Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir.

I. Tip III Efektör Maya İfade Sistemi Tasarımı Efektör ilgi tip III (ler) ifade etmek için uygun bir maya sistemi Kalibre önemli bir görevdir ve bazı deneme yanılma gerektirebilir. Böyle bir sistemin tasarlanması dikkate optimize edilmelidir büyük önem taşımaktadır faktörleri şunlardır: 1) organizatörü)) efektör (ler), 2, 3 efektör gen kopya sayısı ifade sürüş protein ekspresyonu doğrulamak için kullanılan epitopu etiketi ve 4) maya süzün. 1) Kuruluş Bakteri tip III etkileyiciler maya hücreleri için toksik olabileceğinden, bir uyarılabilir kolaylaştırıcı ifade kontrol etmek için kullanılmalıdır. GAL1 organizatörü genellikle bu amaç için kullanılır ve faaliyet büyüme ortamda karbon kaynağı tarafından düzenlenir: glikoz tarafından bastırılmış ve galaktoz tarafından indüklenir. Ancak, bu organizatörü, istenmeyen toksisite bastırma şartlar altında biraz sızdıran olarak rapor edildi. Benzer bir sorunla karşılaştı ise, aşağıda açıklandığı gibi efektör gen kopya sayısı en aza indirmek için, ya da böyle MET3 veya CUP1 rehberleri 1 gibi alternatif indüklenebilir rehberleri, kullanmak için tavsiye edilir. Burada bir galaktoz uyarılabilir kolaylaştırıcı efektör proteinleri ifade için prosedürler açıklanmaktadır. 2) Gen kopya sayısı Protein ekspresyon düzeyini etkileyen ek bir parametre efektör geni hücre bulunan kopya sayısıdır. Efektör geni tarafından yapıldığında yüksek ekspresyon düzeyleri elde edilir plazmid 2 mikron (hücre başına 40-60 adet). Orta ifade efektör gen homolog rekombinasyon maya genomu entegre düşük ifadesi elde edilir iken, sentromer içeren bir plazmid (hücre başına 1-3 kopya) kullanarak elde edilir. Sentromer içeren bir vektör ve GAL1 organizatörü birleştirerek bitki patojenleri Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria ve Pseudomonas syringae pv yaklaşık 50 etkileyiciler başarıyla dile getirdiler. Immunoblotting analizi ile saptanabilir seviyeleri ve bastırma koşulları altında ihmal edilebilir kaçak domates (Salomon ve Sessa , yayınlanmamış). 3) epitopu etiketi Ilgi efektör karşı antikorlar mevcut değilse, bir epitopu etiketi immunoblotting ifadesini izlemek için efektör protein birleşir. Yaygın olarak kullanılan etiketleri, Myc, hemaglutinin (HA) veya Bayrak güvenilir ticari antikorlar mevcuttur hangi. Efektör protein yapısı ve etkinliği istenmeyen zararlı etkilerini en aza indirmek için etiketi sadece bir kopyasını kullanmanızı öneririz. 4) Maya gerginlik Ifade etmek için kullanılan maya suşu için temel bir gereklilik ifade vektör seçilebilir marker auxotrophy. Farklı maya suşları belirli etkileyiciler ifade farklı duyarlılıklar gösterebilir dikkat etmek önemlidir. Örneğin, birkaç Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria effektör (Salomon ve Sessa, yayınlanmamış) BY4741 ve W303 suşları farklı duyarlılıklar olduğu görülmektedir. Bu nedenle, farklı maya suşları ilgi (ler) efektör test etmek için tercih edilir. II. Maya Medya hazırlanması Büyüme için büyüme ortamı olarak YPD (10 g / L, maya özü, 20 g / L pepton ve% 2 w / v] glukoz), herhangi bir vektör içermezler maya suşlarının. Katı ortamlar için, çözüm (katı besiyeri çok yumuşak ise, [v / v] 5 N NaOH stok solüsyonu otoklav önce orta 0.05%)% 2 [w / v] agar ekleyin. Biz son hacmi% 90 glikoz olmadan ortamı hazırlamak ve otoklav tavsiye ederiz. Kısa bir süre kullanımdan önce, bir filtre ile sterilize edilmiş% 20 w / v] glukoz solüsyonu (% 20 glukoz çözeltisi tutmak ° C bulaşmasını önlemek için 4) ile% 100 hacmi doldurun. Maya suşları (lösin, urasil, histidin ve triptofan) seçilebilir marker prototrophy bir vektör içeren bir büyüme için, lösin olmadan sentetik terk orta, amino asitler olmadan urasil, histidin ve triptofan (6,7 g / L maya azot baz 1.4 g / L, maya sentetik orta ek-bırak) ve% 2 [w / v] glikoz, ya da% 2 w / v] galaktoz ve% 1 w / v] raffinose içeren. Katı ortamlar