Brian G. Coon ve Claudia B. Hanna yararlı tartışmalar ve destek için teşekkür ederiz. Bu proje, Dep start-up fonları tarafından desteklenen. Biyolojik Bilimler, Purdue Üniversitesi R. Claudio Aguilar ve R. Claudio Aguilar Purdue Kanser Merkezi aracılığıyla bir Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu.

A. Hücre Kültürü ve Protein İndüksiyon Bu bölümde, hücre kültürü, maya hücreleri bir ayarlanabilir organizatörü protein ifade indüksiyon takip koşulları, hücre döngüsü Nocodazole ile senkronizasyonu, açıklamaktadır. <ol><li> Yaban tip maya suşu W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) kontrolü altında ilgi bizim gen (ENTH2) içeren yüksek kopyasını (2μ) plazmid DNA ile dönüştürdü. metionin repressible organizatörü (MET25). Metionin 2mm metionin yoksun medya maksimum ifade sağlar promotor aktivitesi bastırmak için yeterli olacaktır. Bu nedenle, bir dizi metionin konsantrasyonları istenilen düzeyde protein ifade etmek için kullanılabilir. 1 W303 hücrelerinde plazmid DNA Dönüşüm standart prosedürlere göre LiAc-TE yöntemi kullanılarak yapılır. 2 Not: Bu deney, sadece arka plan düzeyde protein ekspresyonunu sağlamak için metionin 2mm varlığı gecede büyüyen hücreleri tarafından yapılmalıdır . Ertesi sabah, protein ekspresyonu metionin hemen sonra hücre döngüsü senkronizasyonu (yaklaşık 4 saat) yoksun medya hücreleri resuspending tarafından uyarılan olmalıdır. Ancak, tüm belirtilerin analizi için zaman ders verme ENTH2 bağımlı hücre bölünmesi fenotipi (genellikle protein indüksiyon 3 4-6h sonra) ENTH2 önemli bir konsantrasyon hücreleri inşa etti sonra tetiklenen olduğunu bulduk çok uzun fenotip (en azından 16h). Biz metionin 0.2mm varlığı gecede büyüyen hücrelerin morfolojik fenotip bastıran ama metionin yoksun medya transfer fenotip-indükleyici seviyeleri hızla artabilir kritik altı kütle protein konsantrasyonu sağlar bulduk. Bu zaman görece kısa bir süre içinde hücre bölünmesi kusurun ağır belirtileri ayrıntılı analizi izin verir . Biz bu nedenle, deneyci bir durumda ayrı ayrı fenotip indüksiyonu için alt eşik metionin konsantrasyonunu belirlemek öneririz. </li><li> Seçici medya metionin 0.2mm standart, steril teknikleri kullanılarak steril bir erlene 50 ml son dönüştürülmüş hücreleri ve inokülasyon içeren bir tabak altı koloniler seçin. 30 gece boyunca inkübe ° 200 rpm&#39;de sallayarak ile C (standart maya kültürü koşulları hakkında daha fazla bilgi için, bkz. Ref 4) </li><li> 600Nm kültürün optik yoğunluk ölçerek Ertesi sabah, hücre yoğunluğu tahmin. Oda sıcaklığında 5 dk 2200 rpm&#39;de dönüyor hücrelerin 20 OD 600Nm eşdeğer steril bir santrifüj tüpüne ve hasat içine aktarın. </li><li> 0,4 OD 600Nm / ml &#39;lik bir konsantrasyon içinde süspanse edin hücreleri YPD ve DMSO 1mg/ml, bir hisse senedi, 15μg/ml son bir konsantrasyon Nocodazole eklemek. 200rpm az titreme ile 30 ° C&#39;de 4 saat inkübe edin. Not: alfa-faktörü kullanarak G0 aşamasında ya da hidroksiüre kullanarak G1-S aşamasında tutuklama dahil olmak üzere alternatif tutuklama yöntemleri kullanılabilir. Mitoz tutuklanmaktan Nocodazole kullanarak amaçları için yeterince basit ve etkili olduğunu buldular. </li><li> 4 saat sonra, eşit büyüklükte tomurcukları olan hücreleri mikroskop altında inceleyen sayısını sayma mitoz tutuklandı hücre yüzdesi kontrol edin. Tutuklama% 90 daha fazla ise, sonraki adıma geçin. Mitotik tutuklanması istenen yüzdesi elde edilene kadar Aksi takdirde, Nocodazole hücreler korumak. </li><li> Hasat hücreler santrifüj 2200 5min rpm ve buz gibi su ile üç defa yıkamak. En son yıkama aşamasından sonra, seçici besiyerleri ~ 0.5 OD 600Nm / ml bir hücre yoğunluğu metionin eksik pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Yarım hücre hacmi yeni bir steril tüpe aktarın ve nihai bir 0.2mm konsantrasyonu metionin eklemek. Bu etkileri için protein ekspresyonu bazal düzeylere nedeniyle kontrol olarak görev yapacak. Bu, (zaman = 0h) deney noktası ilk işaretler. 