Bu çalışma VENOMICS projesi, Yedinci Çerçeve Programı (FP7 SAĞLIK 2011-2015) aracılığıyla 278.346 ° Avrupa projesi hibe N tarafından desteklenmiştir. VENOMICS proje Avrupa&#39;nın çeşitli araştırma kurumları ve şirketler arasında bir işbirliği olduğunu: AFMB, Aix-Marseille Université (Fransa), CEA Saclay (Fransa), NZYTech (Portekiz), SistemasGenomicos (İspanya), Üniversite de Liege (Belçika), VenomeTech (Fransa), Vitamib (Fransa), Zealand Pharma (Danimarka) Bu çalışma Entegre Yapısal Biyoloji (FRISBI) ANR-10-InSb-05-01 için Fransız Altyapı tarafından desteklenmiştir. Yazarlar ayrıca video çekim için hazırlıkları ile yardım için Sayın Jeremy Turchetto teşekkür etmek istiyorum.

<ol>
	<li>Berrow, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+and+solubility+screening+in+Escherichia+coli:+a+comparative+study.">Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 1218-1226 (2006).</li><li>Correa, A., Oppezzo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+different+expression+parameters+to+achieve+soluble+recombinant+proteins+in+E.+coli:+advantages+of+high-throughput+screening.">Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins in E. coli: advantages of high-throughput screening.</a> Biotechnol J. 6, 715-730 (2011).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5, 135-146 (2008).</li><li>Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+quality+of+insoluble+recombinant+proteins+is+enhanced+at+low+growth+temperatures.">The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures.</a> Biotechnol Bioeng. 96, 1101-1106 (2007).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+systematic+N-+and+C-terminal+deletions+to+promote+production+and+structural+studies+of+recombinant+proteins.">The use of systematic N- and C-terminal deletions to promote production and structural studies of recombinant proteins.</a> Protein Expr Purif. 58, 210-221 (2008).</li><li>Bird, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+construction+and+small+scale+expression+screening+of+multi-tag+vectors+in+Escherichia+coli.">High throughput construction and small scale expression screening of multi-tag vectors in Escherichia coli.</a> Methods. 55, 29-37 (2011).</li><li>Davis, G. D., Elisee, C., Newham, D. M., Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fusion+protein+systems+designed+to+give+soluble+expression+in+Escherichia+coli.">New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli.</a> Biotechnol Bioeng. 65, 382-388 (1999).</li><li>Kapust, R. B., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+maltose-binding+protein+is+uncommonly+effective+at+promoting+the+solubility+of+polypeptides+to+which+it+is+fused.">Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 8, 1668-1674 (1999).</li><li>LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+as+a+fusion+partner+for+production+of+soluble+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli.">Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli.</a> Methods Enzymol. 326, 322-340 (2000).</li><li>Marblestone, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+SUMO+fusion+technology+with+traditional+gene+fusion+systems:+enhanced+expression+and+solubility+with+SUMO.">Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 15, 182-189 (2006).</li><li>Nozach, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+identifies+disulfide+isomerase+DsbC+as+a+very+efficient+partner+for+recombinant+expression+of+small+disulfide-rich+proteins+in+E.+coli.">High throughput screening identifies disulfide isomerase DsbC as a very efficient partner for recombinant expression of small disulfide-rich proteins in E. coli.</a> Microb Cell Fact. 12, 37 (2013).</li><li>Sachdev, D., Chirgwin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusions+to+maltose-binding+protein:+control+of+folding+and+solubility+in+protein+purification.">Fusions to maltose-binding protein: control of folding and solubility in protein purification.</a> Methods Enzymol. 326, 312-321 (2000).</li><li>Smith, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+fusions+to+glutathione+S-transferase+for+protein+studies.">Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies.</a> Methods Enzymol. 326, 254-270 (2000).</li><li>de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-based+procedure+to+increase+yields+of+soluble+recombinant+proteins+produced+in+E.+coli.">Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli.</a> BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).</li><li>Hatahet, F., Nguyen, V. D., Salo, K. E., Ruddock, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+reducing+pathways+is+not+essential+for+efficient+disulfide+bond+formation+in+the+cytoplasm+of+E.+coli.">Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli.</a> Microb Cell Fact. 9, 67 (2010).</li><li>de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+contributions+in+the+field+of+the+recombinant+expression+of+disulfide+bonded+proteins+in+bacteria.">Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria.</a> Microb Cell Fact. 11, 129 (2012).</li><li>Katzen, F., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+bond+formation+in+periplasm+of+Escherichia+coli.">Disulfide bond formation in periplasm of Escherichia coli.</a> Methods Enzymol. 348, 54-66 (2002).</li><li>Klint, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+disulfide-rich+venom+peptides+for+structural+and+functional+analysis+via+expression+in+the+periplasm+of+E.+coli.">Production of recombinant disulfide-rich venom peptides for structural and functional analysis via expression in the periplasm of E. coli.</a> PloS One. 8, e63865 (2013).</li><li>Braud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+expression+system+suitable+for+high-throughput+fluorescence-based+screening+and+production+of+soluble+proteins.">Dual expression system suitable for high-throughput fluorescence-based screening and production of soluble proteins.</a> Journal of Proteome Research. 4, 2137-2147 (2005).</li><li>Douzi, B. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+system+for+expressing+recombinant+animal+toxins+in+E.+coli.+(Collection+Rencontres+en+Toxicologie,+Publications+de+la+SFET,+Chatenay-Malabry).">A new system for expressing recombinant animal toxins in E. coli. (Collection Rencontres en Toxicologie, Publications de la SFET, Chatenay-Malabry).