için, çözüm için% 2 [w / v] agar ekleyin. Biz son hacmi% 90 orta hazırlama ve otoklav tavsiye ederiz. Kısa bir süre kullanımdan önce, istenen karbon kaynağı (% 20 glikoz ve% 20 tutmak bağlı bir filtre ile sterilize edilmiş% 20 glukoz çözeltisi, ya da bir filtre ile sterilize edilmiş% 20 galaktoz raffinose çözüm +% 10,% 100 hacmi doldurmak galaktoz +% 10 raffinose çözümleri 4 ° C) bulaşmasını önlemek için. Ifade vec seçilebilir marker bağlıtor kullanmadan önce (10, 1 g/100 ml lösin stok ml / L, 200 mg/100 ml urasil stoku 10 ml / L, 2 ml / L 1 g/100 gelen diğer amino asitler ya da urasil eklemek ml histidin hisse senedi ya da 2 ml / L) 1 g/100 ml triptofan stok. Lösin ve urasil stokları hazırlanırken, otoklav ile sterilize ve oda sıcaklığında tutun. Histidin ve triptofan stokları hazırlarken, onları filtreleyerek sterilize şişe ışıktan korumak için alüminyum folyo ile sarın ve 4 tutmak ° C Prosedürleri, aşağıda açıklanan lösin ile tamamlanan sentetik terk orta urasil, histidin ve triptofan, sentetik tam orta olarak belirlenmiş. Katı-medya plakalar 4 ° C&#39;de iki ay kadar saklanabilir. Kullanmadan önce 20 dakika oda sıcaklığında steril bir laminer akış kaputu plakaları kurulayın. III. Maya Dönüşüm <ol><li> Maya dönüştürme işlemine başlamadan önce, aşağıdaki üç çözümler hazırlamak:% 50 w / v] polietilen glikol (PEG) 3350 çözümü, 1 M LiAc pH = 8.0, ve TE solüsyonu (100 mM Tris, pH = 6.85 ve 10 mM EDTA pH = 8.0). Filtre çözümleri sterilize ve 4 ° C </li><li> Uzun bir tahta mili ya da steril bir aşılama döngüsü kullanarak, yeni bir plaka almak ve bir maya koloni (1-2 mm çapında) bir 15 ml&#39;lik polipropilen tüpe 3 ml YPD aşılamak. Vorteks kısaca. Rulo kültür tüpü yerleştirin ve sürekli rotasyon ile 30 ° C bir gece inkübe edin. </li><li> Sabah, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 g rulo ve santrifüj kültür çıkarın. Santrifüj süpernatantı sonra tamamen kaldırmak. </li><li> 1 ml tabanda tampon (% 10 v / v] TE solüsyonu,% 10 [v / v] 1 M LiAc çözüm) ve vorteks karışım hücreleri tekrar </li><li> Dönüştürülecek her plazmid ve ek kontrol dönüşüm için bir mikrotüp hücre süspansiyonu 100 ul aktarın. </li><li> Her bir tüp, tek iplikçik somon Sperm DNA (10 mg / ml) ve plazmid DNA dönüştürülebilir (kontrol tüpü hariç) 250-500 ng 5 ul ekleyin. </li><li> Dikkatle dönüşüm solüsyonu (% 10 v / v] TE solüsyonu,% 10 [v / v] 1 M LiAc çözüm% 80,% 50 [v / v] [w / v] PEG çözüm her tüp 650 ul eklemek ) ve vorteks. </li><li> Rulo 30 ° C de 30 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Çalkalayıcı tüpleri çıkarın eklemek 70 DMSO ul ve tersini tüpleri karışımı 10-15 kez (hücreleri kırılma önlemek için vorteks yok). </li><li> Tüpler 42 yerleştirin ° C önceden ısıtılmış su banyosu ve 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Tüpleri su banyosundan çıkarın ve hemen 2 dakika süreyle buz koyun. </li><li> Tüpler soğutulduktan sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 g santrifüj. </li><li> Mikrosantrifüj tüpleri çıkarın ve dikkatli bir pipet kullanarak viskoz süpernatant kaldırmak. </li><li> Her tüp steril çift distile su (DDW) 150 ul hücre pelletini tekrar ve bir karbon kaynağı olarak% 2 glukoz içeren bir sentetik levha ve hücre süspansiyonu yaymak plazmid sağlar amino asit veya nükleotid prototrophy. </li><li> Plakalar, 2 dakika süreyle açık bırakın ve onları bir laminer akış kaputu kurumasını bekleyin. Iki-üç gün süreyle 30 ° C inkübatör tabak koyun. </li><li> Once koloniler (1-2 mm çapında) tabak ortaya çıktı yaklaşık 10 tek koloniler, her bir dönüşüm almak ve taze bir plaka aktarabilirsiniz. Koloniler aktarırken, büyük bir miktarda maya hücreleri büyüme izin vermek için 2 cm x 2 cm yamaları olun. Bir kuluçka plakalar, iki gün boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Maya yamaları büyüdü, inkübatör plakaları kaldırmak ve onları mühür parafilm. Plakalar 4 ° C&#39;de saklanır. Her 