Açıklanan çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü Ödülü Numarası U54CA143876 aracılığıyla Mikroçevre &amp; Metastaz üzerine Cornell Merkezi tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Kanser Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmez. Bu çalışma ayrıca, Ulusal Bilim Vakfı Doktora Araştırma Bursu (ADH) tarafından kısmen finanse edildi.

Aşağıdaki protokol tek bir mikrotüp cihazın üretimi için. 1. Halloisit Nanotube Çözüm hazırlanması <ol><li> Sonikasyon (10-13 W (RMS)) 250 uL halloysitten nanotüp solüsyonu (su içinde ağırlıkça% 6.6) 30 sn. Bir kez soğuk su ve tekrar sonication ile serin bir çözüm. Tekrar soğutun. </li><li> Bir şırınga içine sonike çözüm çizin, bir 0.45 mikron şırınga filtre takın ve temiz mikrofuge&#39;de tüpe filtre çözüm. Homojenliği sağlamak için zaman zaman Vortex çözüm. </li></ol> 2. Halloisit Nanotüpler ile mikrotüp İç Yüzey Kaplama <ol><li> 50 cm Micro-Renathane microtubing uzun bölümü (300 mikron iç çapı, 35.3 uL iç hacmi) edinin. Diyagonal bir anda mikrotüp bir ucunu kesin ve küçük bir IDEX adaptör parça takın. Mikrotüp diğer ucunda bir 3/10 cc 29G şırınganın iğne yerleştirin. </li><li> Mikrotüp temizlemek için, mikrotüp açık ucundan (ucu yerleştirmekadaptör ile)% 70 etanol ve çekilişe ~ şırıngaya 50 uL etanol mikrotüp doldurmak için. </li><li> Şırıngaya distile su cömert bir hacim çizerek mikrotüp dışarı etanol durulayın. </li><li> Mikrotüp gelen şırınga ayırmak, şırınga boşaltılması ve ardından mikrotüp için takın. </li><li> % 0.02 su içinde a / h poli-L lisin çözeltisi hazırlayın. Mikrotüp içine 50 uL çizin ve oda sıcaklığında (RT) az 5 dakika oturup bekleyin. </li><li> Mikrotüp içine 100 uL filtre nanotüp çözüm çizin ve RT az 3 dakika inkübe sağlar. </li><li> Nanotüp çözüm durulama mikrotüp ile 100 uL su çizin. RT gece, su ile dolu, oturup kaplı mikrotüp izin verin. </li></ol> 3. Hücre İzolasyon için mikrotüplerdeki hazırlanması <ol><li> 1X Dulbecco fosfat içinde 10 ug / mL protein G çözeltisi hazırlayın (- 7.2 PBS, pH 7.0) tamponlu tuz. Mikrotüp ile 50 uL PBS çizin ve sonra 50 uL çekmekProtein G-solüsyonu ve oda sıcaklığında 1,5 saat inkübe izin verir. </li><li> 5 ug / mL E-selektin-IgG ve PBS içerisinde 50 ug / mL antikoru (en kanseri numuneler için, anti-PSMA prostat kanseri numuneler için anti-EpCAM) ihtiva eden bir solüsyon hazırlanır. Mikrotüp içine E-selektin ve antikor çözeltisi 50 uL çekecek ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe izin verir. </li><li> Nonspesifik hücresel adezyon% 5 süt proteini bloke edilir. % 5 (a / h) PBS içinde süt proteini çözeltisi hazırlayın. Mikrotüp içine 50 uL süt proteini çözeltisi çekecek ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe izin verir. </li><li> Tüpe 50 uL PBS çizin ve kan veya buffy coat örnekleri işlem için hazır olana kadar oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Önceden izolasyon için mikrotüp kullanılarak ila 10 dakika, selektin molekülleri aktive Ca2 + (&quot;PBS +&quot;) ile doyurulmuş olan 50 uL PBS çizer. </li></ol> 4. Hücre izolasyon için örneklerinin hazırlanması <ol><li> Hasta heparinize içine 10 ml kan çizin veya eldetüp. </li><li> 50 ml santrifüj tüpüne Yeri 10 ml Ficoll-Paque lenfosit izolasyonu çözüm. Ficoll üstüne hafifçe tabaka 10 ml tam kan, böylece kan ve Ficoll karıştırmak değil. </li><li> ° C ile 4 Minimal yavaşlama azından 15 dakika süreyle 2000x g&#39;de santrifüj;. </li><li> Yeni tüp buffy coat tabakası ve yer çıkarın. </li><li> PBS ile yıkama buffy coat (10 dakika 