</a> Advances and new technologies in toxinology. , 149-152 (2010).</li><li>Groisillier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MARINE-EXPRESS:+taking+advantage+of+high+throughput+cloning+and+expression+strategies+for+the+post-genomic+analysis+of+marine+organisms.">MARINE-EXPRESS: taking advantage of high throughput cloning and expression strategies for the post-genomic analysis of marine organisms.</a> Microb Cell Fact.. 9, 45 (2010).</li><li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli.">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55, 65-72 .</li><li>Xiao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+high-throughput+protein+sample+production+platform+of+the+Northeast+Structural+Genomics+Consortium.">The high-throughput protein sample production platform of the Northeast Structural Genomics Consortium.</a> Journal of Structural Biology. 172, 21-33 (2010).</li><li>Saez, N. J., Vincentelli, R., Chen, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch3+High-throughput+expression+screening+and+purification+of+recombinant+proteins+in+E.+coli.">Ch3 High-throughput expression screening and purification of recombinant proteins in E. coli.</a> Structural Genomics: General Applications : Methods in Molecular Biology. 1091, 33-53 (2014).</li><li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway+(R)+recombinational+cloning:+a+biological+operating+system.">Gateway (R) recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 2, 571-589 (2007).</li><li>Vincentelli, R., Canaan, S., Offant, J., Cambillau, C., Bignon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+expression+and+solubility+screening+of+His-tagged+proteins+in+96-well+format.">Automated expression and solubility screening of His-tagged proteins in 96-well format.</a> Analytical Biochemistry. 346, 77-84 (2005).</li><li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+by+auto-induction+in+high+density+shaking+cultures.">Protein production by auto-induction in high density shaking cultures.</a> Protein Expr Purif. 41, 207-234 (2005).</li><li>Spencer, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channel+pharmacology+under+flow:+automation+via+well-plate+microfluidics.">Ion channel pharmacology under flow: automation via well-plate microfluidics.</a> Assay Drug Dev Technol. 10, 313-324 (2012).</li><li>Sala, E., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+optimized+protein+purification+protocols+by+coupling+small-scale+expression+and+mini-size+exclusion+chromatography.">Screening optimized protein purification protocols by coupling small-scale expression and mini-size exclusion chromatography.</a> Protein Expr Purif. 74, 231-235 (2010).</li><li>Moon, A. F., Mueller, G. A., Zhong, X., Pedersen, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synergistic+approach+to+protein+crystallization:+combination+of+a+fixed-arm+carrier+with+surface+entropy+reduction.">A synergistic approach to protein crystallization: combination of a fixed-arm carrier with surface entropy reduction.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 19, 901-913 (2010).</li><li>Zanier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structural basis for hijacking of cellular LxxLL motifs by papillomavirus E6 oncoproteins. 339, 694-698 (2013).</li><li>Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P1'+specificity+of+tobacco+etch+virus+protease.">The P1' specificity of tobacco etch virus protease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 294, 949-955 (2002).</li><li>Vincentelli, R., Romier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+in+Escherichia+coli:+becoming+faster+and+more+complex.">Expression in Escherichia coli: becoming faster and more complex.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 326-334 (2013).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors.">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152, 327-339 (2013).</li><li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+(LIC-PCR).">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18, 6069-6074 (1990).</li><li>Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+reliable+ligation-independent+cloning+of+PCR+products+using+modified+plasmid+vectors.">Rapid, reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors.</a> BioTechniques. 13, 515-518 (1992).</li><li>van den Ent, F., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RF+cloning:+a+restriction-free+method+for+inserting+target+genes+into+plasmids.">RF cloning: a restriction-free method for inserting target genes into plasmids.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 67, 67-74 (2006).</li><li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+automated+refolding+screening+of+inclusion+bodies.">High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 13, 2782-2792 (2004).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Çözünür, katlanmış, fonksiyonel proteinlerin ifadesi için tek bir genel protokol vardır. , Maliyet ve zaman verimli çoklu hedefleri ile çalışan en laboratuarlar veya protein çekirdek tesisleri nedenle hedeflerin çoğunluğu için çözünebilir aktif bir protein elde etmek için değişkenlerin en iyi &#39;genel&#39; kombinasyonunu bulmak için tarama yüksek verimlilik protein ifadesini kullanın. Biz, disülfid zengin peptidler ve proteinler 11 çözünebilir ifadesi için genel olarak uygulanabilir bir füzyon ortağı olarak DsbC belirledik. DsbC füzyonları ve yüksek verimli yöntemler kullanılarak, bir hafta içinde birden fazla hedefin çözünebilir ifadesi 11 gözlenebilir ve daha sonra, giriş kısmında ele alınanlar gibi ek değişkenler, daha fazla optimizasyon gerektiren hedeflere sonraki turda taranabilir. Burada tarif edilen protokoller disülfid bakımından zengin proteinler ve peptidlerin ifadesi yöneliktir. Ancak, kullanıcılar için exp isteyenbir yüksek verimli bir şekilde Arş olmayan ağ gibi örülmüş proteinleri, karşılık gelen protokollerin daha önce yayınlanmış olan ve başka bir yerde 22,24 bulunabilir. Yüksek verimli kurulum çözünebilir ifadesi ya da aynı anda birden fazla hedef gen için (çeşitli füzyon etiketler de dahil olmak üzere) bir ekspresyon yapıları, çok sayıda taranması için farklı proteinlerin büyük sayıda taranması dahil olmak üzere, bir dizi uygulamalar, (için idealdir veya