk 3 ölçümleri ile kurulur. Oligomycin (0.5 ug / ml), mitokondrial ATP-sentaz inhibitörü OCR ATP sentezi ve temsilcisi bağlanmış tahmin etmek için XF ortam enjekte edilir<html> ted ATP-bağlı olarak. Kalan OCR eksi nonmitochondrial OCR proton sızıntısı isnat edilebilir. Daha sonra FCCP bir uncoupler oksijen tüketiminin nonmitochondrial kaynaklarını belirlemek için antimycin-A, ardından maksimum OCR, mitokondriyal solunum inhibitörü, belirlemek için ilave edilir. Yedek kapasite enerji talep altında üretilebilir ve solunum maksimum hızı ve bazal arasındaki fark olarak hesaplanır ATP miktarının bir ölçüsüdür. Oksidatif patlama kapasitesini belirlemek amacıyla, forbol 12-miristat 13-asetat (PMA), bir PKC agonist NADPH oksidaz etkinliği geliştirmek için enjekte edilir, ve PMA uyarımı şu oksijen tüketim oranı artış XF analiz cihazı kullanılarak ölçülebilir. Şekil 4b mitokondriyal fonksiyonu ve oksidatif patlama farklı parametreleri hesaplamak için nasıl göstereceğim. <html> 1301/51301fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51301/51301fig1.jpg &quot;/&gt; Kandan lökosit ve trombosit Şekil 1.. İzolasyon. A) Taze toplanan örnekler santrifüj ile plazma ve hücre bileşenlerine ayrıldı ve Ficoll yoğunluk gradyanı ile arıtılmış ve trombosit yüksek izole edilir ise Manyetik Aktif Cell, pozitif (monosit ve nötrofil) ya da negatif seçim (lenfositler) tarafından (MACS) Sınıflandırma edilir kez XF DMEM yeniden süspanse ve belirtilen hücre yoğunluklarında kaplama izole hücre popülasyonlarının hızlı trombosit zengin plazmanın santrifüj. B) Görüntüler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51301/51301fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> ghres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51301/51301fig2.jpg &quot;/&gt; Hücre izolasyon ve kaplama ve kartuş hidrasyon ve enjeksiyon noktası yükleme ile XF24 deney plakasının hazırlanması için lökositlerin ve trombositlerin Bioenerjetik çalışmaları için XF24 plakalar Şekil 2.. Hazırlanması. Ayrıntılı zaman çizgisi. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51301/51301fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51301/51301fig3.jpg" /> XF24 ve XF96 analiz plakaları. A) Lökosit (125 250k hücre / çukur) ve tek bir vericiden gelen trombositler için (25 x 10 6 hücre / oyuk) üzerine, lökosit ve platelet Şekil 3,. Düzen arka arasında XF24 bir deney plakası üzerindeki plakalanır kontroller. 75 oligomycin 10x stok (0.5 ug / ml), FCCP (0.6 uM), antimycin-A (10 uM) ve ul ve XF ortam içinde seyreltilmiş PMA (100 ng / ml) yüklenirBelirtilen enjeksiyon noktalarına. B) lökositler (75-150K hücre / çukur) ve en fazla dört vericilerden de 6 hücre /) 180 ul DMEM içinde XF-toplam hacim içinde XF96 üzerinde kaplama olabilir trombositler (10 x10. Oligomycin (1.0 ug / ml) 10x stok 20 ul, FCCP (0.6 uM), antimycin-A (10 uM), ve PMA XF-DMEM içinde seyreltilmiş (100 ng / ml), belirtilen enjeksiyon girişine yüklenir. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51301/51301fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51301/51301fig4.jpg" /> Mitokondri ve monosit oksidatif patlama ile oksijen tüketim hızı (OCR) Şekil 4.. Bioenerjetik endeksleri analizi. A) Temsilcisi iz. Bazal OCR (çevrelerinde numaraları ile gösterilen ilk 3 oranları) kuruldu. Oligomycin of Daha sonra ardışık eklemeler (O, 0.5 ug / ml), FCCP (F, 0.6 uM) ve antibil-A (A, 10 uM) ve mitokondriyal aktive olmamış hücrelerin nonmitochondrial solunum belirlenmesi için enjekte edilmiştir. Son olarak, PMA (100 ng / ml) gösterildiği gibi mitokondriyal fonksiyon ve oksidatif patlama modüler analizi oranlarındaki farklar hesaplanır) oksidatif patlama. B ölçmek için ilave edilir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:215px;"></td><td style="width:215px;"> Optimal Seeding Yoğunluk </td><td style="width:215px;"> Ort. Bazal OCR (pmol O 2 / dak) </td><td style="width:215px;"> Ort. Oksidatif Burst OCR (pmol O 2 / dak) </td><td style="width:215px;"> Ort. protein (ug) / yuva </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;"> Monositler </td><td> 250K hücre / çukur </td><td> 83.9 (13.0 ±) </td><td> 300.3 (58,8 ±) </td><td> 19.0 (2.4 ±) </td></tr><tr height="40"><td height="40"style = &quot;height: 40px;&quot;&gt; Nötrofiller </td><td> 250K hücre / çukur </td><td> 6.1 (2.2 ±) </td><td> 1411,8 (233,3 ±) </td><td> 20.6 (2.7 ±) </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;"> Lenfositler </td><td> 250K hücre / çukur </td><td> 52.9 (7.7 ±) </td><td> 15 (4.1 ±) </td><td> 13.2 (± 2.1) </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;"> Trombositler </td><td> 25 x 10 6 hücre / çukur </td><td> 199.4 (20,3 ±) </td><td> 24 (2.7 ±) </td><td> 47.5 (3.1 ±) </td></tr></tbody></table> Tablo 1. XF24 tahlil için normal parametreleri: ortalama bazal (Oran 3) ve oksidatif patlama (Oran 7) OCR nonmitochondrial OCR veya proteine ​​düzeltilmiş değil belirtilen hücre yoğunluklarında kaplama hücre tipine göre gösterilmektedir. Bir DC Lowry testi ile gerçekleştirilmiştir olarak oyuk başına ortalama protein içeriği gösterilir. Bu veriler, ortalama değerleri temsil etmektedir± SEM içeren parantez ile 6-8 sağlıklı donörler. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="4" /></colgroup><tbody><tr height="66"><td> Adım </td><td> Sorun </td><td> Olası neden </td><td> Çözüm </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.2 </td><td style="width:199px;"> net plazma </td><td style="width:199px;"> Santrifüj sırasında topak haline trombosit </td><td style="width:199px;"> 10 dakika ya da 400 x yavaş için santrifüj süresini azaltmak </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;"> sütlü plazma </td><td style="width:199px;"> aşırı lipidler </td><td style="width:199px;"> tokluk toplama önlemek </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.6 </td><td style="width:199px;"> eksik hücre bantları oluşturulmuştur </td><td style="width:199px;"> küçük şeytanroper gradyan hazırlık, soğuk reaktif </td><td style="width:199px;"> pipetleme, kullanımı oda sıcaklığı ayıracı sırasında degrade bozmamak </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;"> hücre bantlarında kümeleri </td><td style="width:199px;"> kan pıhtılaşması meydana gelmiş olabilir </td><td style="width:199px;"> Böyle ACD veya EDTA gibi antikoagülan kullanan kan toplayın </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.10 </td><td style="width:199px;"> herhangi bir hücre peleti </td><td style="width:199px;"> adım 1.6 bakınız </td><td style="width:199px;"> Yüzer puslu aşağıya görürseniz </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;"> puslu yüzer </td><td style="width:199px;"> Ağır Ficoll gradyan kirlilik, platelet kirlenme </td><td style="width:199px;"> 900 xg, di santrifüj hızını artırınDaha RPMI ile lavta </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.16, 1.17 </td><td style="width:199px;"> lökositlerin düşük verim </td><td style="width:199px;"> Ağır RBC kontaminasyon, yeterli değil tam kan, pıhtılaşma </td><td style="width:199px;"> Çift antikor ve RPMI-BSA hacimleri, antikoagülan eklemek, daha fazla kan toplamak </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.19 </td><td style="width:199px;"> platelet agregasyon </td><td style="width:199px;"> PGI 2 ihmal, soğuk ortam, plazma içinde uzun süreli depolama için maruz </td><td style="width:199px;"> trombosit yıkama tamponu, kullanımı oda sıcaklığı ayıraçlara PGI 2 eklemek </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.20 </td><td style="width:199px;"> düşük trombosit sayısı </td><td style="width:199px;"> Birincil santrifüj, trombosit toplama sırasında zarar </td><td style="width:199px;"> Görmek1.2 ve 1.19 adımları </td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 2.3 </td><td style="width:199px;"> RBC kirlenme </td><td style="width:199px;"></td><td style="width:199px;"> MACS ayırma tekrarlayın </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Lökosit ve trombosit izolasyon sorun giderme. Tablo tam kan ve sorun giderme sürecinde kullanıcılara rehberlik edebilir çözümleri lökosit ve trombosit hücre izolasyonu sırasında karşılaşılan ortak sorunlar listelenmektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets at JoVE.com