230X g de santrifüj, süpernatant atın). </li><li> Yavaşça 1 ml eritrosit lizis tamponu ile tekrar süspansiyon hücreleri ve eritrositler lyse RT az 10 dakika inkübe edilir. </li><li> 10 ml PBS, yavaşça karıştırın ve 10 dakika 230X g santrifüj ekleyin. Süpernatant atın ve yavaşça 4 ml PBS + için 3 pelletini. </li></ol> 5.. Hücre izolasyonu <ol><li> IDEX bağdaştırıcılar kullanılarak bir 5 mL şırıngaya fonksiyonlandırılmış mikrotüp bir ucunu. </li><li> Bir şırınga pompası üzerine şırınga yerleştirin. </li><li> Hücre suspensio inmeye fonksiyonlandırılmış mikrotüp açık ucundann. </li><li> 1-4 mL / saat hızda mikrotüp yoluyla hücre süspansiyonu işlemek. </li><li> PBS içeren bir tüpe mikrotüp açık ucuna transfer + ve mikrotüp ilişkisizleştirilir ve gevşek bağlı hücreleri çıkarmak için 0.016 ml / dk şırıngaya 300 uL PBS + çizin. </li><li> Temiz bir tüp içine mikrotüp açık ucuna yerleştirin. Mikrotüp gelen şırınga çıkarın ve Accutase ile doldurulmuş bir şırınga takın. Yavaşça doldurmak için mikrotüp (~ 50 uL) içine yeterince Accutase serpmek ve 10 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe izin verir. </li><li> Toplama, mikrotüp içine 1 büyüme ortamı mL (% 79 RPMI,% 20 FBS,% 1 penisilin streptomisin) ve yayma ile doldurulmuş bir şırınga takın doku kültürü içine atık plaka iyi muamele. </li><li> 37 de kültüre hücreleri ° C ile nemlendirilmiş koşullar altında% 5 CO2. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Bu tekniğin amacı, kanser hastalarında kan uygulanabilir kanser hücreleri izole etmek için bir. Çeşitli yöntemler kültüründe kanser hücrelerini tanımlamak için vardır; cihazın başarısı için gerekli bir doğrulama. Biz, sağlam hücre çekirdeğine (Şekil 2 ve 3) tespit etmek DAPI ek olarak, bu tür EpCAM (epitel hücre adezyon molekülü) veya PSMA (prostat spesifik membran antijeni) epitel yarımlar karşı antikorları ile kültür içinde hücreleri leke seçmiştir. Kanser hücrelerinin sayısı, bu teknik kullanılarak ille başlangıç ​​numunedeki nedenle kapalı zaman eğrileri sayısının bir fonksiyonu olduğu, ve hastanın değişkenliği yüksek olabilir yakalanır. Evre IV kanser tanısı almış hastalardan alınan numuneler işleme, biz rutin saflıklarda kan tüp başına 100 ve 500 arasında kanser hücrelerini,&gt;% 50 yakalamak. Hemen izolasyon ardından, kontamine lökositlerin fazla sayıda mevcut olabilir. Ancak bu rakamlar kadar 5 gün için kültür ortamında aşağıdaki kuluçka tüketilmiş olacaktır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <strong&gt; Şekil 1. antikor-aracılı statik yapışma takip selektin aracılı haddeleme gösteren CTC izolasyonu için fonksiyonlandırılmış mikrotüp şematik. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> Şekil 2. Kan örneklerinden CTC izolasyon Temsilcisi verileri bir meme kanseri hasta ve bir akciğer kanseri hastanın çekilen. CTC EpCAM boyama dayalı olarak tanımlanan uygulanabilir pozitif hücrelerin sayısı CTC yakalanan hücrelerin sayısı ile karşılaştırıldığında katı çubukları ve sol ordinat ve tespit edilmiştir hücrelerin yüzdesi ilgilendirmeyen ile temsil edilen açık çubuklar ile temsil edilir ve Sağ ordinat üzerinde ölçüldü. Sonuçlar kültür beş gün takip ediyoruz. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> Isolati ila 5 gün sonraki kültüründe CTC ayrı donör (A ve B) den Şekil 3. Örnek mikrografikleriBir kanser hastasının kan örneği üzerinde. Hücreler floresan çekirdeği (mavi) görselleştirmek için AlexaFluor 488 (yeşil) ve 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile EpCAM için boyandı.