birden fazla ifade başarı oranlarını artırmak için tek bir hedef) için oluşturur. Platform ayrıca hedeflerin çok sayıda yeni protokollerin kıyaslama ve doğrulama için kullanılabilir. Diğer uygulamalar, tek zor bir hedef için varyantların tarama, örneğin, tüm ortologlarını veya aynı aile üyeleri, ya da bir deneyde, tek bir hedefin mutantlarının bir panelinin üretimi başarısını test etmek için bulunur. Bu protokol, aynı zamanda ortak-sentezleme vektörleri (wit ile bir arada kullanılmaktadırh bir aşağı çekme ve doğru kompleks oluşumu ve stokiyometrisinden 33 onaylamak için daha kapsamlı biyofiziksel analizi takip protein-protein komplekslerinin ön karakterizasyonu izin) sadece protein etiketledi. Saflaştınldı protein miktarı, mikro-analizleri (fonksiyonel testler, protein-DNA 34 veya protein-protein etkileşimi deneyleri) bazen uygundur. Yüksek verimli sentezleme tarama stratejisi için bir çok avantajı vardır: (i) hedef, çok sayıda test yeteneği ya da tek bir deneyde değişken çok sayıda, (ii) sınırlı partiden partiye değişkenlik, (iii) basitlik ve (v) otomasyon potansiyeli ve izleme (vi), basitlik, daha büyük bir ölçekte, derin kuyular, (iv) ölçeklenebilirlik ve tekrarlanabilirliği ile daha küçük bir ölçekte çalışan ve bireysel tüplerin (no etiketleme, daha az işleme kolaylığı ) karıştırma bireysel tüplerin kullanımı ile daha plaka formatı kullanılarak veya klonlarının değişiminde ortaya hatalar. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; protokol bölümde ele birlikte, aşağıda kısaca ele alınacaktır deney hazırlanması için, pek çok önemli hususlar bulunmaktadır. Daha ayrıntılı bir tartışma için, önceki yayın 24 bakın. Maksimum verimlilik için, bu hedeflerin çok sayıda alt-klonlama kolaylaştırmak için, yüksek verimli klonlanması için uygun bir sistem olması faydalıdır. VENOMICS Projenin ilk aşamasında, biz haftada klonların yüzlerce bir tempoda herhangi bir hedef vektörü olarak subklonlama verir yönlü Geçidi rekombinasyon sistemini 25 kullanmaktadır. Ağ Geçidi rekombinasyon klonlama için Protokoller Invitrogen web sitesinde bulunabilir. Yüksek verimli klonlanması için diğer alternatifler 37 klonlama ligasyon bağımsız klonlama (LIC) 35,36 ve kısıtlama içermeyen (RF) içerir. Giriş klon koleksiyonlarından, şablon DNA&#39;dan PCR ile dahil olmak üzere, ekspresyon için hedef genlerin elde edilmesi için birden çok yolu vardır ya daVENOMICS proje için seçilen strateji sentetik genler,. Sentetik genlerin gen ve gen sentezi her iki ucundaki rekombinasyon ile birlikte sipariş edilebilir Hedef gen dizisinin kolay kodon optimizasyonu (nadir E. coli kodonu hariç) sağlar. Bu önerilir, ancak gerekli değildir. Nadir kodonların yüksek bir sayı, Rosetta 2 (yüksek derecede E. coli içinde ifade edilmeyen ender kodonlar için tRNAs taşır) (DE3) pLysS içeren kodon optimizasyonu olmadan hedefler için BL21 (DE3) pLysS daha uygun olabilir. Sitoplazma normal indirgeyici çevrede disülfid bağların azaltılması sınırlamak suşları olsa da, elimizdeki düzenli E kadar başarılı olmamıştır coli suşları 11. Analitik ölçek afinite saflaştırma çözünebilir füzyon proteinleri geri ve verimleri ölçmek amacıyla test sentezleme kültürlerden gerçekleştirilir. Nicel veriler inci elde edilebilirkültür, 100 mg / L - 0.1 aralığında ifade edilen füzyon proteinlerinin çözülebilir e verimleri. Hedef çözünür değilse, farklı füzyon ortakları takip önce, alternatif ifadesi ve indüksiyon sıcaklıkları suşları veya ortam test edilebilir. Disülfid açısından zengin proteinlerin çözülebilir ekspresyonu için, daha önce ifade sitoplazmik 11 DsbC&gt; DsbA&gt; GST&gt; MBP&gt; TRX&gt; HIS-etiketi olarak füzyon ortaklarının etkisini sırada yer almaktadır. Periplazma ifadesi disülfid zengin hedeflerin başarılı katlanmasına yardımcı olabilir başka bir olasılıktır. Periplazma sitoplazmada daha az indirgeyici ortam ve disülfid bağ yardımcı olmak için kullanışlı redoks şaperonlar içerir. DsbC, DsbA ve MBP periplazmik proteinlerin normal olarak sinyal dizileri ile periplazma lokalizedir. Bu katlama yardımcı olmak amacıyla, periplazmik boşluğa disülfid zengin hedefleri doğrudan bu etiketleri yararlanmak için bir fırsat sağlar. Inatçı hedefler için, bir sonraki adım p olacaktır(bu protokol kapsamı dışında olan ve burada 3 9 ele olmayacak), çözünmesi ve katlanamayan, katma gövdelerinden çözünmeyen HIS-etiketli hedef urify. Bu, yalnızca bir ya da iki disülfid bağları ile hedefler için oldukça basit olabilir, ama disülfid bağları sayısı arttıkça giderek daha zor hale gelir olabilir. Seçenek olarak ise, özellikle dört veya daha fazla disülfür bağları ile protein ve peptidler için, bu tür maya, böcek ya da memeli ekspresyon gibi daha karmaşık üretim sistemleri denemek için yararlı olabilir. Minyatür ve otomasyon gelişmeler ile, HTP elektrofizyoloji lab-on-a-chip teknolojileri 28 şüphesiz fonksiyonel analizler için geleceğin yol olacaktır. Biz, (belki de yapısal çalışmaları hariç) bu büyük ölçekli kültürler için olan ihtiyacı ortadan kaldırır doyurmaya çok amaç için düşünüyoruz. Küçük çaplı kültürler sentezleme koşulları taranması için faydalı değil, aynı zamanda mak, sağlamak mümkün olmazficient Bu minyatür işlevsel tahliller için örnek tutarındadır. Fonksiyonel karakterizasyonu için yeterli miktarlarda paralel olarak birden fazla hedefin üretme yeteneği kültürlenmesi ve platformlar, bu tür kullanarak maliyetlerini düşürür, rekombinant proteinlerin ekspresyonu ve karakterizasyonu daha fazla maliyet ve zaman etkili olacaktır. Protokoller, burada 7. Çerçeve Avrupa VENOMICS projesinin başlangıç ​​aşamasında disülfid zengin peptidler ve proteinlerin ekspresyonu için uygulanmıştır. Zehirleri ilginç genellikle farmakolojik potansiyeline sahip biyoaktif peptitler mükemmel bir kaynağıdır. Bununla birlikte, bunların üretimi nedeniyle karmaşık disülfür bağ kalıpları ve küçük bir boyuta zordur. Burada tarif edilen gibi yüksek verimli platformları kullanarak, VENOMICS proje doğada görülen çeşitliliğini yeniden üretmek için 10,000 yeni venom peptidleri içeren bir kitaplık oluşturmak için amaçlamaktadır. Bu kütüphane, disülfid-r karakterizasyonu için yararlanılabilir doyurmayayeni ilaçlar geliştirmek amacıyla olası farmakolojik veya terapötik uygulamalar ile ich peptidler. Platform şu anda VENOMICS projesinde kullanılmak üzere yeni protokoller kıyaslama ve doğrulamak için kullanılan ediliyor.