10-14 günde bir, taze bir plaka koloniler aktarın. </li></ol> IV. Maya Protein hazırlama immüno Efektör İfade doğrula Özü <ol><li> Taze bir plaka, 3 ml, karbon kaynağı olarak% 2 glukoz ile desteklenen uygun sentetik tam orta içeren bir 15 ml polipropilen tüp ve maya koloni (1-2 mm çapında) bir amino asit veya hangi plazmid nükleotid olmadan seçin seçim prototrophy sağlar. Rulo kültür tüpü yerleştirin ve 30 ° C&#39;de bir gece inkübe </li><li> Ertesi gün, rulo kültür çıkartın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 g de santrifüj. Santrifüj tüpleri çıkarın ve süpernatantın atın. </li><li> 3 ml steril DDW ve vorteks karışım hücre pelletini tekrar. </li><li> 3 ml steril DDW supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri atıp tekrar santrifüjleyin. </li><li> Hücre süspansiyonu 200 ul 3 ml% 2 galaktoz ve karbon kaynağı olarak% 1 raffinose tamamlanan sentetik tam orta içeren yeni bir 15 ml tüp transferi ve amino asit veya hangi nükleotid olmadan tercih edilen plazmid prototrophy sağlar.Vorteks, bir rulo yer ve 30 gece inkübe ° C Karışımı </li><li> Ertesi sabah, bir mikrotüp için 1 ml (ya da düşük yoğunluklu kültürler için daha fazla) kültür transferi. 800 g oda sıcaklığında 5 dakika süreyle santrifüj hücreleri Hasat. </li><li> Burada, β-mercaptoethanol toksik buharlar solunum önlemek için davlumbaz çalışır. Süpernatant bir pipet kullanarak dikkatlice çıkarın ve buz parçalama çözüm (4% [v / v] 5 N NaOH,% 0.5 [v / v] β-mercaptoethanol) 100 ul hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Vorteks tarafından kuvvetlice karıştırın ve 30 dakika buz üzerinde kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> İnkübasyon sırasında, 100 ul lizis tamponu pH 9-10 titering için gerekli hacim HCl (6 N) belirler. Bu amaçla, her biri lizis tamponu bir raf ve transfer 100 ul 10 mikrotüpler. HCl (6 N) (1-10 ul) çeşitli hacimlerde her tüp ve vorteks karışım ekleyin. Bir örnek alın ve bir pH indikatör şeridi kullanarak çözüm pH kontrol edin. </li><li> Inkübasyon sonunda, vorteks tarafından lizat ve karıştırmak için (daha iyi doğruluk, lizat ucu takılmadan tüp yan HCl çözeltisi) önceki adımda belirlenen HCl hacmi ekleyin. </li><li> 3x örnek tampon 50 ul ekle (30% [v / v] gliserol,% 15 [v / v] β-mercaptoethanol,% 37.5 [v / v] 500 mM Tris-HCl, pH = 6.8,% 0,15 [w / v ] sodyum dodesil sülfat [SDS] ve Bromophenol Mavi vorteks (çözüm sarı dönerse, pH değeri çok düşük olduğu anlamına gelir ve bir kaç lizis çözüm mikrolitre çözüm kadar ilave edilmelidir lizat ve karıştırmak için birkaç tahıl) maviye döner). </li><li> Lizat çözüm, bir iğne ile mikrotüp kapak bir delik delinmesiyle sonra bir ısıtma bloğu 5 dakika kaynatın. </li><li> Isıtma bloğu mikrotüp çıkarın ve çözüm oda sıcaklığında 2 dakika soğumasını bekleyin. </li><li> 10 sn sonra Vortex lizat çözüm ve aşağı spin. 30 ul immunoblotting analizi için SDS-PAGE jel üzerine yerleştirin. </li></ol> V. Testi Spotting Efektör indüklenen Büyüme inhibisyonu fenotipleri Algılama <ol><li> 15 ml polipropilen tüp içinde faiz ve inokülasyon plazmid ifade taşıyan bir maya koloni (1-2 mm çapında), taze bir plaka almak, 3 ml% 2 karbon kaynağı olarak glukoz ile tamamlanan sentetik tam orta ve amino olmadan asit veya hangi nükleotid plazmid ifade prototrophy sağlar. Boş bir plazmid taşıyan bir kontrol maya suşu için aynı prosedürü tekrarlayın. Kültür tüpleri bir silindir koyun ve 30 ° C sabit dönüş geceleme kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Ertesi gün, rulo kültürlerin çıkartın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 g de santrifüj. Santrifüj tüpleri çıkarın ve süpernatantın atın. </li><li> 3 ml steril DDW ve vorteks karışım hücre pelletini tekrar. </li><li> 3 ml steril DDW santrifüj adım ve tekrar süspansiyon hücreleri tekrarlayın. </li><li> Optik yoğunluk (OD) belirlemek için, her kültürün 100 ul 900 ul DDW ve vorteks içeren bir mikrotüp