Bu çalışma ROJW yanında a Wellcome Projesi Hibe (078043/Z/05/Z) tarafından desteklenmiştir

BÖLÜM A: bakteri kültürlerinin Yüksek throughput büyüme. 1. 24 oyuklu plakalar kullanılarak Autoinduction Orta 2 ml gecelik bakteri üremesine <ol><li> Mikrodalga ile 24 oyuklu plakalar sterilize edin. </li><li> Taze yetişen bakteri kolonilerinin veya dondurulmuş gliserol stokları ile autoinduction orta (Gecelik Express Orta) 1.5 ml inoküle edin. Biz normalde üç ayrı klonlanmış kolonileri ile mutant başına üç kuyu aşılamak. Pozitif ve negatif kontroller için Rezerv altı kuyu. Pozitif kontrol için biz üç yabani-tip klonlar büyümek ve negatif kontroller için biz olmayan bir ifade plazmid ile transforme edilmiştir 2 klonlar büyüyorlar. Orta sadece kontrol için de boş bir bırakarak plaka yeterli sterilizasyon için kontrol edin. </li><li> 37, 18 saat süreyle hücrelerinin büyümesini ° C ve 250 rpm&#39;de sallama. Biz lac-indüklenebilir BL21 (DE3) Rosetta 2 hücreleri kullanır. Autoinduction orta glikoz ve laktoz bir karışımını içerir. Başlangıçta bakteriAyrıca, rekombinant proteinlerin ekspresyonuna sebep olur, laktoz, kullanmaya başlamadan sonra glikoz ile beslenirler ve. </li><li> Kapağını kaldırın ve robotik platformu üzerinde plakası yerleştirin. </li></ol> BÖLÜM B: rekombinant proteinlerin Robotik saflaştırılması. 2. Robotik Platform hazırlayın <ol><li> 20 mM imidazol içeren tampon yıkama makyaj,% 0.1 Triton X-100, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-asetat, pH 7.9, 10 mM MgOAc 2, 0.7 mM ZnOAc 2,% 10 gliserol, ve elüsyon tampon oluşan 0.5 M imidazol,% 0.1 Triton X-100, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-asetat, pH 7.9, 10 mM MgOAc 2, 0.7 mM ZnOAc 2,% 10 gliserol. Bu arabellekleri etiketli proteinler onlara bağlı edildikten sonra boncuklar yıkamak için, ya da sırasıyla, boncuklar proteinleri elüt edilmesi için kullanılır. </li><li> Bakteriyel seyreltici (15 ul köpürmeye reaktifi ile 100 ml saf su) Makyaj. Bu çözelti kullanılacaktıroptik yoğunluk (A600) ölçümleri için bakteriyel gecede kültürlerin dilüsyonları yapmak. Seyreltici olarak köpük önleyici varlığı plaka okuyucu ölçümleri ile engel hava kabarcığı oluşumunu engeller. </li><li> 10x Fastbreak reaktif, numune başına 2 ul Lysonase ve 15 mM MgOAc 2 oluşan lizis çözüm Makyaj. Fastbreak bakteriyel hücre duvarları yıkmak ve hücre içi proteinlerin salınımını kolaylaştırmak deterjan ve tuz karışımını içerir. Lysonase lizozim ve nükleaz tescilli bir karışımıdır. Lizozim hücre duvarı kesintiye asist ve nükleaz yayımlanan bakteriyel nükleik asitler sindirir. </li><li> İsteğe bağlı: 6 M guanidin hidroklorür solüsyonu Makyaj. Bazı rekombinant proteinler Teflon kaplı pipetleme iğne sopa eğilimindedir. Guanidin hidroklorür solüsyonu yıkılır proteinler ve rutin olarak her st sonra yıkanabilir robotik pipetleme ipuçları durulama için kullanılan sudan daha etkili bir şekilde kapalı yıkarep. </li><li> Karıştırma bicinchoninic asit çözeltisi (reaktif A) ve bakır sülfat çözeltisi (reaktif B) ile BCA (bicinchoninic asit) protein miktarının reaktif hazırlanması: Peptid bağların + BCA reaktif içinde mevcut CuSO 4 bileşeninden Cu 1 ila Cu2 + vasıtasıyla azaltmak Cu 1 + miktarı çözeltisi içinde mevcut peptit bağlarının sayısı ile orantılıdır. İkinci adımda, bicinchoninic asit şelat Cu 1 iki molekül + mor renk elde edilir, 562 nm Absorbans vardiya sonuçlanan. Renkli reaksiyon süresi bağlıdır ve genellikle kesin olması için birkaç saat gerekir. Daha sonra renk birkaç saat boyunca stabildir. </li><li> Sağ boyutu olukları veya plakaları doldurun ve robotik platformu öncesi tahsis durumlara sokar. </li><li> Guanidin hidroklorür atık için yer bir 24 plaka, OD 600 ve absorbans ölçümleri ve bir mavi 96-th için plaka için iki net 96-kuyucuğuE platformda konumlarını proteinler saflaştırılmış. Manyetik stand biri 96-derin kuyu plaka yerleştirin. </li><li> MagneHis seyreltin Ni-parçacıklar oluşturarak proteinleri bağlamak distile su içinde 5 kat ve boncuk-karıştırma ünitesi içine doldurmak onların His-etiketleri ile şelatları. Süspansiyon boncuk tutmak için karıştırıcı açın. </li><li> Robot platformu açın ve aksi pipetleme doğruluğu engel olacak hava kabarcıklarını çıkarmak için birkaç dakika için pipetleme iğneler yıkayın. Yeniden kullanılabilir pipetleme iğneler bireysel pipetleme adımlar arasında temizlendi. Alternatif olarak, tek kullanımlık uçları kullanılabilir. Tüm takip eden adımlar robot tarafından yapılmaktadır. Robotik protokol istek üzerine mevcuttur. </li></ol> 3. Hücre Büyümesi OD600 Ölçme tarafından İşaretli <ol><li> Gece boyunca kültür 10 ml seyreltici çözelti 90 ul içinde seyreltilir. </li><li> Bakterilerin benzer yoğunlukları büyüdü sağlamak için OD 600 ölçün(Şekil 1). </li></ol> 4. Hücreler Proteinler bırakın ve bekleyin kadar Broken olan Boncuk bağlayıcı <ol><li> Ni-manyetik boncuk süspansiyonu 100 ul, ikinci bir 24 oyuklu plakanın her oyuğuna dağıtılır. </li><li> Her bir küçük ölçekli bakteri kültürü 900 ul boncukları ihtiva eden 24 oyuklu plaka içine aktarılır. 