Biz bu işi desteklemek için Kanada Vakfı Yenilik, British Columbia Bilgi Kalkınma Fonu ve Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR) Enstitüleri için teşekkür etmek istiyorum. MT Mikrobiyal Çeşitlilik ve Evrim (CMDE) TULA vakıf tarafından finanse edilen Merkezi bir burs ile desteklenmiştir.

Metilotropik maya Pichia pastoris rekombinant proteinlerin İfade Bu protokol başlamadan önce bir P. çerçeve klonlanmış ilgi geni olmalıdır doğru yerleştirilmesi için vektör ilgi gen kontrol etmek için pastoris ebeveyn vektör ve sıralı var. Adım: P. içine yapı ve dönüşüm doğrusallaştırma electrocompetent maya hücreleri pastoris Bu adım için, elinizin altında şu medya ve plakalar olması gerekir: <ul><li> YPDS plakalar </li><li> 600 mL YPD orta </li><li> steril su buz gibi </li><li> Sorbitol 1 m </li><li> Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtre Cihaz </li><li> Microcon YM-30 Santrifüj Filtre Ünitesi </li><li> 0.2 cm elektroporasyon küvet </li><li> 15 ml steril cam tüp </li><li> steril cam Pasteur Pipet </li><li> Zeocin içeren YPDS plakalar </li></ul> Bölüm 1: electrocompetent maya hücreleri Hazırlık <ol><li> Dört gün önce P. dışarı hedeflenen dönüşümün çizgi Zeocin olmadan YPDS plaka pastoris hücreleri ve bunları 30 ° C, 1-2 gün ya da tek bir koloni oluştururlar kadar büyümesine izin. </li><li> Amaçlanan dönüşüm İki gün önce sizin P. 5 ml büyüyecek 30 50 ml Falcon tüp YPD orta pastoris gerginlik ° C geceleme. Falcon tüp çalkalayıcı bunu düzeltmek için bir şişe yerleştirin. </li><li> Önceki gün 0.25 gecelik kültür 30 çalkalayıcı gecede tekrar büyümesine izin ° C OD 600 = 1,3-1,5 ml ve 2 litrelik bir şişeyi taze YPD orta dönüşüm inokülasyon 500 ml . Not: spektrofotometre ölçüm doğru bir sonuç elde edebilmeniz için önce örnek sulandırmak. </li><li> Dönüşümün gün buz steril su ve 1 M sorbitol elinizin altında vardır. 4 5 dakika için 1500 xg&#39;de hücreleri Santrifüj ° C 500 ml, buz gibi soğuk, steril su ile pelletini tekrar. </li><li> 4. adımı olarak hücreleri yeniden santrifüjleyin. 250 mL, buz gibi soğuk, steril su ile pelletini tekrar. </li><li> 4. adımda hücreleri tekrar santrifüjleyin. Sorbitol buz 1 M 20 ml pelletini tekrar. </li><li> 4. adımda hücreleri tekrar santrifüjleyin. ~ 1.5 mL nihai hacmi sorbitol buz 1 M 1 mL pelletini tekrar. 4 ° C daha sonra kullanmak kadar buz üzerinde veya Mağaza hücreleri. Not: gerektiğinden daha fazla electrocompetent hücreleri hazırlamak ve mikrosantrifüj tüplerde 80 ul hacimde saklayın -80 ° C Biz, bir aydan daha uzun süre saklanan hücreler kullanır. </li></ol> Bölüm 2: Lineerleştirme ve pPICZαA inşa konsantrasyonu Dönüşümü için kısıtlama sindirmek ilgi gen içeren vektör linearize. Biz enzim PmeI kullanırlar. Diğer kısıtlama siteleri mümkündür. Eklemek vektör linearize için kullanmak istediğiniz kısıtlama sitesi içermediğinden emin olmak için var. P. içine dönüşüm için pastoris 5-20 mikrogram 5-10 ul steril su Lineerleştirilmiş DNA gerekecektir. Ayrıca, linearize konsantre ve P. içine düz vektör (insert) transfer pastoris. Eklemek olmadan ana vektörü, arka plan hücre içi ifade etmek için bir kontrol ve size ifade sonuçlarını yorumlamak sağlar. <ol><li> Buz üzerinde tüm reaktifler çözülme, aşağıdaki reaktifler birleştirmek ve kısaca tüp altındaki tüm sıvı almak için santrifüj tüp dokunun ve tekrar