Genomik ilerlemesi ve yeni proteinlerin keşif hızlandırılmış oranda motive olmuş, yüksek verim boru hatları tarama ve optimal protein üretim stratejilerinin belirlenmesi için geleneksel yaklaşımlar parallelize için geliştirilmiştir. Optimize edilmesi olası değişkenler farklı sentezleme hedef şaperonlar 14,15, 5, füzyon ortakları 6-13, ko-ifade varyantları, 1,2, 3,4 sıcaklık, ortam 2,3 suşları, sitoplazmik arasında, ancak bunlarla sınırlı değildir: ya da periplazmik ifade 16-18 ve arıtma tampon bileşenler 3. Batch-parti varyasyon sınırlandırarak, yüksek verimlilik yaklaşımlar, çok değişken ya da pek çok hedef verimliliği yüksek düzeyde paralel olarak test edilebilir uygulayarak. Bizim tecrübelerimize göre, strateji de aynı kültürü (sıcaklık, medya, havalandırma, vb) ve arıtma koşulları (aynı resi kullanarak ölçek-up üzerine iyi tekrarlanabilirlik verirn, tamponlar, vb.) Çeşitli yüksek verimli platformları, yani bu tip füzyon ortakları, ekspresyon suşları veya sıcaklık 19-23 gibi değişik parametreler aracılığıyla, çözünür protein ifadesi için koşulları belirlemek için son on yıl içinde kullanılmıştır. Yakın zamanda çözünür disülfid açısından zengin proteinlerin 11 ekspresyonu için yüksek verimli tarama yaklaşımı kullanılabilir. Seçilen Proteinler zehirli kaynaklarından sadece, ama aynı zamanda bitkilerin, domuz, inek ve insan da dahil olmak üzere türlerinin geniş bir disülfid zengin enzim inhibitörleri dahildir. Deney, 12 farklı füzyon ortakları ve 28 disülfür ağsı proteinlerin çözünürlüğüne ve katlama üç farklı ekspresyon suşları etkilerini karşılaştırdık. Bu soy BL21 içinde üretimi için bir füzyon partneri (DE3) pLysS olarak DsbC kullanılarak çok outproduced (elde edilen çözünebilir proteinlerin verimi ve sayısı hem de) gerilme ve kaynaşma bunların herhangi bir kombinasyonu test edilen 11 olduğunu gösterdi.Bu deneyin sonuçları disülfid zengin hedeflerin ekspresyonu için daha uygun bir içine (proteinlerin geniş bir ekspresyon taramasında kullanılmıştır) orijinal genel yüksek verimlilik boru hattı 22,24 uyarlanması için temel oluşturmuştur. Hayvan zehirlerinden disülfit zengin proteinleri özel ilgi konusudur. Zehirleri farmakolojik ve terapötik potansiyel değeri ile, biyolojik olarak aktif peptidler ve proteinlerin bir karmaşık bir karışımıdır. Bununla birlikte, disülfid bağı ihtiva eden proteinlerin ifadesi önemsiz değildir. Bu proteinler genellikle yedi disülfid bağları göre bir içerirler, ve aktif olmak için doğru disülfid bağlayıcı desenleri ile okside edilmesi gerekir. Şu anda, platform 7. Çerçeve Avrupa VENOMICS Projesi (www.venomics.eu) bir parçası olarak disülfit zengin zehir hayvansal proteinlerin büyük sayıda ekspresyonunu tarama ve hedefler binlerce yüksek kapasiteli ekspresyon için yeni protokolleri kıyaslama için kullanılıyor . Burada, otomatik bir yöntemyüksek verimlilik küçük ölçekli ekspresyon tarama ve arıtma için (bkz. Şekil 1) için sağlanmıştır disülfid zengin hayvan zehir proteinleri uygulanabilir. Disülfid zengin peptitler ve proteinler için bir strateji, hedef proteinlere HIS-bölünebilir DsbC füzyonları oluşturmak saflaştırma ve redoks-aktif füzyon partneri, DsbC için bir HIS-etiketi, (bkz. Şekil 2) kullanır. Protokollerin odağı burada bir sıvı taşıma robot ve HTP elektroforezi kullanılarak otomasyon iken, bu yöntemler bir temel kurulum bile laboratuvarlar pahalı ekipman için herhangi bir önkoşul olmadan protokollerin yararlanabilirsiniz yani, aynı zamanda yüksek verim manuel yaklaşım için uygundur . Arıtılmadan ve analiz (disülfid zengin proteinlere özgü olmayan) için transformasyon için başka protokoller Manual 24 yayınlanmıştır ve burada tekrar edilmeyecektir. Rekombinant ile üretilen sentezleme klonundan manuel prosedürün hacmi (çözünür protein seviyelerinin analizi ulusal klonlama 25) SDS-PAGE algılama) veya 384 (4 x 96 kullanılarak (96 olduğu, (bkz. Şekil 1)), haftada kültürleri nokta leke ve SDS-PAGE 26 kullanılmıştır. (Örneğin, bir kaliper GXII LabChip sistemi 22 ile olduğu gibi, bir sıvı kotarma robotu ve nokta leke veya 26 HTP elektroforez kullanılarak bir yarı-otomatik bir şekilde gerçekleştirilir, bu arttırılabilir burada tarif edildiği gibi bir hafta boyunca paralel olarak en fazla 1,152 (12 x 96) kültürleri, sonuçlar) analizi için. Düzenli sallayarak inkübatör yeterli havalandırma için kısa yörünge yüksek hızda sallayarak kuluçka kullanımını gerektiren 96 (DW96) formatında, (sallayarak derin kuyu içinde yetiştirilen kültürler aksine kullanılabilir böylece kültürleme derin kuyuda 24 (DW24) biçiminde yapılır 800 rpm). Otomatik indüksiyon ortamı 27&#39;nin kullanımı da manuel indüksiyon aşamasını ortadan kaldırarak, ifade kolaylaştırır. Laboratuarlar zaten önceden tanımlanmış ifade ve Puri kullanmak hatta neredebahsedilmekte koşulları, bu sadece verimliliği artırmak için bu HTP sisteme doğrudan transfer edilebilir. Disülfid zengin proteinleri için yüksek verimli tarama hattı ayrıntılı bir şematik Şekil 3 &#39;de verilmiştir. Boru hattı parametreleri ile proteinlerin