10x Fastbreak / Lysonase karışımı 100 ul ekleyin. </li><li> 24 oyuklu plaka, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hızlı bir sallama (800 rpm) için sallama platforma aktarılır. Bakteriyel hücre duvarları mekanik kuvvetler ve kimyasal eylem ve Birleştirilerek üretilen proteinlerin çözelti içine salınır kombinasyonu ile bozulur. Afiniteleriydi etiketler ile hemen paramanyetik şelatlama nikel boncuk bağlamak. </li></ol> 5. Boncuk Yıkanmış edilir <ol><li> Yeniden süspanse manyetik boncuklar içeren hücre lizatları m olan bir ayak üzerinde konumlandırılmış bir 96-derin kuyu plakası aktarılıragnetic çubuklar bu kuyular arasındaki slayt. 96 oyuklu plakalar süpernatan daha kolay çıkarılması sağlayan bir kare koni-şekilli alt var. Kuyuları 2,1 ml kadar hacimleri tutabilir ama çok küçük miktarlar ile doldurulur. Bu bizi sıçratarak örnek çapraz kontaminasyon olmadan dinç sallayarak adımları gerçekleştirmenizi sağlar. </li><li> Pipet uçları 6 M guanidin-HCl ile bireysel pipetleme adımlar arasında yıkanır. Bu adım çapraz bulaşmayı önlemek için TFIIB ve diğer &quot;yapışkan&quot; proteinlerin saflaştırılması için çok önemlidir. Diğer proteinler sayesinde pipetleme adımlar arasındaki su ile yoğun iğneler durulama için yeterli olabilir. </li><li> Manyetik stand manyetik çubuklar, paramanyetik boncuk çekmek kuyuların merkezlerinden uzağa çekerek ve pipetleme iğneler süpernatant ücretsiz erişim sağlar. Süpernatan atılır. </li><li> Yıkama tamponu 500 ul önce 24 oyuklu plakaya ilave edildi ve daha sonra e göre 96-kuyucuklu plakaya aktarılırboncuk tam transfer nsure. 24 oyuklu plaka çalkalayıcısı kaldırılır. </li><li> Yıkama tamponu diğer bir 500 ul 96-kuyulu plaka üzerine direkt olarak ilave edilir, plaka çalkalayıcı aktarılır ve 1 dakika süreyle kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Plaka manyetik stant geri taşındı ve yıkama tamponu atılır. </li><li> Bu basamak iki kere tekrarlanır ve yıkama işlemini levha herhangi bir tampon kalıntıları çıkarılarak tamamlanır. </li></ol> 6. Seyreltme Tampon maddesi olarak Proteinler elute <ol><li> Elüsyon tampon 100 ul boncuklar ilave edilir, plaka çalkalayıcı taşınır ve kuvvetli bir şekilde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çalkalanır. </li><li> Plaka saflaştırılmış rekombinant proteini içeren, çalkalayıcı ve elüsyon için geri hareket eder, yeni bir plaka için transfer edilir. </li></ol> 7. Saflaştırılmış Proteinlerin konsantrasyonları ölçün <ol><li> BCA reaktif karışımı 190 ul açık bir 96-kuyucuklu plakaya aktarılır ve pro 10 ul olduğuTein çözeltisi eklenmiştir. </li><li> İnkübasyon (genellikle 5-6 veya gece) birkaç saat sonra, absorbans ölçmek ve saflaştırılmış protein preparatları (Şekil 2) her konsantrasyonlarını belirlemek için BSA standartları ile karşılaştırın. </li><li> Saflaştırılmış proteinler şu anda uygun konsantrasyonları (Şekil 3) aşağı uygulamalar için de kullanılabilir. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar Arıtma protokolü, iki kalite kontrol aşamaları, gösterilmektedir ki örneklerini sunmaktadır. Biz saflaştırılmış protein verimleri (Şekil 2) değerlendirilmesi üzerine bakteriyel büyüme evresi (Şekil 1) ve daha sonra olası sorunları belirlemek ve belgelemek için edebiliyoruz. Biz genellikle protein arındırmak ve üç nüsha halinde onları test. Bu, iki kalite kontrol aşamaları ile birlikte, bizi bizim fonksiyonel deneylerde gözlenen herhangi bir değişiklik mutant phenotyp bağlı olduğu güven verirE (Şekil 3) ve denemedeki varyasyonları veya başarısız arındırmalardan kaynaklanır. Verimi 50-200 mikrogram, tipik aralığı elde edilir ve çeşitli fonksiyonel testler için yeterli daha vardır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig1.jpg" /> Şekil 1. Gecede kültürleri ile 24 kuyulu plakanın OD ölçümlerin Histogram. Yanı sıra yabani-tip TFIIB itibaren altı TFIIB mutant varyantları Üç klonları büyümüş edilmiştir. Orta olmayan bir ifade plazmid ve iyi taşıyan iki klonları sadece negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. OD ölçümleri bireysel kültürler arasındaki büyüme oranlarındaki küçük farklılıklar olduğunu göstermektedir. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4110/4110fig2.jpg" /> Şekil 2. Bir BCA yöntemi ile belirlenir ve SDS PAGE tarafından onaylandıktan bu kültürlerden elde edilen protein verimleri. Çeşitlerinden biri yüksek seviyelerde eksprese edilmez. Com olarakŞekil 1 ile kombi, bu diferansiyel hücre büyümesi nedeniyle değildi ama nedeniyle protein ekspresyonu düzgün indüklenen olmamak sonucuna varabiliriz. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig3.jpg" /> Şekil 3,. Bir transkripsiyon tahlilin Örnek sonucudur. Bu RNAP göre küçük başarısız transkript üretimi üzerinde TFIIB türevleri uyarılması etkinliği ölçülmüştür. Burada, TFIIB kalıntı K87 arasında tek bir amino asit ikamesine, tam bir kütüphane uyarma etkileri gösterilmiştir. Tekrarlanabilirliği yüksek derecede küçük hata oranları ile teyit edilir. Yabani-tip (wt), negatif kontrol (NC) ve elüsyon tampon ile karşılaştırıldığında üç mutantların performansını gösteren bir örnek jel sadece kontrol altında tasvir edilmiştir.