döndürebilirsiniz: <ul><li> x ul steril su </li><li> 5.0 ul 10X NEBuffer 4 </li><li> 0.5 ul 100X BSA </li><li> 2 mg vektör DNA (~ 100 ng / ml) </li><li> 2.0 ul pme I enzim karışımı </li></ul> → 50 ul toplam reaksiyon hacmi Not: Yeterli Lineerleştirilmiş vektör DNA elde etmek için ayrı tüplerde yukarıdaki karışımı 3 veya 4 kez hazırlamak ve Amicon Ultra Santrifüj Cihaz ile sindirilir DNA konsantre çözümleri birleştirmek. </li><li> 37 ° C, 3 saat ve 20 dakika boyunca ısı 65 ° C&#39;de enzim karışımı etkisiz hale inkübe edin. </li><li> Bu arada, Milli-Q su 1 ml ile bir Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtre Cihaz ön durulama 6-8 dakika 4000 xg&#39;de tüp spin ve akış yoluyla atın. Not: membran kez ıslak kurumasına izin vermeyin. Cihazın ön durulandıktan sonra cihaz kullanmıyorsanız kullanılıncaya kadar, membran su bırakın. </li><li> Isı ile inaktive edilmiş çözüm için adım 2 transfer öncesi durulanır Amicon Santrifüj Filtre Ünitesi, 6-8 dakika 4000 xg&#39;de tüp spin ve üzerinden akış atın. Not: Birden fazla doğrusallaştırma karışımı hazırlanan varsa, bir Amicon Santrifüj Filtre Ünitesi tüm çözümleri birleştirmek. </li><li> Amicon filtre çözüm miktarı yaklaşık 100 kadar Santrifüj ~ 150 &amp; mu; l. Yukarıda boş bir tüpe 1,5 mL steril su başka bir ekleyin ve çözüm Amicon tüp transferi ve santrifüj adımı tekrarlayın. Ikinci kez 1.5 ml steril su ile yıkayın ve tekrar yoluyla akışı atın. ~ 150 ul son hacmi azaltın. Çamaşır adımları hücreleri darbeli arching önlemek için tampon kalan tuz çıkarın. Not: santrifüj basamağı için sallanan bir kova rotor kullanır; santrifüj sırasında bir yerde tutmak için 50 ml Falcon tüp kapaklı Amicon santrifüj filtre ünitesi yerleştirebilirsiniz. Amicon filtre cihazları uzun santrifüj sonra bile filtre çözüm 50 ul korur. </li><li> DNA hazırlığı daha fazla konsantrasyon için bir ön-durulanır Microcon YM-30 Santrifüj Filtre Ünitesi Amicon filtre cihazı kalan DNA çözüm transferi ve Amicon tüp tüm DNA kurtarmak için ek 50 ul steril su ile durulama. Bir mikrosantrifüj Microcon Santrifüj Filtre Ünitesi filtre hala biraz sıvı ile kaplıdır kadar 10.000 xg&#39;de santrifüjleyin. Sadece kısa bir süre için spin ve sadece küçük bir miktar sıvı filtre bırakılırsa her dakika kontrol edin. DNA çözümü kurtarmak için, 3 dakika boyunca 1000 xg ikinci bir santrifüj adım yeni bir mikrosantrifüj tüp ve spin filtre baş aşağı yerleştirin. Son hacmi, toplam 10-15 ul geçmemelidir, aksi takdirde DNA çok dönüşüm adım için sulandırılmış olabilir. Not: filtre cihaz çok uzun spin ve potansiyel örneklem kaybını önlemek için tamamen kurumasını izin yok. Membran kuru ise, membran 10-15 ul steril su ekleyip 30 saniye hafifçe ajitasyon ve yukarıda açıklandığı gibi DNA kurtarmak. </li></ol> Bölüm 3: P. Dönüşüm; elektroporasyon tarafından pastoris <ol><li> Şimdi eklemek içeren Lineerleştirilmiş ve konsantre pPICZαA DNA electrocompetent P. dönüşüm için hazır pastoris hücreleri (bkz. adım Ben, bölüm 2). Buz üzerinde 0.2 cm elektroporasyon küvet; yer; sorbitol 1 M 1 ml ile mikrosantrifüj tüp doldurmak ve buz üzerinde etiket steril 15 ml&#39;lik cam tüp içinde ve steril bir var: dönüşüm yaklaşık 15 dakika önce aşağıdaki reaktifler ve cihazlar hazırlamak Pasteur pipeti elinizin altında cam. </li><li> Buz gibi bir 0.2 cm elektroporasyon küvet adım