Biz Dr teşekkür etmek istiyorum. James Bowie ve Salem Faham bicelle yöntemi ve faydalı tartışmalar için Dr. Aviv Paz teknik uzmanlık ve rehberlik sağlamak için. Biz deneysel destek için Le Du kabul etmiş sayılırsınız. Rachna Ujwal Ancak, bu işe destek vermedi, MemX Biosciences LLC mali çıkarı var. Bu çalışma NIH (RO1 GM078844) hibe kısmen desteklenmiştir.

I) bir bicelle şekillendirme lipid hazırlığı:: Bicelle tabanlı kristalizasyon dört temel adımdan oluşur (Şekil 2); ii) bicelle ortama saflaştırılmış protein eklenmesi, iii) kristalizasyon çalışmalarda (manuel veya robot), amphiphile karışım ve iv) görselleştirme, kristal çıkarma ve dondurma. Bu adımlar aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır. 1. Bicelles, hazırlanması Amphiphile kombinasyonları ve konsantrasyonlarının geniş bir yelpazede üzerinde Bicelles lipid çeşitli oluşabilir. Bu nedenle, bir başlangıç ​​kompozisyon tabanlı önceki başarılı (Tablo 1) önerilen koşullarda-. (Bkz. aşağıda Reaktifler Tablo) ve bir önceden karıştırılmış kullanıma hazır formülasyonu olarak ticari olarak satın alınan veya açıklandığı gibi laboratuarda hazırlanan CHAPSO bicelle formülasyonu, en başarılı karışımı DMPC. 2.8:1 molar oranında CHAPSO karışımı: Bu egzersiz için 1 ml% 35 DMPC hazırlayacaktır. <ol><li&gt; 0.26 g DMPC (Bay 677,9 g / mol), 0.09 g CHAPSO (Bay 630,9 g / mol) tartılır ve nihai hacmi 1.0 ml deiyonize su ekleyin. <ul type="disc"><li> Bicelle yüzdesi ile -40% 10 arasında değişebilir DMPC: 2.6-3.0:1 (Tablo 1) arasında değişen CHAPSO molar oranı. </li><li> Not: bicelle konsantrasyonu daha zor, daha yüksek bir çözüm viskozite elde lipid çözmek için ne kadar yüksek . Ancak, konsantre bir bicelle formülasyonu protein konsantrasyonu düşük olduğunda avantajlı olabilir. </li></ul></li><li> Lipid eriterek homojen bir çözüm elde etmek için bu adımı, bicelle yöntemi tüketen çoğu zaman, önemli çaba gerektirir. DMPC kadar aşağıdaki adımları arasında geçiş yapma tamamen karışık: <ol><li> Sıcak karışım ~ 40 ° C su banyosu ya da bir kuluçka makinesi ve yaklaşık 1 dakika için girdap. <ul type="disc"><li> Not: daha fazla devir yürütülmektedir olarak, jel benzeri bir con karışımı ısınma neden olacaktırsistency zor girdap. </li></ul></li><li> Birkaç dakika için buz ve vorteks karışımı soğutun. Soğutma girdabına kolaylaştırarak çözüm sıvılaştırılması yardımcı olur. <ul type="disc"><li> Not: daha fazla devir yapılır, karışım soğutma üzerine bulutlu olabilir. </li></ul></li><li> Lipid tamamen eriyene kadar (1.2.1 ve 1.2.2) yukarıda sıralanan adımları tekrarlayın. <ul type="disc"><li> Not: Bu işlem birkaç saat sürebilir. CHAPSO formülasyonu: Bicelle oluşumu DMPC faz davranış değişiklikleri ile gösterilir. Tamamlanmasından sonra, karışım net bir jel üstünde veya oda sıcaklığında viskoz sıvı ve buz üzerinde olacaktır. </li></ul></li></ol></li><li> Bicelle karışımı artık kullanıma hazır hale gelir ve uzun süreli saklama (5 yıla kadar) için -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. Fosfolipid baş grup hidroliz riski nedeniyle, uzun süre oda sıcaklığında bicelles saklamak için tavsiye edilmez. </li></ol> 2. Bicelles içine protein Incorporation Bicelles den elde edilen MP yapıları DMPC kristalize edilmiştir: CHAPSO bicelle konsantrasyonu% 2 ila% 8 arasında değişen 8 ila 12 mg / ml (Tablo 1) bir protein konsantrasyonu kullanarak. Mümkünse, ilk ekranlarında bu