aktarın. Tüplerin içerik plastik küvet içine dökün ve 600 nm dalga boyunda absorbans ölçümü (referans olarak 1 ml DDW dolu bir küvete). Küvete kültürlerin OD 600 10 seyreltme faktörü ile çarpılarak ilk kültürlerin OD 600 hesaplayın. </li><li> Sonra, ilk kültürlerin OD 600 dayalı bir OD 600 ile steril mikrotüpler = 1,0 hücre süspansiyonları (1 ml) hazırlamak. </li><li> 900 ul steril DDW dolu 3 steril mikrotüpler kullanarak, 10-üç kat seri dilüsyonları (OD 600 = 0.1, 0.01 ve 0.001) her hücre süspansiyonu (OD 600 = 1.0) bir önceki adımda hazırlanan hazırlar. </li><li> Seçim plazmid prototrophy sağlayan amino asit veya nükleotid olmadan sentetik tam orta içeren iki tabak hazırlayın. Orta,% 2,% 2 galaktoz ve% 1 raffinose ile diğer levha glikoz ve bir plaka ile takviye edilmelidir. 20 dakika oda sıcaklığında steril bir laminer akış kaputun içindeki plakalar Kuru ve bir ızgara üzerine koyun. </li><li> Her kültür için, hem de bastırma ve medya inducing üst üste dört dilüsyonları spot 10 ul. </li><li> Lekelenme sonra, birkaç dakika için başlık açık plakaları bırakın. Lekeler kuru, plakaları kapak ve 2-3 gün boyunca 30 ° C inkübatör koyun. </li><li> Inkübasyondan sonra, plakalar ve maya büyüme analiz. İlk olarak, hücre yoğunlukları bastırma orta içeren plaka üzerinde benzer olduğunu onaylayın. Sonra boş bir vektör indükleyici orta içeren plaka taşıyan kültürü ile ilgi efektör protein ifade kültür büyüme karşılaştırın. Not: etkileyiciler standart laboratuvar büyüme koşulları altında maya büyüme hız sınırlayıcı değildir hücresel süreçleri hedef alabilir.Gibi effektör büyüme inhibisyonu fenotiplerinin kimlik izin vermek için, medya inducing böylece etkileyiciler hassasiyeti artırarak, maya hücresel fonksiyonları değiştiren bileşikleri ile takviye edilebilir. Muhtemelen bu yordamı entegre edilebilen kimyasal maddelerin bir listesi için, Parsons ve ark bakın. (2004) 2. </li></ol> VI. Temsilcisi Sonuçlar Bir temsilci, maya, tahlil ve tip III etkileyiciler ifade kaynaklanan büyüme inhibisyonu fenotipleri tespit lekelenme Şekil. 1. Bu deneyde, tip III etkileyiciler AvrPto HopAA1-1 ve Fitopatojenik Gram-negatif bakteri Pseudomonas syringae pv. Domates (Pst), AvrE1 maya suşu BY4741 sentromer içeren plazmid pGML10 ifade edildi ve yeteneklerini test maya büyüme inhibe. Pst tip III etkileyiciler ifade galaktoz indüklenebilir GAL1 promotör kontrolü altında veya boş bir vektör içeren bireysel maya kültürleri seri seyreltilir ve bastırma (glikoz) ya da indükleyici (galaktoz) medya (Şekil 1) üzerine kaplama . Orta bastırma, AvrPto ve HopAA1-1 ifadesi için plazmid taşıyan maya suşları içeren boş bir vektör kontrol suşu olarak benzer bir büyüme sergiledi. Ancak aynı ortamda AvrE1 taşıyan maya muhtemelen GAL1 organizatörü kaçak belli bir dereceye kadar ve AvrE1 yüksek sitotoksik etkisi ile ilgili biraz azaltılmış büyüme görüntülenir. AvrE1 efektör ifade indükleyici koşullarında, herhangi bir seyreltme koloniler eksikliği yansıyan ciddi bir büyüme inhibisyonu fenotipe neden oldu. AvrPto herhangi bir etkisi yoktu Munkvold ve arkadaşları 3, aynı zamanda ciddi büyüme inhibisyonu sonuçlandı HopAA1-1 ifadesi, daha önce gözlemlediği. <img src="/files/ftp_upload/1865/1865fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Pseudomonas syringae pv. Domates ifade kaynaklanan Maya büyüme inhibisyonu (Pst) tip III etkileyiciler AvrE1 ve HopAA1-1. Plazmid pGML10 içeren Maya suşları (BY4741), AvrPto galaktoz-indüklenebilir ifade için boş veya taşıma GAL1 odaklı kaset ya HopAA1-1 veya AvrE1, karbon kaynağı olarak glukoz (% 2) ile takviye sentetik tam orta gecede büyüdü ve lösin eksik. Kültürler, yıkanmış = 1.0 ve 10 kat seri dilüsyonları sentetik tam katı lösin ve eksik içeren glikoz (% 2) medya ya da galaktoz (% 2) ve raffinose (% 1) damlatılan OD 600 normalize edildi. Fotoğraflar 30 büyüme 2 ve 3 gün ° C, glikoz ve galaktoz medya büyüyen maya sonra alınmıştır.