Ben, parçası 2.7 hücrelerin 80 ul aktarın. Elektroporasyon küvet, yan-yan pipet hareket ettirerek adım Ben, parçası 3.6 ve karışımı konsantre lineerleştirilmiş pPICZαA DNA çözüm ekleyin. Not: DNA ekleyerek ilk durağı sadece pipet itin. Hücrelerin DNA karıştırıldıktan sonra ikinci durağı pipet itme ve küvet yavaşça çıkarın. </li><li> 5 dakika boyunca buz üzerinde hücreleri küvet inkübe edin. </li><li> Bir doku ile küvet dışını silin ve kullanılan özel elektroporasyon cihaz üreticisi tarafından önerilen maya (Saccharomyces cerevisiae) parametrelere göre hücreler darbe. Not: aşağıdaki koşullar ile Bio-Rad GenePulser kullanın: <ul><li> Şarj voltajı (V): 1500; </li><li> Kapasitans (μF): 25; </li><li> Direnci (Ω): 200. </li></ul> 0.2 cm elektroporasyon küvet, protokol ~ 7500 V / cm bir alan gücü ile, bir darbe uzunluğu ~ 10 ms üretir. </li><li> Hemen buz küvet için sorbitol 1 M 1 mL ekleyin. Steril cam Pasteur pipeti kullanarak 15 ml steril bir tüp küvet içerik aktarma. </li><li> 30 ° C&#39;de 1.5 saat sallayarak olmadan tüp inkübe edelim. </li><li> 100 mg / ml Zeocin içeren dört etiketli YPDS plakaları 5-7 steril cam boncuk ekleyin. 250 ul her bir plaka üzerinde 15 ml&#39;lik cam tüp elektroporasyon karışımı sürün. Yatay hücreler eşit yaymak için plaka çalkalayınız. Plaka 15 dakika boyunca kuru ve sonra agar plaka tersini boncuk kaldırmak. Not: GS115 Pichia gerginlik kullanırken transformants seçmek için 100 mg / ml Zeocin. Başka bir Pichia gerginlik kullanıyorsanız, seçim şartları değişebilir. </li><li> Koloniler oluşana kadar 2 ila 3 gün 30 ° C ters tabak inkübe. Işığa duyarlı Zeocin bozulması önlemek için siyah plastik tabak sarın. Plakalarda antibiyotik az miktarda, yanlış pozitif klonların neden olabilir. </li><li> Koloniler sonra, 12 koloniler almak ve 100 mg / Zeocin ml içeren taze YPDS plakaları klonlar bulaşması, onları arındırıp-temizleyen. </li></ol> Adım II: Protein ifade Pichia pastoris Bu adım için, elinizin altında şu medya, tabak ve reaktifler olması gerekir: <ul><li> BMGY orta </li><li> gliserol, sterilize </li><li> BMMY orta </li><li> metanol, sterilize </li><li> Epicentre Maya DNA saflaştırma kiti </li></ul> SizeAyrıca aşağıdaki şişeler gerekir: <ul><li> 250 ml şişesi, otoklava </li><li> 1 L şaşkın şişesi, otoklava </li><li> 200 ml beher, otoklava </li></ul> Bölüm 1: Pichia pastoris Protein ekspresyonu Aşağıdaki adımları da dönüştürülmüş kontrol vektör (eklemek) için yapılır. <ol><li> Adım Ben, parçası 3,9 saflaştırılmış Pichia koloniler tek bir koloni seçin ve steril 250 ml cam şişe içinde 25 ml BMGY aşılamak. 30 ° C kadar bir kültür sallayarak inkübatör (250-300 rpm) bir OD 600 ulaşır = 2-6 (yaklaşık 16-18 saat). Büyümek Not: spektrofotometre ölçüm doğru bir sonuç elde edebilmeniz için önce örnek sulandırmak. Hücreler log-faz büyüme olacaktır. </li><li> Hücreleri bir gliserol stok hazırlamak uygun OD 600 ulaşmıştır. 2 mL Corning cyrogenic flakon, 25 ml hücre kültürü 800 ul aktarın ve 200 ul steril gliserol ekleyin. -80 Gliserol stok ve mağaza Freeze ° C </li><li> Maya DNA saflaştırılması için, bir mikrosantrifüj tüpe 1,5 ml 25 ml hücre kültürü aktarmak. Oda sıcaklığında 1 dakika için 1300 xg&#39;de santrifüj hücreleri Hasat. Bu hücreler, Pichia genomu (bkz. adım II, part2) entegre ilgi gen varsa çift kontrol Pichia integrants analiz etmek için kullanılır . 