6h hücreleri her saat başı analiz edin. </li></ol> Fenotip Geliştirme B. Analizi Not: Aşağıda açıklanan tüm analiz yöntemleri aynı anda yapılması gerekmez . Batı Blot protein ekspresyon düzeylerinin belirlenmesi <ol><li> Her zaman noktada, 2200 rpm&#39;de 5 dakika santrifüj kültür ve hasat 2 OD 600Nm hücrelerin benzerleri OD 600Nm ölçer. </li><li> 1ml steril su pelletini tekrar süspansiyon 1.5ml Eppendorf tüp transferi. Bir pelet almak için santrifüj tekrarlayın. Süpernatant aspire. </li><li> 50μl SDS-PAGE Laemmli örnek tamponu (50mm Tris, pH 6.8,% 2 SDS,% 10 gliserol,% 2 oranında β-mercaptoethanol ve% 0.006 Bromophenol Mavi) pelletini tekrar. Asitle yıkanmış cam boncuklar (0.2-0.4 mikron çaplı) ve 1 dakika için vorteks 50μl ekleyin. </li><li> 95 ° C ısıya blo kaynatın tüplerck, 2 dakika 30 saniye boyunca tekrar vortex ve 5 dakika kaynatmaya devam edin. -20 ° C&#39;de protein örnek Freeze </li><li> Nitroselüloz membran üzerine% 12 SDS-PAGE jel, transfer protein örneklerinin çalıştırın ve Batı ilgi protein tespit etmek için uygun antikorlar ile blot gerçekleştirmek. Bu örnekte, 1:2000 dilüsyon (1XPBS,% 5 yağsız süt kuru dut-Tween fare anti-HA antikor (Covance, Princeton, NJ) ile inkübe ENTH etki alanları etiketli hemaglutinin (HA) varlığı prob ,% 0.1 Tween). HRP, dut-Tween, keçi 1:2500 titrede anti-fare sekonder antikoru (Pierce) etiketli oda sıcaklığında 1s membran üzerindeki birincil antikor bağlamak için izin verilir. Supersignal Batı Pico Chemiluminescent Yüzey HRP etiketli anti-fare antikor tespit etmek için kullanılır. </li><li> Dansitometrisi protein ekspresyon düzeyleri sayısal olmalıdır. </li></ol> Bu bölümde iki yöntem anlatılmaktadır artan protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak izleme fenotipi geliştirme. İlk yöntem hücre nüfus tabanlı bir tek hücre düzeyinde ikinci çalışmalar. Kantitasyonu, hücre bölünmesi fenotip ve hücre ölümü <ol><li> Her zaman noktada, 5 dakika 2200 rpm&#39;de santrifüj yoluyla, steril teknikleri ve hasat hücreleri kullanarak steril Eppendorf tüpüne 1 ml hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Süpernatantı aspire ve mavi 30μl Metilen steril su 1mg/ml bir stok takip 70μl medya pelet, tekrar süspansiyon haline getirin. Metilen mavisi, dolayısıyla ölü hücreler, mavi renk tarafından tespit edilebilir sitoplazmada indirgeyici bir ortamda renksiz olur, mavi bir hayati boya. </li><li> Pipet ~ 6μl temiz bir cam slayt bu süspansiyon ve açılan üzerinde lamel yerleştirin. Ince bir cam arayüzler arasındaki hücreler, düzgün bir tabaka oluşturur lamel yavaşça basınız. </li><li> 9 parçaya bölünür lamel Böl ve Şekil gösterilen kadran başına 3 fotoğraf çekmek. 2. Hücre / alan sayısı doğru kantifikasyon izin vermek için 30 hücre daha büyük olmalıdır. Hava kabarcıkları hazırlık zarar Her lamel önce yaklaşık 15 dakika boyunca görüntülenebilir. </li><li> Altında çalışma fenotip gösteren hücrelerin sayısını. ENTH2 aşırı ekspresyonu üzerine indüklenen hücre bölünmesi kusur, hücre ölümüne yol açan ve bu yüzden, biz de kendi mavi renk tarafından belirlenen ölü hücrelerin sayısını saymak. </li><li> Fenotipik hücrelerinin yüzdesini hesaplayın. </li><li> Şekil gösterildiği gibi veri çizilir. 3. </li></ol> Fenotipe özgü kusurları floresan mikroskopi kullanılarak görselleştirilmesi Hücre bölünmesi arızalı hücreleri, ENTH2 aşırı ekspresyonu üzerine görüldüğü gibi, genellikle hücre duvarı defektleri ve septin mislocalization3 (GFP füzyon proteinleri olarak görüntülenebilmekte) ile karakterizedir. Maya hücre duvarı maya hücre duvarlarında kitin geri dönüşümsüz olarak bağlar Calcofluor Beyaz (CFW) ile boyanarak kolayca görüntülenebilmekte. <ol><li> Oda sıcaklığında 5 dakika 2200 rpm&#39;de santrifüj steril Eppendorf tüp ve hasat hücreleri kültür her zaman noktası, kısım 1 ml az. </li><li> Karanlıkta, oda sıcaklığında 5 dakika süreyle steril su ve inkübe 1mg/ml CFW çözüm 100μl hücre pelletini tekrar. </li><li> Santrifüj ve 1X PBS ile 3 kez yıkama Hasat hücreleri. </li><li> 100X büyütme 100μl 1X