1. Namalwa hücrelerinin hazırlanması ve sayma <ol><li> Kültür şişelerinde hücreleri çıkarın ve pelet hücreler santrifüj. PBS bilinen bir ses supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. Bu protokolde kullanılan hücreler, süspansiyon hücrelere. Yapışık hücrelere kullanıyor iseniz toplama önce trypsinize gerekecektir. </li><li> Canlı hücrelerinin sayısını belirlemek için, bir sayım slayt üzerine% 0.4 tripan mavi karışımı çözüm ve pipetlemeyin 10 ul ile 01:01 karıştırma hücre süspansiyonu bir kısım leke ve sonra TC10 otomatik hücre içine slayt eklemek sayacı (Bio-Rad Laboratories, Inc.) </li><li> TC10 hücre sayacı otofokus sayma ile devam edin, sonra en doğru saymak sağlamak ve için. Otomatik numune canlı hücreleri ve toplam hücre yoğunluğu belirler. </li><li> Viewscreen hücreleri görüntülemek için görüntüyü seçin. Sonra TC10 hücre sayacı seyreltme hesap makinesi seçeneğini seçin, otomatik olarak gerekli olacak hücre karışımı miktarını hesaplamak. </li><li> Bu deney, bir toplam üç siRNA&#39;lar kullanarak bir kontrol siRNA ve STAT6 gen, artı untransfected kontrolleri hedefleyen iki farklı siRNA&#39;lar. Bu ml&#39;de 5 x 10 6 hücre bir final konsantrasyonda 3.6 ml gerektirir. </li><li> Seyreltme hesap makinesi içine istenen konsantrasyon ve son hacim değerleri girin ve bu örnek için canlı hücre sayımı dayalı hücre süspansiyonu gerekli hacim hesaplar. Alternatif olarak, elle hesaplama yapmak. Sonra yeni bir tüp içine bu deneyler için gerekli hacim hücre karışımı aktarın. </li><li> Pelet hücreleri hücre karışımları Spin ve tüm PBS kaldırmak. Gene Verici elektroporasyon tampon (Bio-Rad Laboratories) 3.6 ml süspanse edin. 800 ul alikotları uygun siRNA&#39;lar içeren tüp içine aktarın ve hafifçe karıştırın. Hücreler artık elektroporasyon için hazırız. </li></ol> 2. 96-iyi Tabaklar hücreleri Electroporating <ol><li> 96-iyi elektroporasyon plaka birlikte electroporated dört tedaviler için çoğaltır sağlar. </li><li> 96-iyi elektroporasyon plaka uygun kuyu içine hücre süspansiyonu 150 ul aktarın. </li><li> MXcell elektroporasyon plaka odasında plaka yerleştirin ve kapağını kapatın. </li><li> Kullanılan hücre hattı ve tampon için optimize edilmiş ayarlar kullanarak Electroporate. Bu hücreler, bir üstel bozulma dalga, 250 V cihaz ayarları ile 350 μF, ve 1000 Ω direnç kullanarak electroporated. </li><li> Elektroporasyon tamamlandıktan sonra, her bir kuyu içinde karıştırın ve daha sonra önceden ısıtılmış medya içeren bir doku kültürü plaka hücreleri aktarmak için hafifçe aşağı yukarı pipet ve. Namalwa hücreleri RPMI (Life Technologies)% 7.5 ve% 1 FCS piruvat