4 hücre pelletini Mağaza ° C daha fazla analiz kadar. </li><li> Geri kalanı için 25 ml kültür 50 ml Falcon tüp transferi ve oda sıcaklığında 5 dakika 3000 xg&#39;de santrifüj hücreleri tarafından hasat. Durusu süpernatant ve herhangi bir kalıntı ortamı çıkarmak için, baş aşağı bir doku tüpler yerde. Hücre yıkamak için pelet, kalan BMGY ortamı kaldırmak için daha sonra ifade BMGY orta gliserol olarak inhibe edebilir 20 ml BMMY tekrar süspansiyon haline getirin. Yine oda sıcaklığında 5 dakika 3000 xg&#39;de santrifüjleyin ve süpernatantı süzün. </li><li> BMMY orta 1.0 OD 600 yeniden süspanse hücre pelletini ifadesi neden (yaklaşık 100-200 ml) ve 1 litre şaşkın balonuna kültür aktarmak için. 200 ml beher balon kapak ve 30 büyümeye devam inkübatör dönmek ° C. Not: aşağıdaki sıcaklık 30 aşmayacak şekilde önemlidir ° C Inkübatör dalgalanma sıcaklık, 28 sıcaklık ° C Yeterli havalandırma metanol indüksiyon sırasında etkin bir şekilde ifade etmek için de önemli bir parametredir (ifade inducing zaman, hiç bir kültür hacmi&gt; toplam balon hacminin% 10-30 fazla). Kültür ortamı daha fazla oksijen tanıtmak Biz oldukça şaşkın şişeler kullanmanızı öneririz. </li><li> Indüksiyon korumak için her 24 saatte bir final konsantrasyon% 0.5 metanol steril saf metanol ekleyin. </li><li> 1.5 mL mikrosantrifüj tüp kültürünün ifadesi transferi 1 ml başladıktan sonra belirli zaman noktalarında. 2.5 dakika oda sıcaklığında 1300 xg&#39;de santrifüjleyin. Süpernatantı ayrı bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha fazla analiz zamanına kadar -80 supernatant ve hücre pelletleri ° C saklayın. Indüksiyon sonrası protein ekspresyonu için optimal süre kurmak için farklı zaman noktalarında örnekler ele alınacaktır. Not: 6h örnekleri alınması için zaman noktaları olarak, 12 saat, 24 saat, 36H ve 48 saat seçin. 4 gün daha fazla büyüme mümkündür. En uygun zaman noktalarında farklı ifade proteinler arasında değişmektedir. </li><li> Coomassie lekeli SDS-PAGE ve western blot (Bu protokol açıklanmayan), protein ekspresyonu süpernatantlar ve hücre pelletleri analiz edin. </li></ol> Bölüm 2: Maya Pichia bütünleyici DNA saflaştırma ve PCR analizi BMGY Pichia kültür maya DNA arıtma adım için gerekli tüm reaktifler Epicentre MasterPure Maya DNA Saflaştırma Kit dahildir. Not: Bu analiz ek ve ilgi gen Pichia genom entegre olup olmadığını belirlemek için yapılır. BMGY kültür (bkz. adım II, Kısım 1.3) alınan 1.5 mL örnek hücre pelletini kullanılır. Epicentre MasterPure Maya DNA Saflaştırma kılavuzu, talimatları uygulayın ve eklemek için spesifik primerler ile maya DNA&#39;sı ile PCR çalışması. 1 ul etidyum bromür içeren bir agaroz jel üzerinde PCR ürünü 3 ul analiz edin. 1 Kb + boyutuna işaretleyici eklemek boyutu yorumlamak ve bir jel dokümantasyon istasyonu kullanarak DNA görselleştirmek için iyi bir ekleyin. Rekombinant protein western blot analizi ile analiz edilebilir. Protein saflaştırma metal ücret reçine (Bu protokol açıklanan) His-tag arıtma yapılabilir. Ek, yemek tarifleri listesi Ben Adım: <ol><li> YPD orta: 600 mL hazırlamak içinYPD orta (Maya Özü Peptonlu Dekstroz Orta) 540 ml su 5 gr maya özü ve 12 g pepton çözülür. Sıvı döngüsü 20 dakika Otoklav. Bu arada 70 mL% 20 dekstroz ve filtre kullanmadan önce sterilize hazırlar. Otoklavlanmış çözüm serin ~ 60 ° C ve 60 mL% 20 dekstroz filtre ile sterilize edilmiş eklemek edelim. </li><li> YPDS (+ Zeocin) plakaları: YPDS 500 ml + Zeocin agar (Maya Özü ile Sorbitol Peptonlu Dekstroz Medium) 5 g maya özü, 450 ml su içinde 91,1 g sorbitol ve 10 g pepton çözülür hazırlamak. 