yönergelere kullanmanız gereken ve ek konsantrasyonları optimizasyon aşamasında taranabilen. LCP yöntemi ile karşılaştırıldığında, protein eklenmesi ile bicelles kristalizasyon çalışmalarda aynı gün yapılmalıdır (Şekil 3), basit bir işlemdir. <ol><li> CHAPSO bicelle net bir jel faz değişene kadar oda sıcaklığında karışımı: DMPC çözülme. <ul type="disc"><li> Not: Birden fazla donma-çözülür bicelle davranışını etkilemez. </li></ul></li><li> Liquify ve homojen bir bicelle faz yeniden kurmak için kısaca girdap buz karışımı yerleştirin. Buz üzerinde konulduğunda karışımı bulutlu olabilir. </li><li> From bu noktada, bicelle karışımı tutmak ve buz üzerinde saflaştırılmış protein. Bu pipetleme için mükellef bir sıvı faz bicelle devam edecektir. </li><li> 01:04 (V / V) oranında saflaştırılmış deterjan-çözünür protein bicelle karışımı ekleyin. <ul type="disc"><li> Örneğin: 100 ul bicelle protein karışımı, 20 ul bicelle ile 80 ul protein karıştırılması ile elde edilir. Protein konsantrasyonu 15 mg / ml &#39;dir ve bicelle konsantrasyonu% 35 ise, bu bir protein konsantrasyonu 12 mg / ml ve% 7 oranında bir bicelle konsantrasyon ile anonim bir bicelle-protein karışımının verecektir. </li></ul></li><li> Çözelti berrak ve homojen hale gelinceye kadar yavaşça içeriğini pipetleme ve aşağı çevirerek karıştırın. <ul type="disc"><li> Not: kabarcıklar belirirse, bir masaüstü santrifüj ile hızlı bir spin (30-60 saniye, 13000 rpm, 4 ° C) bunları kaldırmak yardımcı olabilir. </li></ul></li><li> Protein int tam birleşme teşvik etmek için en az 30 dakika buz karışımı inkübeo bicelles. Protein bicelle karışımı kristalizasyon denemeleri için hazırdır. </li></ol> 3. Kristalizasyon denemeler ayarlama LCP gibi diğer lipid kristalizasyon teknikleri, orta yüksek viskozite nedeniyle özel ekipman gerektiren, ancak bicelles eşsiz faz davranışları, robotik (Şekil 3) de dahil olmak üzere hemen hemen herhangi bir standart bir kristalizasyon formatı uygulamaya izin verir. Kristalizasyon çalışmalar ya piyasada bulunan standart ekranlarını kullanarak damla formatları asılı veya oturarak yapılabilir. <ol><li> Olsun, bir kristalizasyon robot elle tepsi veya buz üzerinde bicelle protein karışımı korumak. Bu protein bicelle karışımı soğuk tutmak ve çözüm viskozite en az olmasını sağlamak olacaktır. </li><li> Manuel Kristalizasyon Denemeler - standart bir pipet kullanarak, normalde protein bicelle karışımı gerçekleştirmek olarak aynı şekilde rezervuar çözümü ile karıştırılabilir.çözünür veya deterjan-çözünür zarı proteinleri ed. <ul type="disc"><li> Not: çalışmalar sırasında, protein bicelle karışımı buz tutun . </li></ul></li><li> Robotik Kristalizasyon Denemeler - Biz bu çalışmaların Sivrisinek kristalizasyon robot için hazırlanmış, ancak prensip olarak (aynı aşağıdaki önlemler) tekniği, tüm kristalizasyon robotlar ile uyumlu olmalıdır . Aşağıdaki ipuçları, protein bicelle karışımı serin kalır ve doğru bir robot tarafından pipetlenir sağlayacaktır: <ol><li> Ğutma bicelle protein karışımı buz üzerine yerleştirerek tutan plaka. </li><li> Plakasına protein bicelle karışımı Pipet ve plaka buz tutmaya devam ediyor. Bu plaka, kaçak başlamadan önce robot gitmek için son öğe olmalıdır. </li><li> Sivrisinek robot platformu 3 ve 5 sırasıyla rezervuar tepsisi ve kristalizasyon kapakları, set-up. </li><li> Platformu 4 protein bicelle karışımı içeren plaksivrisinek robot. Bu