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Kan lökositleri ve trombosit bireyin genel bioenergetic sağlığının bir belirteci olarak kullanılır ve bu nedenle patolojik süreçlerin ve tedavilerin etkisini izlemek için bir potansiyele sahip olabilir. Burada mitokondriyal fonksiyonu ve bu hücrelerde oksidatif patlama izole etmek ve ölçmek için bir yöntem tarif eder.

İnsan lökosit ve trombosit İzolasyonu ve Değerlendirme Protokolleri: Biyoenerji ve Oksidatif Burst

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

bioenergetics-oxidative-burst-protocols-for-isolation-evaluation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

36.9K Görüntüleme.  University of Alabama at Birmingham.  Kan lökositleri ve trombosit bireyin genel bioenergetic sağlığının bir belirteci olarak kullanılır ve bu nedenle patolojik süreçlerin ve tedavilerin etkisini izlemek için bir potansiyele sahip olabilir. Burada mitokondriyal fonksiyonu ve bu hücrelerde oksidatif patlama izole etmek ve ölçmek için bir yöntem tarif eder. 

Video: Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

Beyin-infiltre lökositler izolasyonu

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

Den Beyin sekestre Lökositler İzolasyonu ve Analizi<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-enfekte Fare

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

Akış adlı lökositlerin üzerine Stromal hücreler Etkilerinin İncelenmesi

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

İnsan Kanı Ölçüm Granülosit ve Monosit Fagositoz ve Oksidatif Burst Etkinlik

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure the strength of immune activation in Arabidopsis thaliana following treatment with elicitor molecules. Presented first is a method for capturing the rapidly-induced and dynamic oxidative burst, which can be monitored using a luminol-based assay. Presented second is a method describing how to measure immune-induced inhibition of seedling growth. These protocols are fast and reliable, do not require specialized training or equipment, and are widely used to understand the genetic basis of plant immunity.

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

This paper describes two methods for quantifying defense responses in Arabidopsis thaliana following exposure to immune elicitors: the transient oxidative burst, and the inhibition of seedling growth.

Arabidopsis thaliana 'Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Isolation of Leukocytes from Human Breast Milk for Use in an Antibody-dependent Cellular Phagocytosis Assay of HIV Targets

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect of breast milk (BM). Unless access to clean water and appropriate infant formula is reliable, the WHO does not recommend cessation of breastfeeding for HIV-infected mothers. Numerous factors likely work in tandem to reduce BM transmission. Breastfed infants ingest ~105&#8722;108 maternal leukocytes daily, though what remains largely unclear is the contribution of these cells to the antiviral qualities of BM. Presently we aimed to isolate cells from human BM in order to measure antibody-dependent cellular phagocytosis (ADCP), one of the most essential and pervasive innate immune responses, by BM phagocytes against HIV targets. Cells were isolated from 5 human BM samples obtained at various stages of lactation. Isolation was carried out via gentle centrifugation followed by careful removal of milk fat and repeated washing of the cell pellet. Fluorescent beads coated with HIV envelope (Env) epitope were used as targets for analysis of ADCP. Cells were stained with the CD45 surface marker to identify leukocytes. It was found that ADCP activity was significant above control experiments and reproducibly measurable using an HIV-specific antibody 830A.

Breast milk transmits human immunodeficiency virus (HIV), though only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected. Breastfed infants ingest ~105&#8722;108 maternal leukocytes daily, though these cells are understudied. Here we describe the isolation of breast milk leukocytes and an analysis of their phagocytic capacity.

Hiv Hedeflerinin Antikorbağımlı Hücresel Fagositoz Sataşanında Kullanılmak Üzere İnsan Anne Sütünden Lökositlerin İzolasyon

Even in the absence of antiretroviral drugs, only ~15% of infants breastfed by HIV-infected mothers become infected, suggesting a strong protective effect ...