10 g agar ve sıvı döngüsü 20 dakika boyunca bir manyetik karıştırıcı ve otoklav ekleyin. Bu arada 60 mL% 20 dekstroz ve filtre kullanmadan önce sterilize hazırlar. Otoklavlanmış çözüm serin ~ 60 ° C, 50 ml filtre ile sterilize edilmiş% 20 dekstroz eklemek edelim. Zeocin olmadan YPDS plakaları için antibiyotik eklemeden önce birkaç tabak dökün. Sonra nihai konsantrasyonu 100 mg / ml Zeocin agar elde etmek için 100 mg / ml stok solüsyonu 500 ul Zeocin ekleyin. Antibiyotik eklerken bir manyetik plaka üzerinde karıştırın ve eşit karışımı bir ek yaklaşık 2 dakika karıştırın izin alalım. Medya Petri kaplarına dökün ve siyah plastik ile kaplayın. Gece bankta tabak kuru olsun. 4 Zeocin içeren Mağaza YPD plakaları ° C Raf ömrü 1-2 haftadır. Not: Zeocin ışığa duyarlı olması nedeniyle plastik ile kapsama alanı gereklidir. </li></ol> II Adım: <ol><li> BMGY (Tamponlu gliserol-kompleks Orta) ve BMMY (Metanol-kompleks Orta Tamponlanmış): Maya özü ve 560 ml su içinde 16 g pepton her orta 8 g çözülür. Sıvı döngüsü 20 dakika Otoklav. Bu arada aşağıdaki çözümleri hazırlar: <ul><li> 1 M potasyum fosfat tamponu, pH 6.0: </li></ul> 24 ml 1M K 2 HPO 4 ve 156 mL 1M K 2 HPO 4 birleştirin ve onaylamak pH = 6.0 (pH ayarlanması gerekiyorsa, fosforik asit veya KOH). Sterilize Filtre ve oda sıcaklığında muhafaza. Bu çözümün raf ömrü bir yıl daha fazla. <ul><li> 10X YNB (amino asitler olmadan Amonyum Sülfat% 13.4 Maya Azot Base): </li></ul> Amonyum sülfat ve 200 ml su ve sterilize amino asitler olmadan maya azot tabanı 26.8 g (YNB) eritin. YNB su tamamen çözmek için çözüm ısıtın. 4 ° C saklayınız Bu çözümün raf ömrü yaklaşık bir yıl. Not: alternatif olarak, amonyum sülfat olmadan ve amino asitler olmadan YNB 3.4 gr ve 10 gr amonyum sülfat ekleyin. <ul><li> 500X B (0.02% Biotin): </li></ul> 50 ml su ve sterilize 10 mg biotin çözülür. 4 ° C saklayınız Bu çözümün raf ömrü yaklaşık bir yıl. <ul><li> 10X M (5% Metanol): </li></ul> 95 ml su ile 5 ml metanol karıştırın. Sterilize Filtre ve 4 saklamak ° C Bu çözümün raf ömrü yaklaşık iki aydır. <ul><li> 10X GY (% 10 Gliserol): </li></ul> Gliserol 10 ml 90 ml su ile karıştırın. Sterilize Filtresi. Oda sıcaklığında saklayın. Bu çözümün raf ömrü bir yıl daha fazla. Oda sıcaklığına kadar soğumasını otoklavlanmış çözüm, sonra aşağıdaki ekleyin ve iyice karıştırın bakalım: <ul><li> 80 ml 1 M potasyum fosfat tamponu, pH 6.0; </li><li> 80 ml 10X YNB </li><li> 0.16 ml 500X B </li><li> 80 ml 10X GY </li></ul> BMMY hazırlanması için, 80 ml 10X M yerine gliserol ekleyin. Mağaza medya ° C 4 Bu çözümün raf ömrü yaklaşık iki aydır. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1862/1862fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: Bu western blot görüntü, 24 saat sonra ifade dört ifade proteinleri (1605, 0537, 1228 ve 1682 olarak etiketli) gösterir . Immunoblotting için kullanılan antikor c-myc-HRP antikor oldu. Ikinci şerit (N) etiketli bir negatif kontrol ve ebeveyn (düz) vektörü ile dönüştürülmüş olması nedeniyle, rekombinant protein ifade hücreleri süpernatant yüklü.