protein bicelle karışımı robot tarafından yakalandı son sağlar ve hemen serbest bırakılır. </li><li> Isıtma ve artan viskozite önlemek için, protein bicelle karışımı ile rezervuar karışmaz. </li><li> Birden fazla ekranı yaparken, hemen bir çalışma tamamlandıktan kısa sürede soğutmak için buz bicelle protein plaka dönüş. </li></ol></li><li> Bırak hacmi ve oranı (protein: rezervuar), geleneksel kristalizasyon denemeleri için olarak seçilebilir. Bicelle karışımı artı 0.25 ul rezervuar: Örneğin, Sivrisinek robot kullanarak ilk kristal çalışmalarda 0.25 ul proteini kullanarak kurmak olabilir. </li><li> 20 odasında kristal çalışmalarda inkübe ° C Sıcaklık bicelles faz davranışı sıcaklığa bağlıdır çünkü, iyi bir tarama ve optimizasyon parametresi. <ul type="disc"><li> Yüksek sıcaklıklar öncesi organize bir avantaja sahiptir lameller faz 12 (Şekil 1), nedenkatmanlar halinde protein. 20 altındaki sıcaklıklarda ° C gösterildi olabilir, fakat bu yana C, uzun süre üzerinde çökelti lipidler neden olabilir ° 4&#39;ün altında gitmemelidir. </li></ul></li><li> Bicelle çalışmalarda geleneksel kristalizasyon çalışmalarda aynı şekilde, kristal görünümü ve büyüme için düzenli olarak izlenmelidir. 1. ve 3. gün sonrası kurulum haftalık inceleme yoluyla takip tepsileri kontrol etmenizi öneririz. </li><li> Kristal optimizasyonu, ızgara tarama, katkı tarama Ayrıca, değişen sıcaklıklarda vb, bicelle yüzdesi ve protein içeren deterjan bazlı kristalleri için rutin olarak kullanılan yöntemler kullanılarak yapılabilir: bicelle oranı çeşitli olabilir. Ayrıca, protein istikrar ya da fonksiyon için gerekli olabilir belirli lipidler bicelles katkılı olabilir. </li></ol> 4. Görselleştirme, kristal çıkarma ve dondurma Bicelle protein karışımı ile kristal denemeleri bu yana<html> protein-deterjan damla, görselleştirme ve kristal çıkarımı için benzer bir viskozite rutin ve geleneksel set-up gibi yapılmaktadır. <ol><li> Görselleştirme: kristal algılama için sık sık normal ve polarize ışık altında yüksek kaliteli aydınlatma gerektirir LCP medya aksine, görselleştirme bicelles engel değildir. Renkli yanı sıra renksiz protein kristal damla standart mikroskoplar ve hiçbir özel ekipman gerektirmez kullanarak kolayca analiz edilebilir. </li><li> Bicelles, diğer lipidik medya gibi, yanlış pozitif bir yüksek orandaki üretme eğilimindedir. UV mikroskop, tuz kristalleri (Şekil 4) protein ayırmada büyük ölçüde yardımcı olur. </li><li> Ekstraksiyon ve Donma: Kristal çıkarma ve dondurma oldukça basittir ve çevresindeki bicelle medya dağılması gerektirmez. Ayrıca, bicelle aşamasında kendini bazı ılımlı cryo koruma sağlar. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: <html> nt&gt; genellikle görünür ve onları maksimum boyutuna büyümek için yaklaşık bir hafta veya daha fazla kristalleri için 2-3 gün sürer. bacteriorhodopsin ve fare voltaj bağımlı anyon kanalı 1 (mVDAC1) kristalleri 4,8 olduğu Diğer zarı proteinleri için kristal büyümesi için birkaç hafta alabilir, bu yüzden ilk haftalarda iyi ötesinde kristal denemeleri izlemeye devam etmek önemlidir. Bicelles diğer lipidik medya gibi, kristal olarak görünebilir şekiller oluşturma eğilimindedir. Aynı zamanda daha yüksek bir oranda tuz ve deterjan kristalleri yol açtığı gözlenmiştir. Triptofan floresans algılayan A, UV-mikroskop gibi non-protein &quot;false positive&quot; (hatalı tespit) önemli ölçüde ortadan kaldırmaya yardımcı olabilir. Şekil 4 farklı sonuçlar görülebilir ayırt edilmesine yardımcı olmak için, görünür ve UV ışık görüntülenebilir lipid şekiller, tuz ve protein kristaller gösterir. 83fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1 Bicelle şematik. Bicelles DMPC (mavi) ve bilayeri hidrofobik kenarları koruyan CHAPSO (yeşil), gibi bir amphiphile bilayeri oluşturan lipid molekülünün oluşmaktadır. Sıcaklık arttıkça, disk gibi bicelles delikli lameller sayfa 12 içine bir faz değişim geçirmiştir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig2.jpg" /> Şekil 2, dört temel adımları özetleyen bicelle kristalizasyon yöntemi için Akış Şeması . <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig3.jpg" /> Şekil 3. Kristal çalışmalarda set-up şematik. Saf deterjan-çözünür zarı proteinleri birlikte içeriğini pipetleme doğrudan buz üzerinde bicelles ile karışık olabilir. ~ 30 dakika, kristalizasyon denemeleri için buz üzerinde protein / bicelle karışımı inkübe sonrarobotik dahil olmak üzere herhangi bir standart format kullanılarak kurulabilir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3383/3383fig4.jpg" /> Şekil 4 kristal çalışmaların Görselleştirme. (A) tuz-tek şart gözlenen İğne şeklindeki kristal görünür görüntü (üst panel) ve UV (alt panel). Hiçbir floresan, kristaller yanlış pozitif bir göstergesi tespit edilebilir. (B) Çubuk şeklindeki kristal bir MPD durum oluşturdu. Kristal zayıf fluoresced ancak, X-ışını kırınımı kullanarak non-protein olduğu tespit edildi. (C) Kristal çalışmalarda kurma sonra yaklaşık dört hafta gözlenmektedir. UV ışığı altında güçlü floresan bir protein kristal onaylar. <table border="1"><tbody><tr><td> Hayır. </td><td> Protein </td><td> Kaynak </td><td> Bicelle Formülasyon </td><td> Concentrati Proteinüzerinde </td><td> Deterjan 1 </td><td> Çözünürlük (Å) </td><td> Referans </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Bacteriorhodopsin 2 </td><td> Halobacterium salinarum </td><td> % 8 DMPC: CHAPSO (2.8:1) </td><td> 8 mg / ml </td><td></td><td> 2,0 </td><td> Faham ve Bowie, 2002 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> % 8 DTPC: CHAPSO (3:1) </td><td> 8 mg / ml </td><td></td><td> 1,8 </td><td> Faham ve ark, 2005 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> β2-adrenerjik reseptör / Fab kompleksi </td><td> Homo sapiens </td><td> % 8.3 DMPC: CHAPSO (3:1) </td><td> 10 mg / ml </td><td> DDM </td><td> 3.4/3.7 </td><td> Rasmussen ve ark, 2007 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Voltaj-bağımlı anyon kanal 1 </td><td> Mus musculus </em&gt; </td><td> % 7 DMPC: CHAPSO (2.8:1) </td><td> 12 mg / ml </td><td> LDAO </td><td> 2,3 </td><td> Ujwal ve ark, 2008 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Xanthorhodopsin </td><td> Salinibacter ruber </td><td> % 4.2 DMPC,% 5 NM </td><td> 4 mg / ml </td><td> DDM </td><td> 1,9 </td><td> Luecke ve ark, 2009 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Rhomboid proteaz </td><td> Escherichia coli </td><td> % 2 DMPC: CHAPSO (2.6:1) </td><td> 9 mg / ml </td><td> Nonil glucoside </td><td> 1,7 </td><td> Vinothkumar, 2011 </td></tr></tbody></table> Membran protein saflaştırılması için kullanılan 1 Deterjan Mor membranlar 2 Native lipidler arıtma sırasında birlikte yapılabilir Tablo 1. Membran protein yapıları için kristalizasyon koşullarını Özeti bicelles kullanarak çözdü.