<ol>
	<li>Siggers, K. A., Lesser, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae:+a+versatile+model+system+for+the+identification+and+characterization+of+bacterial+virulence+proteins.">The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins.</a> Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).</li><li>Parsons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways.">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li><li>Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+the+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+type+III+secretion+system+effector+repertoire+reveals+several+effectors+that+are+deleterious+when+expressed+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).</li><li>Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+as+a+tool+to+study+bacterial+effectors.">Yeast as a tool to study bacterial effectors.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).</li><li>Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+genomic+yeast+screen+to+identify+pathogenic+bacterial+proteins.">A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins.</a> PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).</li><li>Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+role+of+the+CopN+protein+in+Chlamydia+pneumoniae+intracellular+growth.">The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth.</a> Nature. 456, 112-115 (2008).</li></ol>

Bu sunumda, tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae tip III bakteriyel efektör proteinleri ve efektör-kaynaklı büyüme inhibisyonu fenotipleri nasıl tanımlamak için ifade için heterolog bir sistem olarak nasıl kullanılacağı gösterilmektedir. Önemlisi, bu fenotipleri maya büyüme üzerindeki olumsuz etkisi etkileyiciler bastırıcılarının belirlemek için genetik ekranlarında kullanılan olabilir. Susturmalar doğrudan çalışılan efektör hedefleri veya efektör etkilenen hücresel sür...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>212750</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Peptone</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>211677</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5767</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>214010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S8045</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base w/o amino acids</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>291940</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast synthetic drop-out medium supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Y2001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-galactose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G0750</td>
<td>&gt;99%; &lt;0.1% glucose</td>
</tr>
<tr>
<td>D-raffinose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>R0250</td>
<td>&gt;98%</td>
</tr>
<tr>
<td>L-leucine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L8000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Uracil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>U0750</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-tryptophan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T0254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-histidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H6034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNA, single stranded, from salmon testes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D7656</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>D5879</td>
<td>Desiccate</td>
</tr>
<tr>
<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H1758</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4338</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lithium acetate (LiAc)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4958</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris (base)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J.T. Baker</td>
<td>4109-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>&beta;-mercaptoethanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M6250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G5516</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromophenol blue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B6131</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dodecyl sulfate sodium salt (SDS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>8.22050.1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge tubes (15 ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430052</td>
<td>Sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>67.742</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Inoculation loop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Z643009</td>
<td>Sterile</td>
</tr>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pH indicator strip, pH 6.5-10.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>1.09543.0001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