<ol>
	<li>Cereghino, G. P., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+yeast+in+biotechnology:+protein+production+and+genetic+analysis.">Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).</li><li>Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pichia+pastoris+as+a+Host+System+for+Transformations.">Pichia pastoris as a Host System for Transformations.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).</li><li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+in+Pichia+pastoris.">Recombinant protein expression in Pichia pastoris.</a> Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).</li><li>Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+in+fermenter+cultures+of+the+yeast+Pichia+pastoris.">Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.</a> Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).</li></ol>

Protein ifade Metilotropik maya Pichia pastoris bir ana sistem olarak kullanarak, bu protokolde açıklanmıştır . Protein kullanılan klonlama vektörü bağlı olarak ortama salınır. Rekombinant proteinin salgılanmasını sonraki arıtma kolaylaştırır. Ancak, gösterilen koşullar artan protein düzeyleri neden olabilir farklı proteinler ve koşulları ve ifade kez değişiklikleri ifade için optimize gerekebilir. Bu protokolde kullanılan vektör, c-myc epitop ve bu epitop satın alınabil...

expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast pichia pastoris

Mikrobiyal ökaryotik konak Pichia pastoris protein ekspresyonu, hızlı ve kullanımı kolay bir ifade sisteminde yüksek miktarda rekombinant protein üretme imkanı sunmaktadır . Tek hücreli bir mikroorganizma P. gibi pastoris işlemek için kolay ve ucuz medya yüksek hücre yoğunluğu hızla büyüyor. Ökaryot, P. olmak pastoris yüksek ökaryotik hücrelerde ve elde edilen rekombinant proteinler tarafından gerçekleştirilen post-translasyonel modifikasyonlar birçok protein katlanması, proteolitik işleme, disülfit bağı oluşumu ve glikozilasyon [1] tabi gerçekleştirmek için yapabiliyor. Metilotropik maya P. olarak pastoris tek karbon kaynağı olarak metanol metabolize yeteneğine sahiptir. Alkol oksidaz, AOX1, güçlü organizatörü, sıkı bir şekilde düzenlenir ve metanol ile indüklenen ve ilgi gen ifadesi için kullanılır . Buna göre, yabancı protein ifade besi metanol ekleyerek indüklenen olabilir [2, 3]. Diğer önemli bir avantajı, bir sinyal dizisi kullanarak P. pastoris sekretuar yolu yabancı bir proteini hedef, büyüme ortamına rekombinant protein salgılanmasını. Heterolog protein, medya maya kendisi tarafından salgılanan endojen protein ve medya için hiçbir katma proteinler sadece düşük seviyeleri ile total protein, orta ve büyük çoğunluğu oluşturur ve protein saflaştırılması adımları izleyerek kolaylaştırmaktadır [3, 4]. Rekombinant protein, E. her iki seçim için bir Zeocin direnç geninin salgılanması için α-faktörü salgılanması sinyali Burada kullanılan vektör (pPICZαA) faiz gen sıkı bir şekilde düzenlenir, metanol indüklenen ifade AOX1 organizatörü içeren coli ve Pichia ve c-myc epitopu ve rekombinant protein algılama ve saflaştırılması için polyhistidine (6xHis) etiketi içeren bir C-terminal peptid. Ayrıca, ana vektörü, c-myc epitop tanıma Anti-myc-HRP antikor kullanarak rekombinant protein batı blot analizi göstermektedir .