<ol>
	<li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases.">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobiotechnology+for+the+capture+and+manipulation+of+circulating+tumor+cells.">Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).</li><li>Hughes, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtube+Device+for+Selectin-Mediated+Capture+of+Viable+Circulating+Tumor+Cells+from+Blood.">Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood.</a> Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).</li><li>Hughes, A. D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+naturally+occurring+halloysite+nanotubes+for+enhanced+capture+of+flowing+cells.">Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells.</a> Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).</li><li>Al-Mehdi, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+origin+of+metastasis+from+the+proliferation+of+endothelium-attached+tumor+cells:+a+new+model+for+metastasis.">Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis.</a> Nat. Med. 6, 100-102 (2000).</li><li>Gupta, G. P., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+metastasis:+Building+a+framework.">Cancer metastasis: Building a framework.</a> Cell. 127, 679-695 (2006).</li><li>Lee, D., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing+of+P-Selectin+Increases+the+Rate+of+Neutrophil+Recruitment+Under+Shear+Flow.">Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow.</a> Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).</li><li>Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selectins+and+selectin+ligands+in+extravasation+of+cancer+cells+and+organ+selectivity+of+metastasis.">Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis.</a> Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).</li><li>Geng, Y., Marshall, J., King, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycomechanics+of+the+Metastatic+Cascade:+Tumor+Cell-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Circulation.">Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 .</li><li>Stott, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip.">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).</li></ol>

MRK CellTraffix, Inc (Rochester, NY) bilimsel danışmanı.