<ol>
	<li>Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nucleotide+addition+cycle+of+RNA+polymerase+is+controlled+by+two+molecular+hinges+in+the+Bridge+Helix+domain.">The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain.</a> BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).</li><li>Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+polymerase+factory:+a+robotic+in+vitro+assembly+platform+for+high-throughput+production+of+recombinant+protein+complexes.">The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).</li><li>Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridge+helix+and+trigger+loop+perturbations+generate+superactive+RNA+polymerases.">Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases.</a> J. Biol. 7, 40 (2008).</li><li>Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linker+domain+of+basal+transcription+factor+TFIIB+controls+distinct+recruitment+and+transcription+stimulation+functions.">The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.</a> Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).</li><li>Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+Function+of+TFIIB.">Revealing the Function of TFIIB.</a> Transcription. , (2011).</li><li>Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+and+regulated+transcription+in+Archaea.">Basal and regulated transcription in Archaea.</a> Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).</li><li>Parvin, J. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topology+and+a+minimal+set+of+basal+factors+for+transcription+by+RNA+polymerase+II.">DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II.</a> Cell. 73, 533-540 (1993).</li><li>Tyree, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+minimal+set+of+proteins+that+is+sufficient+for+accurate+initiation+of+transcription+by+RNA+polymerase+II.">Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II.</a> Genes. 7, 1254-1265 (1993).</li><li>Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+of+nucleoside+triphosphates+and+role+of+the+entry+site+to+the+RNA+polymerase+II+active+center.">Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).</li><li>Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+an+RNA+Polymerase+II-TFIIB+Complex+and+the+Transcription+Initiation+Mechanism.">Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism.</a> Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).</li><li>Kostrewa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+polymerase+II-TFIIB+structure+and+mechanism+of+transcription+initiation.">RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation.</a> Nature. 462, 323-330 (2010).</li><li>Werner, F., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+modulation+of+RNA+polymerase+core+functions+by+basal+transcription+factors.">Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors.</a> Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada açıklanan otomatik bir rekombinant protein saflaştırma yöntemi, en az bir insan müdahalesi ile büyük ölçüde yeniden üretilebilir koşullar altında küçük çaplı bir biçimde mutant proteinlerin bir çok sayıda üretim ve arıtma sağlar. Şekiller 1 ve sistematik bir kalite kontrol ve örnekleri 2 kez sonuç proteinler saflaştırılmıştır. Şekil 3, bu örnekte kullanılan saflaştırılmış transkripsiyon faktörleri işlevsel tahlillerde bir çok tekrarlanabilir bir şekilde gerçekleştiren. Işlem arkeal TFIIB saflaştırılması için geliştirilmiş olmasına rağmen, bu yakınlık-etiketli proteinlerin saflaştırılması için yaygın olarak uygulanmaktadır. Bu tür otomatikleştirilmiş arıtma protokolü kullanımı böylece önemli ölçüde rekombinant proteinlerin biyokimyasal analiz kolaylaştıracak ve böylece el ile elde etmek zordur, bir ölçek üzerinde protein-protein etkileşimleri anlaşılmasında daha fazla olacaktır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Acele Anında TB Orta </td><td> Merck Kimyasallar Ltd </td><td> 71491-4 </td><td></td></tr><tr><td> Fastbreak </td><td> Promega Ltd </td><td> V8573 </td><td></td></tr><tr><td> Lysonase Biyoişleme Reaktif / 1 ml </td><td> Merck Kimyasallar Ltd </td><td> 71230 </td><td></td></tr><tr><td> Antifoam 204 </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> A6426 </td><td></td></tr><tr><td> MagneHis Ni-Parçacıklar </td><td> Promega </td><td> V8565 </td><td></td></tr><tr><td> Imidazol </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> 56750 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma tabanı </td><td> Sigma-Aldrich CompHerhangi Ltd </td><td> 93362 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> Bicinchoninic Asit protein tayini </td><td> Sigma-Aldrich Company Ltd </td><td> BCA1-1KT </td><td></td></tr><tr><td> Derin Kuyu Plate 2.2 ml Meydanı Wells PP PK10 </td><td> Anachem Ltd </td><td> 1810-1800 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroplaka kuyucuk 96 düz dipli polistren 5 besiyeri berrak 0.4 ml de hacim 128 mm 12 kollu x 86 mm Thermo Scientific Nunc tedavi edilmediği </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> DIS-984-090M </td><td></td></tr><tr><td> Mikroplaka Mavi </td><td> VWR </td><td> NUNC367001 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Peki Blokları RB (24) </td><td> Qiagen </td><td> 19583 </td><td></td></tr><tr><td> Guanidin hidroklorür </td><td> VWR </td><td> ALFAA13543.0B </td><td></td></tr><tr><td> TheOnyx için Yıkanabilir iğne </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-317001 </td><td></td></tr><tr><td> Manyetik Boncuk reaktifi Raf </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-035003 </td><td></td></tr><tr><td> Plaka Okuyucu Synergy HT </td><td> Biotek </td><td> 4200-000043 </td><td></td></tr><tr><td> Robotik Platform TheOnyx 44OH/150/100 </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8145-050046 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroplaka Çalkalayıcı Variomag Teleshaker </td><td> Inheco </td><td> 3800047 </td><td></td></tr><tr><td> 96-Mıknatıs Tip A </td><td> Qiagen </td><td> 36915 </td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput purification of affinity-tagged recombinant proteins