Watch this Scientific Journal Video about Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris at JoVE.com

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protokol Metilotropik maya kullanarak protein ekspresyonu açıklar.<em&gt; Pichia pastoris</em&gt;. Electrocompetent maya hücrelerinin hazırlanması, ilgi gen içine vektör dönüşümü<em&gt; S. pastoris</em&gt; Ve maya DNA arıtma de yapılmaktadır. Western blot analizi ve protein saflaştırma bu protein ifade protokolünde son adımları oluşturmak.

Rekombinant Proteinlerin Metilotropik maya İfade Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

expression-recombinant-proteins-methylotrophic-yeast-pichia

Research

JoVE Journal

Biology

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

45.7K Görüntüleme.  University of British Columbia - UBC. Protokol Metilotropik maya kullanarak protein ekspresyonu açıklar. Pichia pastoris. Electrocompetent maya hücrelerinin hazırlanması, ilgi gen içine vektör dönüşümü S. pastoris Ve maya DNA arıtma de yapılmaktadır. Western blot analizi ve protein saflaştırma bu protein ifade protokolünde son adımları oluşturmak.

Video: Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biyoloji

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

Üretilen Rekombinant Disülfid zengin Venom Proteinler Uygulanan Yüksek Randımanlı Sayısal Anlatım Tarama ve Arıtma<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Farelerde Hidrodinamik Gen Taşıyıcı Proteinlerin Geçici İfadesi

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and function. The rapid establishment and high recovery from transiently-transfected mammalian cell lines addresses this barrier and is an effective means of expressing proteins that are naturally channeled through the ER and Golgi-mediated secretory pathway. Here is one protocol for protein expression using the human HEK293F and HEK293S cell lines transfected with a mammalian expression vector designed for high protein yields. The applicability of this system is demonstrated using three representative glycoproteins that expressed with yields between 95-120 mg of purified protein recovered per liter of culture. These proteins are the human Fc&#947;RIIIa and the rat &#945;2-6 sialyltransferase, ST6GalI, both expressed with an N-terminal GFP fusion, as well as the unmodified human immunoglobulin G1 Fc. This robust system utilizes a serum-free medium that is adaptable for expression of isotopically enriched proteins and carbohydrates for structural studies using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. Furthermore, the composition of the N-glycan can be tuned by adding a small molecule to prevent certain glycan modifications in a manner that does not reduce yield.

Laboratory-scale production of eukaryotic proteins with appropriate post-translational modification represents a significant barrier. Here is a robust protocol with rapid establishment and turnaround for protein expression using a mammalian expression system. This system supports selective amino acid, selective labeling of proteins and small molecule modulators of glycan composition.

Süspansiyon HEK293 hücrelerinin kısa süreli transfection ile Rekombinant İnsan Proteinlerinin Yüksek Verimli İfadesi

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...