<ol>
	<li>Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phases:+A+novel+concept+for+the+crystallization+of+membrane+proteins.">Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 93, 14532-14535 (1996).</li><li>Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4+Monoacylglycerols:+The+Workhorse+Lipids+for+Crystallizing+Membrane+Proteins+in+Mesophases.">Chapter 4 Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases.</a> Current Topics in Membranes. 63, 83-108 (2009).</li><li>Nollert, P., Landau, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymic+release+of+crystals+from+lipidic+cubic+phases.">Enzymic release of crystals from lipidic cubic phases.</a> Biochem. Soc. Trans. 26, 709-713 (1998).</li><li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples.">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li><li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J. Mol. Biol. 316, 1-6 (2002).</li><li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+5+Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles.">Chapter 5 Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Current Topics in Membranes. 63, 109-125 (2009).</li><li>Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+bacteriorhodopsin+from+bicelle+formulations+at+room+temperature.">Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature.</a> Protein Science. 14, 836-840 (2005).</li><li>Luecke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallographic+structure+of+xanthorhodopsin,+the+light-driven+proton+pump+with+a+dual+chromophore.">Crystallographic structure of xanthorhodopsin, the light-driven proton pump with a dual chromophore.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 16561-16565 (2008).</li><li>Ujwal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+&#197;+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating.">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 &#197; resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 17742-17747 (2008).</li><li>Vinothkumar, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+rhomboid+protease+in+a+lipid+environment.">Structure of rhomboid protease in a lipid environment.</a> J. Mol. Biol. 407, 232-247 (2011).</li><li>Rasmussen, S. G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+human+[bgr]2+adrenergic+G-protein-coupled+receptor.">Crystal structure of the human [bgr]2 adrenergic G-protein-coupled receptor.</a> Nature. 450, 383-387 (2007).</li><li>Prosser, R. S., Hwang, J. S., Vold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetically+aligned+phospholipid+bilayers+with+positive+ordering:+a+new+model+membrane+system.">Magnetically aligned phospholipid bilayers with positive ordering: a new model membrane system.</a> Biophys. J. 74, 2405-2418 (1998).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bicelles eşsiz bir lipidik medya deterjanların çözünür gibi davranmaya gibi yerli çift katlı bir ortam sunuyoruz. Bu özellik, herhangi bir öğrenme eğrisi ya da bu tekniği için gerekli olan özel ekipman olmadığından bicelles diğer lipid tabanlı kristalizasyon yöntemleri üzerinde ayrı bir avantaj sağlar. Bicelles, ticari ya da laboratuarda hazırlanan mevcuttur, kristalizasyon çalışmalarda neredeyse tam standart deterjan bazlı protokolleri ile devam saflaştırılmış protein ve bu noktadan it...