X-ışını kristalografisi proteinlerin yapı daha detaylı bilgi elde etmek için tercih edilen bir yöntemdir. Bu tür çalışmalar yapı / fonksiyon ilişkisinde detaylı bilgilere elde etmek ileri biyokimyasal analizler ile tamamlanması gerekir. Oligonükleotid ve gen sentez teknolojisindeki gelişmeler, her 19 diğer amino asitler ile hedef artıkların ikame dahil olmak üzere, artan bir şekilde uygulanabilir büyük ölçekli mutajenez stratejileri, olun. Kazanç veya kayıp fonksiyon-fenotipleri sonra bu katalitik aktivitesi, protein stabilitesi ve / veya protein-protein etkileşimleri özgüllük özellikle kalıntı katkısı olarak, sistematik sonuçlar çıkarılabilir sağlar. Mutasyonun doğası farklı fenotipleri atfetmek için - ziyade dalgalı deneysel koşullara - bunun kontrollü ve tekrarlanabilir bir şekilde protein arındırmak ve analiz etmek hayati önem taşımaktadır. Yüksek verim stratejileri ve manuel protokolleri otomasyonrobotik sıvı işleme platformları az insan müdahalesi ve minimal hata oranları 1-5 ile böyle karmaşık moleküler biyolojik işlemleri gerçekleştirmek için fırsatlar yarattık. Burada, yüksek verimli bir şekilde His-etiketli rekombinant protein arıtma için genel bir yöntem sunulmaktadır. Yeni bir çalışmada, biz TFIIB ayrıntılı bir yapı-fonksiyon soruşturma, bazal transkripsiyon makine bileşeni için bu yöntem uygulanır. TFIIB in vitro transkripsiyon promotör-yönlendirilmiş için vazgeçilmez ve bir preinitiation 6-8 kompleks haline RNA polimeraz alımı için gerekli olmasıdır. TFIIB RNA polimeraz 9-11 yarık aktif sitesine nüfuz eden esnek bir bağlayıcı alanı içerir. Bu, bağlayıcı alan TFIIB, yani (i) transkript inisiyasyon &#39;prematüre&#39; aşamasında katalitik aktivitesinin uyarılması üzerinde iki biyokimyasal olarak ölçülebilir etkinlikler confers, ve (ii) bir ek katkı4,5,12 kompleks preinitiation içine RNA polimeraz spesifik işe. Biz TFIIB linker içerisinde tek, çift ve üçlü ikamesi ve silme mutasyon oluşturmak için ve sonradan RNA polimeraz 4 katalitik aktivitesi üzerine stimülasyon etkisi için fonksiyonel testler bunları analiz etmek için yüksek verimli arıtma yöntemi kullandı. Toplamda, üretilen, saflaştırılmış ve 381 mutantlar analiz - elle gerçekleştirmek için zaman alıcı ve zahmetli olurdu bir görev. Ürettiğimiz ve bize herhangi bir deneysel varyasyonları takdir izin ve bize bizim sonuçların tekrarlanabilirliği net bir fikir verdi multiplicates içinde proteinlerin ölçüldü. Bu yöntem, His-etiketli proteinlerin saflaştırılması için bir genel protokol görevi görür ve başarılı bir diğer Rekombinant proteinlerin saflaştırılması için kullanılmıştır. Bu, şu anda 24 proteinlerin saflaştırılması için optimize edilir, ancak en fazla 96 proteinleri saflaştırmak için adapte edilebilir.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins at JoVE.com