PBS pelet ve UV optik kullanarak mikroskop altında resim (hücre duvarı) ve FITC filtresi (GFP-septin) tekrar </li><li> B.2.1 bölümünde aşağıdaki adımları 4-6 hücre duvarı defekti ve septin mislocalization hücre yüzdesi niceliğini </li></ol> B.3. Tek hücre düzeyinde fenotip gelişimi Belirlenmesi: Time-lapse video mikroskopi. <ol><li> Bir bardak slayt içbükey bir depresyon ile% 70 alkol ile temizleyin ve kurumaya bırakın. </li><li> Agaroz tamamen eriyene kadar mikrodalgada steril bir cam tüp içinde metionin eksik 5ml seçici medya 0.06g agaroz kaynatın. </li><li> Agaroz hızla pipet 200μl slayt depresyon medya içeren ve altında hiç hava kabarcığı kalmamasına dikkat, temiz bir cam üzerine başka bir slayt ters. </li><li> Jel katılaşır, yüzeyleri her zaman paralel tutarak, en sorunsuz uzak depresyon slayt slayt taşımak. Bu agaroz yatak yüzeyi depresyon slayt yüzeyi ile aynı hizada olmasını sağlar. Agaroz yatak çevresindeki hassas bir doku ile slayt bölgeyi temizleyin. Slayt artık kullanıma hazırdır. </li><li> Zamanda = 4 saat, oda sıcaklığında 5 dakika 2200 rpm&#39;de santrifüj steril Eppendorf tüp ve hasat kültür hücreleri transferi 1ml. Not: Bu daha sonraki bir zaman noktası, bu yüzden bu fenotip gelişimi garanti protein ekspresyonu yüksek düzeyde sağlamak için seçilecek tavsiye edilir . Pilot deneyler determin için gereklicase-by-case bazında e indüksiyon kez. </li><li> Metionin yoksun taze seçici medya 100μl supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri aspire edin. </li><li> Lamel kenarlarına vazelin uygulayın. Daha sonra agaroz yatak merkezinde hücre süspansiyonu bir damla koyun ve hafifçe üzerlerine lamel basarak eşit yaymak. </li><li> Vazelin ile lamel kenarlarında Seal ve oje ile kenarlarını kaplayan konumunu düzeltmek. Oje kuruyana kadar bekleyin. </li><li> Isıtılmış bir sahnede, mikroskop, slayt yerleştirin ve yeterince aralıklı en fazla 10 hücre içeren bir alan seçin. Hücre bölünmeleri, alan, zaman içinde kalabalık alacak. </li><li> Alanında ~ 5 saat boyunca her 5 dakikada bir görüntü çekin. Fenotip ilerlemesi ImageJ yazılımı (kullanarak bir film görüntüleri montaj tarafından incelenecektir <a name="cite">Rasband, WS, ImageJ Sağlık, Bethesda, Maryland, ABD, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri -2005</a> ) </li></ol> Not: Biz Zeiss Axiovert 200M mikroskop kullanımı, Zeiss Axiocam MRM monokrom dijital kamera ve Carl Zeiss Axiovision görüntü elde etme canlı hücre görüntüleme yazılımı (sürüm 4.4). Sıcaklık kontrolü Pecon Tempcontrol cihaz tarafından 37, 30 ° C&#39;de muhafaza ısıtılmış bir sahnede slaytlar koyarak elde edilir . Önlemek için tekrar tekrar odaklanmak yeniden ayarlayarak, otomatik olarak, her zaman noktada birkaç z yığın görüntüleri kazanmak ve daha sonra film montaj, en iyi odak görüntü seçebilirsiniz görüntü elde etme yazılım programına uygundur. Bazı görüntü elde etme yazılımlar zaman ders deneyler için otofokus seçeneği var. Bu, ne zaman kullanılabilir bu seçeneği kullanmak için uygundur. Vahşi tip maya hücreleri 30 en iyi büyümeye ° C dolayısıyla sıcaklık kontrolü kritik öneme sahiptir. Yeterli ısı sağlamak amacıyla, ısıtmalı aşamaya ek olarak harici bir ısı kaynağı sağlamak için yardımcı olur. Örneğin, görüntüleme süresi boyunca iletilen beyaz ışık mikroskop bırakın. Ayrıca agaroz yatak ve hücre sandviç hazırlarken hava kabarcıklarını önlemek için kritik öneme sahiptir. Hava kabarcıkları arasına sıkışan zamanla ısıtıldığında genişler ve görüntülü alanında uzak hücreleri itmek eğilimindedir. Alanı içinde bireysel hücre pozisyonları sağlamak için de önemlidir, özellikle yeniden odaklama girişimleri sırasında, görüntüleme işlemi süresi boyunca kayda değer değişikliği yoktur . Görüntü sabitleme eklentileri film monte edildikten sonra ImageJ hücre konumundaki küçük değişiklikler düzeltmek için mevcuttur. ( <a href="http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html">http://www.cs.cmu.edu/ ~ Kangli / kod / Image_Stabilizer.html</a> ).