ile desteklenmiş yetiştirilmektedir. </li><li> Electroporated henüz kontrol numuneleri alınmış ve kalan hücre süspansiyonu electroporated hücrelere aynı kültürü, önceden ısıtılmış kültür orta yemekleri eklenir. </li><li> 37 geceleme inkübe hücreleri ° C ile% 5 CO 2. </li><li> 24 saat sonra hücrelerin bir set 10 ng / ml son konsantrasyon rekombinant IL-4 (R &amp; D Systems) ile sağlandı. Kontrol hücrelerinin ikinci sette sadece ek ortam alırsınız. Tüm hücreler 37 ° C ve% 5 CO 2 ek bir 24 saat inkübe edilir. </li></ol> 3. RNA ayıklayın ve kontrol <ol><li> Büyüme olmak üzere toplam 48 saat sonra, her bir kuyunun hücrelerin sayısı, ve her biri de bir kısım transfer RNA ekstraksiyonu için bir mikrofuge&#39;de tüp ve batı blot veya diğer protein analizi için ikinci bir kısım dondurmak. </li><li> Pelet hücreleri örnekleri santrifüj, ve sonra her bir tüpten süpernatantı çıkarın ve atın. </li><li> RNA ekstraksiyonu ile devam edin. Biz genellikle dahil protokole göre Aurum toplam RNA kiti (Bio-Rad) kullanabilirsiniz. </li><li> SiRNA aracılı gen demonte izlerken bozulmuş RNA yanıltıcı sonuçlar verecektir, çünkü bu RNA kalitesini doğrulamak için özellikle önemlidir. 260/280 oranı RNA bütünlüğü anlamına gelmez, bu nedenle RNA bozulmuş değil onaylamak için bir jel ya da mikroakışkan cihaz örnekleri çalıştırmak için önemlidir. </li><li> Tek adımda hem kalite ve miktar değerlendirmek için, bu örneklerin Experion otomatik elektroforez sistemi (Bio-Rad) kullanılarak analiz edilecektir. </li><li> İlk olarak, ısı örnekleri. Sonra, başbakan, yük ve vorteks Experion RNA çip. Experion elektroforez istasyonu içine çip takın ve çalıştırın. </li><li> Çalıştırmak tamamlandıktan sonra, Experion yazılım (geleneksel bir RNA benzer bir Elektroferogram, sonuçlar tablo şeklinde (RNA konsantrasyon, ribozomal oranı ve RNA kalite göstergesi numarasını görüntüler) ve sanal jel sonuçları otomatik olarak gösterecektir jel). Yüksek kalitede toplam RNA örnekleri genellikle 8-10 RQI olacaktır. </li&gt; </ol> 4. Real-time PCR <ol><li> RNA kalitesi doğruladıktan sonra, cDNA reaksiyonlar ile devam edin. Bu deney bir tepki olarak cDNA sentezi ve real-time PCR iScript bir adım RT-PCR karışımı (Bio-Rad) birleştirmek için kullanılır. </li><li> Her astar kümesi için RNA şablonlar dışında tüm reaksiyon bileşenlerini içeren bir master miks olun ve PCR plakasına bu dağıtmak. </li><li> RNA yeknesak bir konsantrasyona seyreltilmesi sonra, uygun kuyulara RNA örnekleri ekleyin. Her reaksiyon üç nüsha olarak kurulur. </li><li> Plaka Seal, ve CFX384 gerçek zamanlı PCR sistemi (Bio-Rad) içine yerleştirin. Uygun