identification of growth inhibition phenotypes induced by expression of bacterial type iii effectors in yeast

Birçok Gram-negatif patojen bakteri, konakçı hücrelerin sitoplazmasında efektör proteinlerin paketi yerini değiştirmek için bir Tip III sekresyon sistemi kullanırlar. Hücre içinde, Tip III etkileyiciler bağışıklık yanıtlarını bastırmak ve patojen büyümesini teşvik ev sahipliği hücresel süreçleri yıkılmasını. Bugüne kadar çok sayıda bitki ve hayvan bakteriyel patojenler tip III etkileyiciler tespit edilmiştir, ama bunlardan sadece birkaçıdır iyi karakterize edilir. Bu effektör fonksiyonlarını anlamak verilen bir bakteri suşunun efektör repertuarında fonksiyonel fazlalık bir kombinasyonu tarafından çürütülmüş, virülans, muhtemelen bazı enfeksiyon aşamalarına özgü rolleri, ve genetik zorluklar artırmak için uygulamayın ince etkileri belirli patojenlere manipüle. Maya tip III etkileyiciler İfadesi<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Efektör proteinlerin fonksiyonel karakterizasyonu, bu sınırlamalar ve yardım engellemeyi izin verebilir. Tip III etkileyiciler sık ​​sık, maya ve diğer ökaryotlar arasında korunmuş hücresel süreçleri hedef için, maya ifade efektör fonksiyonları ve hedefleri aydınlatmak için yararlanılabilir büyüme inhibisyonu fenotipleri neden olabilir. Bakteriyel etkileyiciler fonksiyonel çalışmalar için maya kullanarak Ek avantajlar, genetik izlenebilirliği, onların Orfs büyük çoğunluğunun öngörülen işlevleri hakkında bilgi ve genom ve küçük ölçekli deneyler için çok sayıda araç ve kaynakların kullanılabilirliği içerir. Burada bakteriyel tip III efektör proteinleri ifade için bir maya sistemi tasarımı için kritik faktörler tartışacağız. Bu ilgi efektör gen (ler) ifade sürüş için uygun bir organizatörü, efektör gen kopya sayısı, epitopu etiketi protein ekspresyonu ve maya suşunun doğrulamak için kullanılır. Biz maya etkileyiciler ifade ikna etmek için ve immün ifade doğrulamak için prosedürler mevcut. Buna ek olarak, efektör-kaynaklı büyüme inhibisyonu fenotiplerinin belirlenmesi için agar plaklarına bir lekelenme tahlil açıklar. Bu protokolün herhangi bir patojen ve translokasyon mekanizması tarafından konak hücre içine teslim patojenite faktörleri çalışmaya uzatılabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast at JoVE.com