high-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method

Membran proteinleri (MP) gibi özel moleküller, tüm hücre ve organeller çevreleyen başka geçirimsiz membran bilayeri üzerinden pompalama gibi birçok fizyolojik süreçler kritik bir rol oynar. Birçok insan hastalık ve bozukluklar milletvekilleri sonucu işlevini değişiklikler; böylece, yapıları karmaşık bir anlayış, biyolojik araştırmalar için kritik bir hedefi olmaya devam ediyor. Ancak, milletvekillerinin yapı tayini genellikle hidrofobik kaynaklanan önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Milletvekilleri bilayeri içinde gömülü önemli hidrofobik bölgelerde var. Deterjanlar sonra çözünür proteinler gibi benzer bir şekilde manipüle edilebilir bir protein-deterjan üreten Misel bilayeri sık sık bu proteinlerin çözünür kullanılır. Geleneksel olarak, kristalizasyon çalışmalarda bir protein-deterjan karışımı kullanarak devam edin, ama genellikle kristalleşme karşı veya kalitesiz kristaller üretmek. Bu sorunlar nedeniyle ortaya çıkandeterjan yetersizliği yeterince kötü istikrar ve heterojenite ile sonuçlanan bilayeri taklit etmek. Buna ek olarak, deterjan kalkanlar MP hidrofobik yüzey kristal kişiler için yüzey alanı azaltır. Aşmak için bu sakıncaları milletvekilleri, daha yakından, endojen ortamını uyaran lipidik medya, kristalize olması, ve son zamanlarda MP kristalizasyon için de novo tekniği haline gelmiştir. Lipidik kübik faz (LCP) sulu kanal 1 bir enterkonnekte sistem tarafından nüfuz üç boyutlu çift katlı lipid. Monoolein seçim lipid olmasına rağmen, ilgili lipidler gibi monopalmitolein ve monovaccenin olarak da LCP 2 yapmak için kullanılır olmuştur. Milletvekilleri, üç boyutlu ve yem kristal çekirdekleri diffüz LCP içine dahil edilmiştir. LCP en büyük avantajı, protein, daha doğal bir ortamda kalmasını, ancak yöntem yüksek visc de dahil olmak üzere bir dizi teknik dezavantajları vardırosity (uzman aparatları gerektiren) ve kristal görselleştirme ve manipülasyon 3,4 zorluklar. Çünkü bu teknik zorluklar, kristalizasyon-bicelles 5,6 (Şekil 1) için başka bir lipidik orta kullandı. Bicelles amphiphile (CHAPSO) ya da kısa zincirli yağ (DHPC) ile fosfatidilkolin lipid (DMPC) harmanlayarak oluşturduğu lipid / amphiphile karışımları. Amphiphile molekülleri hattı apolar kenarları bilayers ve deterjanlar hem de faydalı özellikleri sunarken, her bicelle disk içerisinde lipid molekülleri bilayeri oluşturmak. Önemlisi, kendi geçiş sıcaklığı altında, protein bicelle karışımları, düşük viskozite ve kristalizasyon robotlar ile bicelles uyumlu hale getirir, deterjan-çözünür milletvekilleri benzer bir şekilde manipüle edildi. Bicelles birkaç zarı proteinleri 5,7-11 (Tablo 1) kristalize başarıyla kullanılmaktadır. Bu kolleksiyonuproteinler, alfa sarmal ve beta yaprak milletvekilleri hem de prokaryotik ve ökaryotik kaynaklardan kristalize için bicelles çok yönlülüğünü gösteriyor. Çünkü bu başarıları ve yüksek verimli uygulama basitliği, bicelles her membran proteini kristalbilimciydi cephaneliğinin bir parçası olmalıdır. Bu video, bicelle yöntemini açıklar ve standart robotik kullanarak milletvekilleri saflaştırılmış, yüksek verimli kristalizasyon çalışmalarda kurmak için bir adım-adım protokolü sağlamak.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method at JoVE.com

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Bicelles, bir çift katlı lipid içinde membran proteinleri (MP) korumak değil, kristalizasyon, robotlar tarafından yüksek verimlilik tarama kolaylaştıran benzersiz faz davranışları lipid / amphiphile karışımları. Bu teknik hem prokaryotik ve ökaryotik kaynaklardan başarıyla yüksek çözünürlüklü yapıların bir dizi üretti. Bu video lipidik bicelle karışımı üretmek için orta crystallizations çalışmalar (manuel olarak robot gibi) ve hasat kristalleri kurma, bicelle karışımı içine milletvekilleri içeren, protokoller açıklamaktadır.

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

high-throughput-crystallization-membrane-proteins-using-lipidic

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K Görüntüleme.  University of California Los Angeles. Bicelles, bir çift katlı lipid içinde membran proteinleri (MP) korumak değil, kristalizasyon, robotlar tarafından yüksek verimlilik tarama kolaylaştıran benzersiz faz davranışları lipid / amphiphile karışımları. Bu teknik hem prokaryotik ve ökaryotik kaynaklardan başarıyla yüksek çözünürlüklü yapıların bir dizi üretti. Bu video lipidik bicelle karışımı üretmek için orta crystallizations çalışmalar (manuel olarak robot gibi) ve hasat kr...

Video: High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Biyoloji

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Elektron Kristalografi Yapısal Biyoloji Araştırmaları Küçük Membran Proteinleri İki boyutlu Kristalizasyon Denemeler değerlendirilmesi

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

Yüksek verim SHAPE kullanarak RNA İkincil Yapısı Tahmin

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFE Test kullanma Yüksek throughput miRNA Hedefleri tespiti

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...