protokolü seçin ve çalışma başlar. </li><li> Çalıştırmak tamamlandıktan sonra, gen ekspresyonu kontrol siRNA electroporated hücreler aynı normalleşme deneysel siRNA electroporated hücreleri bir referans gen normalize ilgi gen gen ekspresyonu karşılaştırılarak belirlenir. </li></ol> 5. SiRNA demonte Analizi <ol><li> CCL17 ifadesi CCL17 IL-4 bağımlı indüksiyon transkripsiyonel aktivatör STAT6 rolünü araştırmak için kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanarak takip edildi. Bu deneme için, GAPDH bir referans gen olarak kullanılmıştır. Alternatif referans gen ya da birden fazla referans genler aynı şekilde kullanılabilir. </li><li> CFX Manager yazılımı otomatik olarak aynı örnek referans gen ekspresyonu CCL17 ifade normalize ve basitçe, &quot;referans&quot; ve kontrol tedavisi (IL-4 indüksiyon olmadan kontrolü siRNA) olarak GAPDH seçerek tedavileri kontrol etmek için otomatik olarak normalize değerleri karşılaştırıldığında CFX yöneticisi yazılımı deney ayarları penceresi &quot;kontrol&quot;. </li><li> Olmadan, IL-4 indüksiyon, CCL17 transkripsiyonunu kontrol tedavisi ile karşılaştırılabilir, bünye düşük seviyelerde kaldı. </li><li> IL-4 ile indüklenen ve normal bir STAT6 yolağı (yani, kontrol siRNA veya untransfected kontrol tedavileri) istinat Hücreler CCL17 ifade 8-10 kat indüksiyon gösterdi. </li><li> IL-4 ile ancak STAT6 ifade ya STAT6 siRNA tanıtımı tarafından inhibe uyarılan hücreler CCL17 IL-4 kaynaklı ifade STAT6 rolünü teyit uninduced hücreleri sadece yaklaşık 2 kat daha yüksek CCL17 ifade gösterdi. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. IL-4 sinyal yolağı Genel Bakış. IL-4 - kendi reseptörüne A) Cilt STAT6 dimerization ve aktivasyonuna yol açar. STAT6 translocates çekirdeği etkinleştirilir ve bu tür CC17 olarak hedef genlerin transkripsiyonunu aktive eder. B) IL-4 indüksiyon olmadan, CCL17 transkripsiyonunu, bünye düşük seviyelerde kalmaya devam edecektir. C) siRNA-aracılı STAT6 gen susturulması sonra, IL4 tedavisi çok az veya hiç artış CCL17 ifade yol açacaktır. <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. IL4 tarafından indüksiyonu CCL17 kantitatif gerçek zamanlı PCR ile farklı koşullar ile ölçülür. A) IL-4 olmadan yetişen Örnekleri gen ekspresyonu ne olursa olsun, düşük bir ifade kurucu seviyesi vardı. B) yeşil ve mavi de görüldüğü gibi, kontrol örnekleri IL-4 ile tedavi normal yanıt verdi; CCL17 8-10 kat indüksiyon ile. Ancak, hücreler, STAT6, kırmızı ve pembe gösterilen hedef siRNA&#39;lar ile transfekte fikri destekleyen, IL-4 yanıt CCL17 ifade azalmıştır STAT6 CCL17 IL-4 kaynaklı ifade bir rol oynar.