<ol>
	<li>R&#246;nicke, V., Graulich, W., Mumberg, D., M&#252;ller, R., Funk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+conditional+promoters+for+expression+of+heterologous+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Use of conditional promoters for expression of heterologous proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 283, 313-322 (1997).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High efficiency transformation with lithium acetate in Molecular Genetics of Yeast: A Practical Approach. , 121-134 (1994).</li><li>Mukherjee, D., Coon, B. G., Edwards, D. F., Hanna, C. B., Longhi, S. A., McCaffery, J. M., Wendland, B., Retegui, L. A., Bi, E., Aguilar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+endocytic+protein+Epsin+2+functions+in+a+cell-division+signaling+pathway.">The yeast endocytic protein Epsin 2 functions in a cell-division signaling pathway.</a> J Cell Sci. 122, 2453-2463 (2009).</li><li>Sherman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Getting started with yeast in Guide to Yeats genetics and Molecular Biology. , 3-21 (1991).</li></ol>

Bu protokol, protein aşırı ekspresyonu üzerine morfolojik bir fenotip (uygun hücre bölünmesi geçmesi mümkün maya hücresi) gelişimini izlemek anlatılmaktadır. Bu işlemi yaparken, daha hızlı ve belirsiz sonuçlar hücreleri zarar verebilir olarak tavsiye santrifüj hızda peletleme maya hücreleri hasat hatırlamak önemlidir. Metilen mavisi ve Calcofluor beyaz toksik olarak hemen önce görüntüleme hücreleri yaşamak için ilave edilmelidir. Bu işlem aynı zamanda kolayca hedef kontrollü bir organiz...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Nocodazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>M1404</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methylene Blue 1% (w/v)</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW6276-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcofluor White</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO)</td>
<td>F3543</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Petroleum Jelly</td>
<td>Reagent</td>
<td>VWR International</td>
<td>VW3339-2</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