Genellikle yeni kanser tedavi keşfi erken adımları birincil kanser hücrelerinin şüpheli benzemeyenlerdendi kanser hücre hatları, henüz laboratuvar kullanım kolaylığı nedeniyle kullanmak kalır kullanan bu böyledir. Birincil insan kanser hücreleri erken roman araştırma yararlanılmıştır eğer yeni kanser tedavilerinin geliştirilmesine yönelik araştırmalar hızlandırılmalıdır olacaktır. CTC kanlarında varlığı ve standart bir kan beraberlik kolaylığı sayesinde kanser hücresinin en kolay ulaşılabilir tipi vardır. Buna ek olarak, dolaşımdaki tümör hücreleri metastazı 5,6 sürecinde gerekli bir aşama temsil eder, böylece yeni bir ilaç hedefleme için hastalığı ve yarar önemleri açıktır. In vitro kandan CTC izolasyonu onların düşük konsantrasyonlarda da karmaşık hale geliyor: Bir milyon nüfus başına lökosit veya eritrosit 7 milyar başına bir sırasına. Tek FDA onaylı tekniği Hücre dahil olmak üzere, kanda CTC tespit için mevcut yöntemlerin çoğunluğu<html> Arama (Veridex), hasar veya numaralandırma ötesinde kullanımı engelleyen, algılama sürecinde hücrelerini yok. Yöntemi hücre canlılığı ödün vermeyen yukarıda açıklanan ve böylece kanser gelecekte yapılacak klinik araştırmalar için kapıyı açar. Sağlam hücreleri kurtarma bu tekniğin amacı olduğu için, hücreleri özellikle kan ayırma adımları sırasında, dikkatle şarttır. Örneğin kanser türü olarak kritik bir özelliğine göre geliştirilmiş verim elde etmek için değiştirilebilir olabilir, bu sistemde ayarlanabilir parametrelerin vardır. Yukarıda tarif edilen adımlar olarak, anti-PSMA kullanılan bileşikler, prostat kanseri örnekleri işlerken dışında tüm kanserler için bir CTC-özgü antikor olarak EpCAM kullanmak seçmiştir. Kansere özgü antikorların daha da kesin ikamelerini bireysel hastalar için performansını iyileştirmek için kullanılabilir. Dahası, selektin ve antikor konsantrasyonları yakalama 8 geliştirmek için değiştirilebilir. &quot;&gt; Cihazı elzem bir özelliği yüzeye E-selektin moleküllerinin birleşmesi. E-selektin normal endotelyal hücreler ve inflamasyon siteleri, hızlı hareket eden lökositlerin toplamak için fonksiyonun lümen yüzeyi üzerinde ifade edilir. Akan lökositlerin için geçici olarak bağlamak integrinler tarafından endotel hücre daha yavaş ve daha güçlü bir bağlayıcı kolaylaştıran bir yavaş, haddeleme davranış çıkan selektin moleküller. İkna edici deneysel kanıt CTC benzer bir mekanizma ile 9,10 extravasate olduğunu durumda yaptığı var. selektin eklenmesi de Cihaz yüksek debi de çalıştırılmasına olanak sağlar, aksi takdirde antikorlar 11 bağlanmasını hücreleri önleyecektir oranları. Böylece bizim cihaz fizyolojik biomimetically hücresel hasarı maruz kalmadan CTC akan yakalamak için bir venül taklit eder. Geliştirilmiş cihaz performansı lümen yüzeyine halloysitten nanotüp kaplamanın Ayrıca atfedilebilirCihazın. Önceki çalışmalar geliştirilmiş işlevsellik sağlıyor nanotüp kaplamanın üç ana bileşen olduğunu göstermiştir. İlk olarak, nanotüp kaplama yüzeyinin üzerinde daha büyük bir proteine ​​4 çökelmesine olanak, artan yüzey alanı sağlamaktadır. İkincisi, nanotüp kaplama atomik kuvvet mikroskobu yerine getirirken bireysel nanotüpler akışına yüzeyinden çıkıntı olduğunu tespit etti. Bu, hücre tüp 4 yoluyla çekilen ve önceki bunların yörüngesi içinde yüzeyine işe böylece selektin moleküller yüzeyi üzerinde bir gibi büyük bir mikron sunulabilir sağlar. Son olarak, halloysitten nanotüp kaplama lökosit yapışması önlemek ve CTC ile birlikte ele lökositlerin azaltılmış bir dizi izin veren, yüzey üzerinde yayılan ve böylece daha sonraki CTC saflıklarda 3 edebilmektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> 300 um ID hortum </td><td> Braintree Bilimsel </td><td> MRE025 </td></tr><tr><td> Şırıngaya bağlantı için büyük boru </td><td> IDEX Sağlık ve Bilim </td><td> 1507L </td></tr><tr><td> Pompa için 5 mL şırınga </td><td> BD </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Büyük tüp küçük Konnektör </td><td> IDEX Sağlık ve Bilim </td><td> P-770 </td></tr><tr><td> Şırıngaya Konnektör büyük boru </td><td> IDEX Sağlık ve Bilim </td><td> F-120 ve P-659 </td></tr><tr><td> Mikrotüp için Şırınga (3/10cc İnsülin Şırınga U-100 29G 1/2 &#39;) </td><td> BD </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> MP Biomedicals LLC </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol-Paque Artı </td><td> GE Healthcare Bio-Bilimleri AB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC Lizis Buffer (Tampon EL, 1000ml) </td><td> Qiagen </td><td> 1014614 </td></tr><tr><td> Protein G, 5 mg </td><td> Calbiochem (calbiochem.com) </td><td> 539303 </td></tr><tr><td> İnsan EpCAM/TROP-1 Antikor </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> PSMA Antikor (GCP-04) </td><td> abcam </td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> 96 oyuklu plakalar (Microtest 96) </td><td> BD Falcon </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> Blotting Sınıf Engelleyicisi Sigara Yağ Kuru Süt, 300g </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 216005508 </td></tr><tr><td> Halloisit Nanotüpler </td><td> NaturalNano </td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td> Kalsiyum Karbonat, 5g </td><td> Aldrich Kimya </td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> Orta RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td> Poli-L lisin% 0.1 w / v su içinde </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920-100ML </td></tr><tr><td> Sonic Dismembrator </td><td> Fisher Scientific </td><td> Model 100 </td></tr><tr><td> Sığır fetüs serumu </td><td> Atlanta Biyokimyasallar </td><td> S11056H </td></tr><tr><td> Penisilin Streptomisin </td><td> Sigma Yaşam Siiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