üretimi için en faydalı koşullarını seçmek için izin kapsamlı tarama deneylerinde, 11, 22 göre seçildi. Karakterizasyon numunenin mikrogram onlarca yeterli, veya hassas fonksiyonel deneyleri ve bağlama deneylerinde (örneğin, düşük hacimli HTP patch clamp sistemleri 28) için kılavuz çalışmalarında küçük ölçekli ifadeleri tarafından doğrudan saflaştırılmıştır etiketli proteinler üzerinde gerçekleştirilebilir. Aynı hatta etiketi ve proteaz (ters faz HPLC ile, örneğin) kaldırılır mesafede, yarılmadan sonra etiketsiz hedeflere gerçekleştirilebilir. Kalite kontrolü de (beklenen boyutu ve oksidasyon st teyit etmek için kütle spektrometresi ile yapılabilirate) veya kromatografik yöntemler () 29 saflığını veya heterojenliği onaylayın. Bazen bölünme (özellikle zayıf çözünür proteinler 30,31 için) gereksiz ve hatta istenmeyen bir etiket, bu nedenle bu protokol bölünmesinde isteğe bağlıdır. Ne olursa olsun, tüm yapılar, doğrudan (Şekil 2 ve Tartışma) bölünmesinden sonra yerli protein üretmek için, hedef genin bir önceki TEV proteaz bölünme sitesi (ENLYFQ / [G] 32) vardır. , Füzyon etiketinin yarılması isteniyorsa, bölünme etkinliğini analiz etmek için, küçük ölçekli (elüsyon fraksiyonu üzerinde ya da &#39;sütunu&#39;) test edilebilir, daha sonra ölçek büyütme deneyleri için verim güvenilir bir tahminini elde etmek ve eğer gerekli koşulları optimize eder. Afinite saflaştırma sırasında kullanılan tanelerin hacim için iki seçenek Deneyin amaçları ve beklentilere bağlı olarak bulunmaktadır. (Pilot deneyleri ya da MS saflaştırmak için ya da extrapol için mümkün olduğu kadar çok protein yakalamak edebilmek) ölçek büyütme elde etmek yedi reçinenin 200 ul nihai hacim sistemin doyurulmasından önce 1-100 mg / L kültür aralığında çözünür proteinin saptanmasını sağlayan kullanılmalıdır) Bölüm 8.1 &#39;de (protokolü (A bakınız) . Deneyin amacı, çözünebilir proteinlerin düşük miktarlarının tespiti ise, ancak, o zaman reçinenin 50 ul&#39;lik bir nihai hacim (B (protokolüne 0.1-25 mg / L kültür aralığında çözünür proteinin saptanmasına olanak tanıyan, uygun bir ) Bölüm 8.2). Gerekirse Üretim çözünebilir ifadesi için tanımlanan koşullar kullanılarak daha fazla yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için saflaştınldı hedefler miligram miktarları elde etmek için, yukarı ölçeklendirilebilir. AFMB kullanılan ölçek-up protokollerinin ayrıntıları başka bir yerde 22,24 tartışılmıştır. Deney düzeneği, protokol dahilinde kritik adımlar ile ilgili diğer detayları, modifikasyonlar ve sorun giderme ve teknik sınırlamalar diskin sağlanırussion. Deneyler başlamadan önce tartışma okuyunuz. Her aşamada% 90 başarı oranı beklemek protokolleri boyunca (örneğin, kültürlerin en az% 90, herhangi bir aşamada büyümesi olmalıdır). Deneyde bir aşamasının başarı oranı% 90 altına düşerse numuneler atılır ve deney yapıların tam toplanması için tekrarlanır. Bu, test edilen protein son derece bağımlı olacaktır Ancak, bu başarı oranı, çözülebilir proteinler veya% 100 verimle bölen konstruktların oranını ifade yapıların sayısı için geçerli değildir. Robot tezgahının set-up için özel ayrıntıları alternatif Worktable set-up için gerekli olan ancak onlar adapte edilebilir, (ayrıca bakınız Şekil 4) her protokol için sağlanmıştır. Robot donanım (Tecan) 96-kanallı koluna (MCA96), robotik manipülatör (RoMa) ve 8-kanal, sıvı taşıma başının (oluşurLIHA). MCA96 kullanan tüm adımlar da LIHA adımları arasında yıkanacak gerekir, çünkü ancak daha uzun sürer, bir MCA96 mevcut değilse LIHA kullanılarak yapılabilir. Robot teknik olarak steril bir ortam olmasa da, antibiyotik dahil genel olarak kirlenme ya da kısırlık ile ilgili sorunlar yok olmasını sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates. 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&#38;ID=5270&#38;Menu=1&#38;Item=21.1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR (PCR96) plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>652270</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at -20 &#176;C. Use a 1 in 1000 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>780270</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the expression of target constructs. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) pLysS competent cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or alternative E. coli expression strain of the user&#39;s choice. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathseal breathable adhesive film</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine with 96-well plate block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well sterile tissue culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662165</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l sterile disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 617</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Shaking Incubator, with 3 mm throw</td>
			<td>Infors</td>
			<td>AJ103</td>
			<td>Not essential, a regular shaking incubator can also be used. 