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Bu sıvı işleme robot kullanılarak rekombinant protein benzerlik-etiketli saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, genel olarak, bir yüksek verimli biçimde çözünür His-etiketli proteinlerin küçük ölçekli arıtma için de geçerlidir.

Affinity etiketli Rekombinant Proteinler Yüksek throughput Arıtma

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

high-throughput-purification-of-affinity-tagged-recombinant-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Görüntüleme.  Imperial College London. Bu sıvı işleme robot kullanılarak rekombinant protein benzerlik-etiketli saflaştırılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, genel olarak, bir yüksek verimli biçimde çözünür His-etiketli proteinlerin küçük ölçekli arıtma için de geçerlidir.

Video: High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biyoloji

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Rekombinant Proteinlerin Metilotropik maya İfade Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Deniz Kestanesi Zigotlar Yüksek Randımanlı Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

Üretilen Rekombinant Disülfid zengin Venom Proteinler Uygulanan Yüksek Randımanlı Sayısal Anlatım Tarama ve Arıtma<em&gt; E. coli</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

Peptidler ve proteinler ile rekombinant Elastin gibi Polipeptitlerin ve Fusions olmayan kromatografik saflaştırma<em&gt; Escherichia coli</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Lusiferaz ifade eden rekombinant virüsler yüksek verimlilik Titrasyon

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...