rapid isolation of viable circulating tumor cells from patient blood samples

Sirkülasyon tümör hücrelerinin (CTC) dolaşım sistemi boyunca primer tümörün yayılması ve nihayetinde uzak bölgelerde ikincil tümörler oluşabilir hücrelerdir. CTC sayımı, kan ve hastalığın şiddetine 1 in CTC konsantrasyonu arasındaki korelasyon üzerine dayanan hastalığın ilerleyişini takip etmek için kullanılabilir. Bir tedavi aracı olarak CTC kişiselleştirilmiş tedaviler geliştirmek için laboratuar okudu olabilir. Bu amaçla, CTC izolasyon hiçbir hücresel hasara ve özellikle diğer hücre tipleri, lökositler tarafından kontaminasyona neden gerekir, mümkün 2 olarak kaçınılmalıdır. CTC sayımı için tek FDA onaylı cihaz dahil, geçerli teknikleri, çoğu, (Daha fazla bilgi için Ref. 2) izolasyon sürecinin bir parçası olarak CTC yok. Uygulanabilir CTC yakalamak için bir cihaz mikroakışkan epiteliyal belirteçler 3 karşı antikorların yanısıra E-selektin glikoproteini ile fonksiyonelleştirilmiş bir yüzey oluşan, tarif edilmektedir. Cihazın performansı artırmak içinBir nanoparçacık kaplama Mance halloysitten nanotüpler, kil 4 hasat bir alüminosilikat nanoparçacık oluşan uygulanan edildi. E-selektin moleküllerin alternatif mikroakışkan cihazları üzerinde bir avantaj daha uzun işlem süreleri bir yüzey etkileşim için yeterli zamana sahip hedef hücreleri sağlamak için gerekli olan neyin kredi, cihaz üzerinden pompalanan hızlı hareket CTC yakalamak için bir yol sağlar. Epitel hedeflere antikorlar gibi izolasyon ayarlamak için, kolayca ayarlanabilir parametre sağlamak gibi, cihaza CTC-özgüllük sağlar. Son olarak, halloysitten nanotüp kaplama önemli ölçüde geliştirilmiş izolasyon, hızlı hareket eden hücreler yakalamak için yardımcı protein adsorpsiyonu için, yüzey alanı artırılmış sağlayarak ve tehlike lökosit 3,4 kovucu diğer tekniklere nazaran sağlar. Bu cihaz, off-raf malzemeleri kullanarak basit bir teknik ile üretilir, ve başarılı bir şekilde metastatik kandan kanser hücrelerinin yakalamak için kullanılmıştırkanser hastası. Yakalanan hücre izolasyonu takiben kültürde 15 gün için kadar korudu ve bu örneklerin genellikle her hastadan&gt;% 50 canlı primer kanser hücreleri oluşur edilir. Bu cihaz, seyreltilmiş ve tam kan buffy tabaka örneklerinin her iki canlı CTC yakalamak için kullanılmıştır. Sonuçta, biz Kişiye özel kanser tedavileri geliştirmek için bir klinik ortamda işlevselliği ile bir teknik sunduk.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples at JoVE.com

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Dolaşımdaki tümör hücreleri hücresel hasara maruz kalmadan kanserli hastaların kandan izole edilir. Tümör hücrelerinin izolasyonu epiteliyal belirteçler karşı antikorların yanısıra E-selektin bir iki moleküllü yüzey kullanılarak gerçekleştirilir. Bir nanotüp kaplama özellikle yüksek yakalama saflık sonuçlanan kanser hücre adezyon teşvik etmektedir.

Hasta Kan Örneklerinden Canlı Dolaşımdaki Tümör Hücreleri Rapid İzolasyonu

Circulating tumor cells (CTC) are cells that disseminate from a primary tumor throughout the circulatory system and that can ultimately form secondary ...

rapid-isolation-viable-circulating-tumor-cells-from-patient-blood

Research

JoVE Journal

Bioengineering

26.5K Görüntüleme.  Cornell University. Dolaşımdaki tümör hücreleri hücresel hasara maruz kalmadan kanserli hastaların kandan izole edilir. Tümör hücrelerinin izolasyonu epiteliyal belirteçler karşı antikorların yanısıra E-selektin bir iki moleküllü yüzey kullanılarak gerçekleştirilir. Bir nanotüp kaplama özellikle yüksek yakalama saflık sonuçlanan kanser hücre adezyon teşvik etmektedir.

Video: Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Detection and Isolation of Circulating Melanoma Cells using Photoacoustic Flowmetry