			http://www.infors-ht.com/index.php/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For glycerol stocks and elution using purification protocol B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the preparation of glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 616</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape pads&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td> 
			http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactinyl</td>
			<td>Orapi Group</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent microbial disinfectant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYP-5052 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for recipes of components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well 24 (DW24) plates,10 ml capacity&#160;</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7701-5102</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed, clear microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance readings. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reading spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional. For measuring OD600nm of cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with rotor for deep well plates&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Suitable for 3800 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mg/ml in water. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole ACS grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IX0005-1</td>
			<td>A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates)</td>
			<td>Misonix Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate (MgSO4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2M stock in water, autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE or Caliper sample buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Receiver/Filter Plate 20 &#181;m, 1.8 ml capacity</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740686.4</td>
			<td> 
			http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable wide bore tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 050 348</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni Sepharose 6 Fast Flow resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5318-02</td>
			<td>For purification of target fusion proteins. Store at 4 &#176;C. Wash and equilibrate before use. 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well 0.22 &#181;m filter plate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSGV N22 10</td>
			<td>Optional. To filter the soluble fraction after cleavage. 
			http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user&#8217;s discretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer and cuvettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip pipette tips</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Optional. The type of ZipTip is at the user&#39;s discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control. 
			http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author&#8217;s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in e. coli

Escherichia coli (E. coli), yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için rekombinant proteinlerin üretimi için en yaygın olarak kullanılan sentezleme sistemidir. Birçok protein çözünmeyen bir biçimde ifade edilmiştir Bununla birlikte, bazen proteinlerin saflaştırılması zordur. Zor veya çoklu hedefleri ile çalışırken bu nedenle hızla çözünür ifade için şartları tanımlamak üzere yüksek verim (SDP), küçük bir ölçekte protein ekspresyon tarama (1-4 ml kültür) kullanılması tavsiye edilir. Laboratuar çeşitli yapısal genomik programları, (rekombinant proteinin 0.1-100 mg / L kültür aralığında) nicel ve HTP protein ifadesi tarama protokolü proteinlerin binlerce uygulanan ve geçerliliği ile başa çıkmak için. Protokoller bir sıvı taşıma robot kullanımı ile otomatik ama aynı zamanda özel ekipman olmadan manuel olarak yapılabilir. Disülfit zengin zehir proteinler kazanıyorterapötik ilaç potansiyel olarak onların potansiyeli için bilinirliğinin artması. Bunlar son derece güçlü ve seçici olabilir, ancak bunların karmaşık disülfid bağı ağların üretilmesi için, zor hale. 7.ÇP, Avrupa Venomics projesi (bir üyesi olarak <a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a> ), bizim meydan fonksiyonel karakterizasyonu için yeni venom proteinlerinin binlerce üretmek amacı ile başarılı üretim stratejileri geliştirmektir. Disülfid bağı izomeraz DsbC redoks özellikleri yardımıyla, biz E okside, fonksiyonel zehir peptitlerin sentezlenmesi için HTP üretim boru hattı uyarlanmış coli sitoplazma. Protokolleri de çeşitli disülfid açısından zengin proteinlerin üretimi için de geçerlidir. Burada bizim boru hayvansal zehir proteinlerin üretiminde uygulanan göstermektedir. Protokolleri ile, burada tarif edilen bu çözünür disülfid zengin proteinler bir hafta gibi kısa bir sürede elde edilebilir olasıdır. Hatta küçük ölçekli, inci kullanmak için potansiyel vare pilot çalışmalarda, veya hassas mikro deneyleri için karakterizasyon için, kütle spektrometresi ile oksidasyon durumunu doğrulamak için proteinler saflaştırılmıştır.