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Bu video, biz, maya ve efektör-kaynaklı büyüme inhibisyonu fenotiplerinin belirlenmesi bakteri tip III etkileyiciler ifadesi için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu tür fenotipleri sonradan efektör fonksiyonları ve hedefleri aydınlatmak için yararlanılabilir.

Büyüme inhibisyonu fenotipleri tanımlanması Mayalarda bakteriyel Tip III Efektör İfade İndüklenmiş

Many Gram-negative pathogenic bacteria use a type III secretion system to translocate a suite of effector proteins into the cytosol of host cells. Within ...

identification-growth-inhibition-phenotypes-induced-expression

Research

JoVE Journal

Biology

16.6K Görüntüleme.  Tel Aviv University. Bu video, biz, maya ve efektör-kaynaklı büyüme inhibisyonu fenotiplerinin belirlenmesi bakteri tip III etkileyiciler ifadesi için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu tür fenotipleri sonradan efektör fonksiyonları ve hedefleri aydınlatmak için yararlanılabilir.

Video: Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Bakteriyel Gen İfadesi Analizi Mikroarray&#39;ler Kullanımı

Biyoloji

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and easy to use expression system.
As a single-celled microorganism P. pastoris is easy to manipulate and grows rapidly on inexpensive media at high cell densities. Being a eukaryote, P. pastoris is able to perform many of the post-translational modifications performed by higher eukaryotic cells and the obtained recombinant proteins undergo protein folding, proteolytic processing, disulfide bond formation and glycosylation [1].
As a methylotrophic yeast P. pastoris is capable of metabolizing methanol as its sole carbon source. The strong promoter for alcohol oxidase, AOX1, is tightly regulated and induced by methanol and it is used for the expression of the gene of interest. Accordingly, the expression of the foreign protein can be induced by adding methanol to the growth medium [2; 3].
Another important advantage is the secretion of the recombinant protein into the growth medium, using a signal sequence to target the foreign protein to the secretory pathway of P. pastoris. With only low levels of endogenous protein secreted to the media by the yeast itself and no added proteins to the media, a heterologous protein builds the majority of the total protein in the medium and facilitates following protein purification steps [3; 4].
The vector used here (pPICZ&alpha;A) contains the AOX1 promoter for tightly regulated, methanol-induced expression of the gene of interest; the &alpha;-factor secretion signal for secretion of the recombinant protein, a Zeocin resistance gene for selection in both E. coli and Pichia and a C-terminal peptide containing the c-myc epitope and a polyhistidine (6xHis) tag for detection and purification of a recombinant protein. We also show western blot analysis of the recombinant protein using the specific Anti-myc-HRP antibody recognizing the c-myc epitope on the parent vector.

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

The protocol describes protein expression using the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The preparation of electrocompetent yeast cells, transformation of the vector with the gene of interest into P. pastoris and yeast DNA purification are also performed. Western blot analysis and protein purification build the last steps in this protein expression protocol.