Yazar, bu makalede kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Bio-Rad Laboratories tarafından istihdam edilmektedir.

Bu makale, süspansiyon hücre hattı transfect ve gen ekspresyonu bu hücrelerin nasıl takip etmek zor bir içine nasıl siRNA&#39;lar electroporate göstermiştir. Bu işlemi yaparken tüm örnekleri arasında mümkün olduğunca tutarlı bir şeyleri saklamak için hatırlamak önemlidir.

using an automated cell counter to simplify gene expression studies: sirna knockdown of il-4 dependent gene expression in namalwa cells

SiRNA aracılı gen demonte gen ekspresyonu çalışmalarında önemli bir araç olmaya devam etmektedir. sadece tek genlerin downregulating etkilerini incelemek için siRNA çalışmalar yürütülmektedir değil, aynı zamanda sinyal yollar ve diğer karmaşık bir etkileşim ağları sorgulamak için. Bu yolağı analizleri, ilgili cep telefonu modelleri kullanımı ve hücresel fizyoloji az pertürbasyon neden yöntemleri de gerektirir. Elektroporasyon giderek soruşturma altında sinyal yolağı değiştirmeden hücre hatları ve birincil hücreler transfect zor siRNA ve diğer nükleik asitlerin tanıtmak için etkili bir yol olarak kullanılmaktadır. Başarılı bir siRNA deneyi için birden fazla kritik adımlar vardır, ve çeşitli deneysel aşamada veri kalitesini arttırırken, çalışmalarını kolaylaştırmak için yollar vardır. SiRNA aracılı gen demonte proje ile başlamanıza yardımcı olmak için, biz yazılan transfeksiyon real-time PCR gen ekspresyon analizi yoluyla elektroporasyon önce hücrelerin toplanması ve sayma komple bir yol çalışması gerçekleştirmek için nasıl göstereceğiz. Aşağıdaki çalışmada, IL-4 Burkitt lenfoma hücre hattı (Namalwa) CCL17 bağımlı gen ekspresyonu transkripsiyonel aktivatör STAT6 rolünü araştırıyor. SiRNA tabanlı deneyler yapışmış ve süspansiyon hücreleri hem de geniş bir yelpazede ortaya teknikler yararlıdır. Ayrıca MXcell elektroporasyon sistemi aynı anda kullanarak birden fazla numune nasıl electroporate TC10 otomatik hücre sayıcı sayma hücre, RNA Experion otomatik elektroforez sistemi ile kalite ve miktar nasıl aynı anda değerlendirmek için nasıl düzene gösterecektir.

Watch this Scientific Journal Video about Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells at JoVE.com

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Bu prosedür, hücre hatları transfect ve gerçek zamanlı PCR ile gen ekspresyonu takip etmek zor içine siRNA tanıtmak için hızlı ve kolay bir iş akışını açıklar. Otomatik bir hücre sayıcı kullanımı, çok iyi elektroporasyon plaka ve otomatik elektroforez istasyonu pahalı robot işleme gerek kalmadan hızlı ve güvenilir sonuçlar sağlar.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

using-an-automated-cell-counter-to-simplify-gene-expression-studies

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K Görüntüleme.  Bio-Rad Laboratories.  中文 

Video: Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray&#39;ler Kullanımı

Biyoloji

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

Omurilik Elektrofizyoloji

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Bitkisel Dokular Gen İfade Araştırmalar Robotik ve Dinamik Görüntü Analizi

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various pathways1,2. However, conditional knockdown of gene expression is required in cases when constitutive knockdown is not tolerated by cells for a long period of time3-5. Here we describe a protocol for preparation of cell lines allowing conditional knockdown of subunits of the ACF chromatin remodeling factor. These cell lines facilitate the determination of the contribution of ACF to induction of cell death by the adenovirus E4orf4 protein6. Sequences encoding short hairpin RNAs for the Acf1 and SNF2h subunits of the ACF chromatin remodeling factor were cloned next to a doxycycline-inducible promoter in a plasmid also containing a gene for the neomycin resistance gene. Neomycin-resistant cell clones were selected in the presence of G418 and isolated. The resulting cell lines were induced by doxycycline treatment, and once Acf1 or SNF2h expression levels were reduced, the cells were transfected with a plasmid encoding E4orf4 or an empty vector. To confirm the specific effect of the shRNA constructs, Acf1 or SNF2h protein levels were restored to WT levels by cotransfection with a plasmid expressing Acf1 or SNF2h which were rendered resistant to the shRNA by introduction of silent mutations. The ability of E4orf4 to induce cell death in the various samples was determined by a DAPI assay, in which the frequency of appearance of nuclei with apoptotic morphologies in the transfected cell population was measured7-9.
The protocol described here can be utilized for determination of the functional contribution of various proteins to induction of cell death by their protein partners in cases when constitutive knockdown may be cell lethal.

Contribution of the ACF chromatin remodeling factor to E4orf4-induced cell death was measured. The protocol includes selection of cell clones in which doxycycline treatment induces conditional knockdown of the ACF subunits Acf1 and SNF2h, and use of the DAPI assay to measure E4orf4-induced cell death in the inducible cell lines.

E4orf4 Bağlı Hücre Ölümü üzerine Nakavt Etkilerinin Gen Ekspresyonu ve Ölçüm Şartlı Nakavt için Hücre hatları hazırlanması

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...