Örnek sonuçlar VENOMICS boru hattından 96 disülfid açısından zengin proteinlerin ifadesi taranması için, Şekil 6&#39;da gösterilmiştir. Proteinler kalıntılarının sayısını artırmak disülfid bağların artan sayıda düzenlenir. Peptitler, bir His-tag ve DsbC füzyon ortağı ile sitoplazma içerisinde ifade edilmiştir. Tavsiye edilen kültür koşulları kullanırken, 12 bir OD 600 normal olarak elde edilir. Peptidler, nikel afinite reçinesi 50 ul nihai hacim ile protokol 8.2-B kullanılarak saflaştırılmıştır, bu ~ 25 mg / L füzyon proteininin maksimum Bu deneyde tespit edilebilir. Şekil 6A, kaliper LabChip sistemi (ayrılmasından önce, füzyon gösteriliyor) ve füzyon proteinin mg / L kültür elde etmek için ekstrapolasyon dayalı skorlama sistemi (0,1-2 mg / L kültür seviyelerinde, 2 den elektroforez sonuçlarını gösterir 10 mg / L kültür, 10-25 mg / L kültür no<html> t algılandı.) beklendiği gibi yarılan DsbC etiketi normalde yerine 27 kDa&#39;dan, yaklaşık 32 kDa&#39;da çalıştığını unutmayın. Benzer şekilde, DsbC füzyonları da beklenenden daha yüksek bir yaklaşık 5 kDa çalıştırın. Hedeflerin bir sürü için biz sağlam füzyon (üst bant) görmek değil sadece, aynı zamanda füzyon partneri yalnız (alt bant). Bu hedeflerin bazıları için kültür koşulları optimize tek başına DsbC nihai verimle bir artış sağlayan kıyasla bozulmamış füzyon (üst band) oranını artırabilir. Skorlama sadece sağlam füzyon seviyesine dayanmaktadır. Sadece 16 96 dışında proteinler füzyon düzeyde tespit edilememiştir. Bu% 83 genel başarı düzeyine karşılık gelmektedir. Algılanabilir 80 proteinleri arasında, bunlardan 45 2 mg / L kültür (% 56) daha yüksek düzeylerde tespit edildi. (Bu örnekte protokol 8.2 B ~ 25 mg / L füzyon proteininin en fazla tespit edilebilir kullanılarak olsa da) hedef ve füzyon bağlı olarak, protein verimleri 2-100 mg / L kültür aralığında genellikle. t &quot;&gt; mevcut disülfür bağlarının sayısı (Şekil 6B gösterilen) tarafından başarı analizi düşük başarı düzeyi 6 disülfit içeren hedefler için% 66 olmak üzere, (1 ve 7 arasında) test disülfit bağlarının tüm numaralar için makul bir başarı gösterir bağlar. izoelektrik noktası ve artıklarının sayısı (Şekil 6C&#39;de gösterilmektedir) göre ifade başarı dağılımının bir analizi her iki başarılı bir şekilde eksprese hedefleri ve arsa dağılmış saptanmamış hedefleri, teknik için belirli bir sapma gösterir. Şekil 6D DTT ile örnek indirgenmesi önce ve sonra, tek bir hedef için elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometrisi (ESI-MS) için elde edilen kütle spektrometresi sonuçları bir örneğini göstermektedir. Normal olarak, böyle bir kapsamlı kütle spektrometrisi analizi, ancak tam bir demonstratio amaçları için, (düşük bir örnek analiz edilmesi gerekir değil) gerçekleştirilmesi gerekir olmazn biz sonuçlar hem göstermiştir. Gösterilen hedef 4, disülfür bağları ile bir 5.7 kDa disülfid zengin zehir proteindir. Soldaki spektrumu bundan başka müdahalesi olmadan bölünmesi ve tuz giderme sonra olduğu gibi, önce DTT ile indirgeme için protein için sonuçları göstermektedir. Sağ taraftaki spektrumu herhangi bir fazla DTT çıkarmak için tuzunun giderilmesi, ardından DTT ile indirgemeden sonra proteini göstermektedir. Deney kitlelere karşılık gelen iyonların her biri iyonu için spektrum ve belirlenmesi ile ilgili oklarla işaretlenmiştir yeşil gösterilir. Bu iyonlar için hesaplanan deneysel ebeveyn kütlelerin (proteinin için ön indirgeme (= DTT) ve indirgeme (+ DTT) sonra) tabloda gösterilmiştir. Kitleler 8 Da&#39;lık bir kütle farkı gösterirler (önce indirgenmesi ve indirgenmiş numune için 5717,6 Da örnek için 5709,6 Da). 2 Da&#39;lık bir kütle farkı, 1 oksitlenmiş disülfid bağının varlığında karşılık gelen (beklendiği gibi), bu nedenle 8 Da&#39;lık bir kütle farkı 4 disülfid bağların varlığına işaret olarakindirgenmemiş örneği. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" /> Açıklanan yarı otomatik ekipman ile yüksek verimlilik ifade tarama protokolü Şekil 1.. Şematik., Bu protokolü kullanarak, 96-384 koşulları manuel yöntemlerle bir hafta içinde tek bir kişi tarafından test edilebilir, ya da en fazla 1.152 koşullar. İfade plazmidleri çok sayıda hedef bir seferde alt klonlanabilir, böylece rekombinant klonlama teknolojisi kullanılarak inşa edilmektedir. Bir kez çözünür ifade koşullar belirlenmiş ve gerçekleştirilen bölünme, istenirse, protein oksidasyonunu ve saflık, microassays ve / veya büyük ölçekli üretim kontrol etmek için kalite kontrol devam edebilirsiniz. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" wiDTH = &quot;500&quot; /&gt; Şekil 2,. Genel rekombinasyonel klonlanması için şematik ve tasarım oluştururlar. Hedef giriş klonlardan, çoklu ekspresyon vektörleri, bir yüksek verimli bir şekilde (bir hafta kadar 6 x 96 giriş klon) ve tek bir deneyde alt klonlanabilir. Ifade edilen protein, nikel afinite saflaştırılması için bir HIS etiketi kodlar. DsbC (sitoplazmik ifade için periplazmik sinyal dizisini içermeyen) füzyon partneri, çözünürlük ve / veya yardım katlama ve hedef proteinin doğru oksidasyonunu artırmak için kullanılır. Etiket bölünme isteniyorsa hedef kodlama dizisi, bir N-terminal TEV proteaz sitesi (ENLYFQ) içermesi gerektiğini not edin. Sol üst ek PCR ya da gen sentezi ile elde edilebilir bir verici vektör ve hedef sekansları kullanılarak giriş klonlarının üretimi gösterilmektedir. Entry klonlar da ticari giriş klon koleksiyonlarından elde edilebilir. Birden rekombinasyonel klonlama sistemleri mevcuttur, ancak biz Geçidi syste kullanmakm, şemada gösterildiği gibi. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" /> Birden çok disülfid zengin hedefler için Şekil 3,. Yüksek verimli tarama hattı. Hedefleri ilk BL21 (DE3) pLysS E. sitoplazmasında HIS-DsbC füzyonları olarak ifade edilmiştir oto-indüksiyon ortamı (ZYP-5052) kullanılarak 37/17 ° C coli. Saflaştırma HTP elektroforezi (veya nokta lekeleme / SDS-PAGE ile birlikte) ile çözünür konstruktların saptanması, ardından nikel reçinesi üzerinde gerçekleştirilir. Ifade tarama ilk turda başarısız olursa, alternatif kültür koşulları çalışılmıştır. Yapılar, yeterince yüksek verim, microassays ve kalite kontrol çözünür proteinlerin üretilmesi durumunda gerçekleştirilebilir ve gerekirse, büyük ölçekli üretim takip edilebilir. Çözünür verimleri yeterince yüksek değildir hedefler için, ifade tarama alternatif stra ile devam edebilirsinizins ve sonra sıcaklıklar diğer füzyon ortakları ve periplasmik ifade. İsteğe bağlı adım noktalı kutularla gösterilir. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" /> HTP platformu için Şekil 4.. Robot Worktable kurulum. Alternatif işyerleri de kullanılabilir olmasına rağmen bizim sıvı taşıma robot tezgahının düzeni gösterilir, mevcut eşdeğer siteler bulunmaktadır sağladı. Kur (8-kanal, sıvı taşıma kafası (LIHA)), 4 pozisyonları ile iki mikrotablaya taşıyıcıların her (MP4, 1-4 ve 5-8 pozisyonları), 2 pozisyonlu bir vakum istasyonu için bir yıkama istasyonu (WS) oluşur Bir taşıyıcı (Te-Çalkalayıcılar 14-15 ve 16-17 pozisyonları) 2 pozisyon iki plaka karıştırıcısı her 3 pozisyonlu bir mikrotablaya taşıyıcı (MP3, 11-13 pozisyonları), (Te-elektrikli süpürgeler, 9 ve 10 pozisyonları) ve 3 pozisyonları ile tek ipuçları (DITI, 18-20 pozisyonları). Ek olarak,Yeniden iki otel derin kuyu plakaları için olan taşıyıcılar ve (gösterilmemiş olan) için, bir mikro bulunmaktadır. Sıvı taşıma robot yüklü donanım tek kullanımlık uçları, etrafında tabaklar / ekipman hareket sabit ipuçları ile 8-kanal, sıvı taşıma kafası (LIHA) ve bir robot manipülatör (RoMa) ile kullanmak için bir 96-kanallı kol (MCA96) olduğunu çalışma tezgahı. Kutup numaralandırılması protokol boyunca adlandırılır. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5,. Dört adet 24 oyuklu plakalar tek bir 96-yuvalı plaka aktarmak için şematik. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" /> Şekil 6.. Temsilcisi sonuçları 96 disülfür zengin zehir pro ifadesi ekran için gösterilirproteinlerden. Proteinler sitoplazmada HIS-DsbC füzyonları olarak ifade edilir ve nikel reçinesi 50 ul (Protokol 8.2-B) kullanılarak saflaştırılmıştır. A) ifade tarama sonucu, sanal jel gösteren ve ifade verimi için puanlama. Sanal jel kontrast çok soluk veya yoğun bantları telafi etmek için şerit-to-şeritli ayarlandı. Bazı hedefler için iki bant üst bant disülfid bağların sayısı ile karşılaştırıldığında). B, tek başına füzyon etiketine karşılık gelen bozulmamış füzyon proteini ve alt bant için her ekspresyon seviyesinde ifade edilen proteinlerin oranı karşılık gelen görülebilir unutmayın protein. Her gruptaki proteinlerin gerçek sayısı grafik. ° C) üzerine yerleştirilmiştir, izoelektrik noktası (pl) ve kalıntıların sayısına göre ekspresyon düzeylerinin dağılımı. D), bir 5.7 kDa disülfid zengin zehir için kütle spektrometresi sonuçları örnek 4, disülfür bağları ile protein. Üzerinde spektrumSol taraftaki önce DTT ile indirgeme ve sağ taraftaki spektrumuna protein DTT ile indirgendi ve daha sonra tuzu giderilir protein sini göstermektedir. Deney kitlelere gelen iyonları oklarla işaretlenmiştir ve atamaları yeşil gösterilmiştir. Indirgemeden önce ve sonraki indirgeme tabloda gösterilen ve indirgeme maddesi ilave edilmeden önce okside protein varlığında tekabül eden, 8 Da&#39;lık bir kütle farkı sergileyen olan proteini için deneysel kütleleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">bu şekilde daha büyük bir sürüm görüntülemek için tıklayın .</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Yemek tarifi </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> ZY </td><td> ~ 928 ml 10 g tripton 5 g maya hülasası 925 ml su </td><td> Mix ve daha sonra sterilize etmek için otoklav. </td></tr&gt; <tr><td> 2 M MgSO 4 </td><td> 100 mi 49.3 g MgSO 4 · 7H 2 O ~ 60 ml su </td><td> Çözülene kadar karıştırın sonra sterilize etmek için otoklav. </td></tr><tr><td> 50x 5052 </td><td> 1 L 250 g gliserol 730 ml su 25 g glukoz 100 g α-laktoz </td><td> , Sırayla Ekle eriyene kadar ısı boyunca karıştırıldı daha sonra sterilize etmek için otoklav. </td></tr><tr><td> 20x NPS </td><td> 1 L 900 ml su 66 g (NH4) 2 SO4 136 g KH 2 PO 4 142 g Na 2 HPO 4 </td><td> Sırayla ekleyin ve bütün çözülmüştür sterilize etmek için otoklav kadar karıştırın. </td></tr></tbody></table> ZYP-5052 ortam bileşenleri için Tablo 1 &#39;. Tarif.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli at JoVE.com

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Tarama kantitatif, yüksek miktarda ifade ve küçük ölçekli Escherichia coli kültürlerinden füzyon proteinlerinin saflaştırılması için analitik bir protokol tarif disülfid zengin hayvansal protein zehir hedeflerin ekspresyonu uygulanır.

Üretilen Rekombinant Disülfid zengin Venom Proteinler Uygulanan Yüksek Randımanlı Sayısal Anlatım Tarama ve Arıtma<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

high-throughput-quantitative-expression-screening-purification

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

23.9K Görüntüleme.  Aix-Marseille Université.  Tarama kantitatif, yüksek miktarda ifade ve küçük ölçekli Escherichia coli kültürlerinden füzyon proteinlerinin saflaştırılması için analitik bir protokol tarif disülfid zengin hayvansal protein zehir hedeflerin ekspresyonu uygulanır. 

Video: High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biyoloji

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Peptidler ve proteinler ile rekombinant Elastin gibi Polipeptitlerin ve Fusions olmayan kromatografik saflaştırma<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Lusiferaz ifade eden rekombinant virüsler yüksek verimlilik Titrasyon

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein belonging to the prion family. A chromatographic method for the purification of (His)6-tagged recombinant Shadoo expressed as inclusion bodies is described. The inclusion bodies are solubilized in 8 M urea and bound to a Ni2+-charged column to perform ion affinity chromatography. Bound proteins are eluted by a gradient of imidazole. Fractions containing Shadoo protein are subjected to size exclusion chromatography to obtain a highly purified protein. In the final step purified Shadoo is desalted to remove salts, urea and imidazole. Recombinant Shadoo protein is an important reagent for biophysical and biochemical studies of protein conformation disorders occurring in prion diseases. Many reports demonstrated that prion neurodegenerative diseases originate from the deposition of stable, ordered amyloid fibrils. Sample protocols describing how to fibrillate Shadoo into amyloid fibrils at acidic and neutral/basic pHs are presented. The methods on how to produce and fibrillate Shadoo can facilitate research in laboratories working on prion diseases, since it allows for production of large amounts of protein in a rapid and low cost manner.

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

Saflaştırma ve Amiloid fibrillerin kadar yeniden katlama (His)<sub&gt; 6</sub&gt; etiketli Rekombinant Shadoo Protein Eklenmesi Organları olarak ifade<em&gt; E.coli</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...