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed secondary tumors1,2,3. CTCs are indicators of metastatic disease and their detection in blood samples may be used to diagnose cancer and monitor a patient&prime;s response to therapy. Since CTCs are rare, comprising about one tumor cell among billions of normal blood cells in advanced cancer patients, their detection and enumeration is a difficult task. We exploit the presence of pigment in most melanoma cells to generate photoacoustic, or laser induced ultrasonic waves in a custom flow cytometer for detection of circulating melanoma cells (CMCs)4,5. This process entails separating a whole blood sample using centrifugation and obtaining the white blood cell layer. If present in whole blood, CMCs will separate with the white blood cells due to similar density. These cells are resuspended in phosphate buffered saline (PBS) and introduced into the flowmeter. Rather than a continuous flow of the blood cell suspension, we induced two phase flow in order to capture these cells for further study. In two phase flow, two immiscible liquids in a microfluidic system meet at a junction and form alternating slugs of liquid6,7. PBS suspended white blood cells and air form microliter slugs that are sequentially irradiated with laser light. The addition of a surfactant to the liquid phase allows uniform slug formation and the user can create different sized slugs by altering the flow rates of the two phases. Slugs of air and slugs of PBS with white blood cells contain no light absorbers and hence, do not produce photoacoustic waves. However, slugs of white blood cells that contain even single CMCs absorb laser light and produce high frequency acoustic waves. These slugs that generate photoacoustic waves are sequestered and collected for cytochemical staining for verification of CMCs.

We have developed a flow cytometer using laser induced ultrasound to detect circulating melanoma cells as an early indicator of metastatic disease.

Sirkülasyon Melanom Hücreler foto akustik flowmetre kullanarak Algılama ve İzolasyonu

Circulating tumor cells (CTCs) are those cells that have separated from a macroscopic tumor and spread through the blood and lymph systems to seed ...

Biyomühendislik

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

Hücresel Lipid damlacıklar İzolasyonu: Maya Hücreleri ve insan plasentası itibaren iki Arıtma Teknikleri

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

Cerrahi Dokular İlköğretim İnsan Kolon Tümör Hücreleri İzolasyon ve Çekiş Sitometrinin Yumuşak Elastik Yüzeyler Doğrudan onları Kültürleme

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

Yalıtım insan alveoler kapaklarini ve Osteojenik etkinlik kapaklarini türetilmiş hücre D vitamini etkileri Mezenkimal kök hücrelerin

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Hyaluronik asit Hydrogels hasta kaynaklı Glioblastoma hücreleri 3 boyutlu kültür için dayalı.

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...

Patient-Specific Polyvinyl Alcohol Phantom Fabrication with Ultrasound and X-Ray Contrast for Brain Tumor Surgery Planning

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create anatomically accurate head phantoms with realistic brain imaging properties because standard fabrication methods are not optimized to replicate any patient-specific anatomical detail and 3D printing materials are not optimized for imaging properties. In order to test and validate a novel navigation system for use during brain tumor surgery, an anatomically accurate phantom with realistic imaging and mechanical properties was required. Therefore, a phantom was developed using real patient data as input and 3D printing of molds to fabricate a patient-specific head phantom comprising the skull, brain and tumor with both ultrasound and X-ray contrast. The phantom also had mechanical properties that allowed the phantom tissue to be manipulated in a similar manner to how human brain tissue is handled during surgery. The phantom was successfully tested during a surgical simulation in a virtual operating room.
The phantom fabrication method uses commercially available materials and is easy to reproduce. The 3D printing files can be readily shared, and the technique can be adapted to encompass many different types of tumor.

This protocol describes the fabrication of a patient specific skull, brain and tumor phantom. It uses 3D printing to create molds, and polyvinyl alcohol (PVA-c) is used as the tissue mimicking material.

Beyin Tümörü Cerrahisi Planlaması için Ultrason ve X-Ray Kontrastı ile Hastaya Özel Polivinil Alkol Phantom İmalatı

Phantoms are essential tools for clinical training, surgical planning and the development of novel medical devices. However, it is challenging to create ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Fibroblast Türetilmiş İnsan Tarafından Tasarlanmış Bağ Dokusu Tarama Uygulamaları için

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, inflammation, and homeostasis. The endothelium also plays an important role in pathophysiologies such as atherosclerosis, hypertension, and diabetes. Endothelial cells form the inner lining of blood and lymphatic vessels and display heterogeneity in structure and function. Various groups have evaluated the functionality of endothelial cells derived from human peripheral blood with a focus on endothelial progenitor cells derived from hematopoietic stem cells or mature blood outgrowth endothelial cells (or endothelial colony-forming cells). These cells provide an autologous resource for therapeutics and disease modeling. Xenogeneic cells may provide an alternative source of therapeutics due to their availability and homogeneity achieved by using genetically similar animals raised in similar conditions. Hence, a robust protocol for the isolation and expansion of highly proliferative blood outgrowth endothelial cells from porcine peripheral blood has been presented. These cells can be used for numerous applications such as cardiovascular tissue engineering, cell therapy, disease modeling, drug screening, studying endothelial cell biology, and in vitro co-cultures to investigate inflammatory and coagulation responses in xenotransplantation.