analysis of the development of a morphological phenotype as a function of protein concentration in budding yeast

Gen silme ve protein aşırı ekspresyonu proteinlerin işlevleri çalışmak için sık kullanılan yöntemlerdir. Bu makalede, bir nüfus protein konsantrasyonu fonksiyonu ve tek hücreli düzeylerde fenotip gelişimi analiz için bir protokol<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Bu protokol bir proteinin aşırı ekspresyonu dayalı olmasına rağmen, protein ekspresyonu baskılanması bağlı morfolojik fenotipleri için kolayca adapte olabilir. Bizim laboratuvar endositik adaptör protein epsin sinyal özelliklerini inceleyerek ilgileniyor. Bu amaç için korunmuş fazla dile getirdiği baskın bir olumsuz yaklaşım kullanıldı<u&gt; E</u&gt; Psin<u&gt; N</u&gt; -<u&gt; T</u&gt; Erminal<u&gt; H</u&gt; Omology (ENTH) etki alanı endojen epsin-2 (Ent2 veya YLR206W) fonksiyonları ile müdahale edebilmek için. Biz iskele proteinler, septins bir ailenin mislocalization bağımlı bir hücre bölünmesi kusur yol açan vahşi tip hücrelerde Ent2 (ENTH2) ENTH etki bu aşırı ekspresyonu gözlemledi.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast at JoVE.com

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gen silme ve protein aşırı ekspresyonu proteinlerin işlevleri çalışmak için sık kullanılan yöntemlerdir. Bu makalede, bir nüfus protein konsantrasyonu fonksiyonu ve tek hücreli düzeylerde fenotip gelişimi analiz için bir protokol<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;.

Geliştirici Maya Protein Konsantrasyonu bir işlev olarak Morfolojik Fenotip Kalkınma Analizi

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

analysis-development-morphological-phenotype-as-function-protein

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Görüntüleme.  Purdue University. Gen silme ve protein aşırı ekspresyonu proteinlerin işlevleri çalışmak için sık kullanılan yöntemlerdir. Bu makalede, bir nüfus protein konsantrasyonu fonksiyonu ve tek hücreli düzeylerde fenotip gelişimi analiz için bir protokol Saccharomyces cerevisiae.

Video: Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Use of Rotorod as a Method for the Qualitative Analysis of Walking in Rat

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a rotorod, animals remain in approximately the same place making repetitive movements of stepping. Thus the task provides a rich source of information on the details of foot stepping movements. Subjects were hemi-Parkinson analogue rats, produced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the right nigrostriatal bundle to deplete nigrostriatal dopamine (DA). The present report provides a video analysis illustration of animals previously were filmed from frontal, lateral, and posterior views as they walked (15). Rating scales and frame-by-frame replay of the video records of stepping behavior indicated that the hemi-Parkinson rats were chronically impaired in posture and limb use contralateral to the DA-depletion. The contralateral limbs participated less in initiating and sustaining propulsion than the ipsilateral limbs. These deficits secondary to unilateral DA-depletion show that the rotorod provides a use task for the analysis of stepping movements.

The rotorod test is used to assess motor status in the walking movement of hemi-Parkinson analogue rats.

Rotorod Rat Yürüyüş Kalitatif Analiz için bir yöntem olarak kullanımı

High speed videoanalysis of the details of movement can provide a source of information about qualitative aspects of walking movements. When walking on a ...

Biyoloji

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

Fonksiyon Çalışma, Etkileşimler, ve Post-translasyonel değişiklikler için tomurcuklanan Maya Protein Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...