Rekombinant Proteinlerin Metilotropik maya İfade Pichia pastoris</em

Protein expression in the microbial eukaryotic host Pichia pastoris offers the possibility to generate high amounts of recombinant protein in a fast and ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

RNAi Efektör Bakteriyel Teslim Tarihi: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's disease, and Huntington's disease 1. Huntington's disease (HD) is caused by the abnormal expansion of a polyglutamine (polyQ) region within the protein huntingtin. The polyQ-expanded huntingtin protein attains an aberrant conformation (i.e. it misfolds) and causes cellular toxicity 2. At least eight further neurodegenerative diseases are caused by polyQ-expansions, including the Spinocerebellar Ataxias and Kennedy&#x2019;s disease 3.
The model organism yeast has facilitated significant insights into the cellular and molecular basis of polyQ-toxicity, including the impact of intra- and inter-molecular factors of polyQ-toxicity, and the identification of cellular pathways that are impaired in cells expressing polyQ-expansion proteins 3-8. Importantly, many aspects of polyQ-toxicity that were found in yeast were reproduced in other experimental systems and to some extent in samples from HD patients, thus demonstrating the significance of the yeast model for the discovery of basic mechanisms underpinning polyQ-toxicity. 
A direct and relatively simple way to determine polyQ-toxicity in yeast is to measure growth defects of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. This manuscript describes three complementary experimental approaches to determine polyQ-toxicity in yeast by measuring the growth of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. The first two experimental approaches monitor yeast growth on plates, the third approach monitors the growth of liquid yeast cultures using the BioscreenC instrument. 
Furthermore, this manuscript describes experimental difficulties that can occur when handling yeast polyQ models and outlines strategies that will help to avoid or minimize these difficulties. The protocols described here can be used to identify and to characterize genetic pathways and small molecules that modulate polyQ-toxicity. Moreover, the described assays may serve as templates for accurate analyses of the toxicity caused by other disease-associated misfolded proteins in yeast models.

This manuscript describes three complementary protocols for assessing the toxicity of polyglutamine (polyQ)-expansion proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. These protocols can easily be modified to monitor the toxicity of other misfolded proteins in yeast.

Büyüme Tahliller Mayalarda poliglutamin toksisite değerlendirilmesi için

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial development will allow for more rigorous analysis of orofacial phenotypes upon abrogation with substances that can genetically or molecularly manipulate gene expression or protein function. Using two dimensional images of the embryonic heads, traditional size dimensions-such as orofacial width, height and area- are measured. In addition, a roundness measure of the embryonic mouth opening is used to describe the shape of the mouth. Geometric morphometrics of these two dimensional images is also performed to provide a more sophisticated view of changes in the shape of the orofacial region. Landmarks are assigned to specific points in the orofacial region and coordinates are created. A principle component analysis is used to reduce landmark coordinates to principle components that then discriminate the treatment groups. These results are displayed as a scatter plot in which individuals with similar orofacial shapes cluster together. It is also useful to perform a discriminant function analysis, which statistically compares the positions of the landmarks between two treatment groups. This analysis is displayed on a transformation grid where changes in landmark position are viewed as vectors. A grid is superimposed on these vectors so that a warping pattern is displayed to show where significant landmark positions have changed. Shape changes in the discriminant function analysis are based on a statistical measure, and therefore can be evaluated by a p-value. This analysis is simple and accessible, requiring only a stereoscope and freeware software, and thus will be a valuable research and teaching resource.

Quantification of Orofacial Phenotypes in Xenopus

A method to quantify the orofacial size and shape of Xenopus laevis embryos has been developed. In this protocol, traditional size measurements are combined with geometric morphometrics to allow for more sophisticated analyses of orofacial development and defects.

Orofasial fenotipleri Niceleme<em&gt; Xenopus</em

Xenopus has become an important tool for dissecting the mechanisms governing craniofacial development and defects. A method to quantify orofacial ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

Hücre içi Komşu maruz kalan hücreler, apoptotik hücre ölümü ile etkileşim yoluyla canlı hücreler İndüklenen sinyal olaylarının tanımlanması

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

Bakteriyel büyüme kesin, yüksek üretilen iş analizi

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&amp;#946; Signaling

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

Mezenkimal endotel geçiş büyüme faktörü β sinyal dönüşüm tarafından indüklenen moleküler Analizi

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...