Bu çalışma, Wellcome Trust, Tıbbi Araştırma Konseyi, Royal Society, Birmingham Science City ve Kısırlık Araştırma Güven tarafından finanse edilmektedir. Biz görüntüleme kulesi inşa ve entegre Cairn Araştırma uzman yardımı kabul etmek istiyorum.

Normal bir semen analizi ile sağlıklı fertil erkeklerde, sperm, normalde aşağıdaki gibi görüntüleme için hazırlanmıştır. <ol><li> Meni örnekleri, en fazla 30 dakika süreyle 37 ° C&#39;de saklanır. 1.8 CaCl 2 .2 H 2 O, 5.37 KCl, 0.81 MgSO 4 .7 H 2 O, 26.2 NaHCO 3, 1.0 NaH 2 PO 4: mM; Hücreler takviye Earle en dengeli tuz çözüm (sEBSS içine kadar yüzmeye seminal plazma izole edilir. 2H 2 O, 116.4 NaCl, 55.6 D-glukoz, 2.73, Na piruvat, Na laktat 41.8)% 0.3 kömür de-lipidated/fatty asitsiz Kesir V BSA (BSA kalite sperm başarılı kapasitasyonunu için çok önemli) ile desteklenmiştir. SEBBS, 1 ml, 5 ml tüpler bir dizi her pipetlenir ve 0.3 ml meni ile hafifçe underlayered. Inkübasyondan sonra 0.7 ml hafifçe her tüp çıkarılır ve toplanmış; 1 saat (% 6 CO 2 37 ° C) Sperm süspansiyonu 10 ul hücreleri hareketsiz için formalin% 1 (v / v) 90 ul ile seyreltilmiş, daha sonra sperm Neubauer odasında sayılır. Süspansiyon hücre yoğunluğu, daha sonra 6 milyon hücre / ml (sEBSS) ayarlanır. </li><li> 5-6 saat süreyle kapasitasyonunu izin örnek sonra gevşek kapaklı tüpler ve inkübe (% 6 CO 2 37 ° C) 200 ul hacimde ayrılmıştır </li><li> Lameller (22x50 mm) daha önce bir poli-D-lizin ile tedavi edilmiştir. Poli-D-lizin solüsyonu (% 10 w / v) 10 ul damla lamel merkezinde küçük bir sayı olarak uygulanır. Poli-D-lizin sonra kurumaya izin verilir. Bu ısıtmalı bir sahne olabilir ve kuruluk tamamlamak olmalıdır. Warner RC20 odasına benzer bir poli-D-lizin-lamel vakum gres kapalı bir amaca yönelik olarak inşa edilen, perfusable, polikarbonat görüntüleme odası (≈ 180 ul kapasitesi boyutları 35 mm x 20 mm x 5 mm) ile bağlı olduğu kaplı lamel hücreleri ters bir mikroskopta incelendi ve 12 mm çaplı dairesel lamel odasının üst yüzey şekilleri, ışık iletimine izin veren bir odasının taban oluşturur. </li><li> Oregon Yeşil BAPTA1-AM (ÖGB) veya Kalsiyum Yeşil 1-AM etiketleme hücreleri için kullanılır. ÖGB DMSO çözme tarafından hazırlanmıştır. Pluronic asit F127 (deterjan), boya &#39;topaklanma&#39; önlemek için DMSO yer almaktadır. Bu laboratuar (0.5 ml DMSO 100 mg Pluronic) hazırlanabilir, kullanımdan hemen önce, ya da önceden hazırlanmış olarak satın alınabilir. 20 ul ÖGB (2,5 mg / ml) 50 mg kısım eklenir. Flakon sonra dondurulmuş ve çözülmüş daha sonra kullanılmak üzere saklanabilir. </li><li> Sperm kapasitasyonunu sonra (sEBBS 5-6 saat, 37 ° C,% 6 CO 2) bir tüp, görüntüleme ve 1.2 ul ÖGB çözüm için seçilen 10 mcM bir final konsantrasyon vererek eklenir . Bu tüp daha sonra, hücre süspansiyonu hafifçe P1000 (mavi) pipet ile görüntüleme odasının giriş portu içine enjekte edilir, sonra bir 40 dakika daha inkübe edilir. Odası, 20 dakika boyunca, aşağı inkübatör, poli-D-lizin kaplı lamel tarafına yerleştirilir. Hücreler odasının yüzeyler boyunca yüzmeye eğilimindedir ve poli-D-lizin kaplı alana uyacaktır. </li><li> Odasına perfüzyon alete bağlanmış ve yaklaşık 0.5 ml / dak perfüze, mikroskop üzerine monte edilmiştir. Bir roller pompa çıkış bağlantı noktası ve taşma haznesi içine tuzlu su kapanı ile bir emme pompası tarafından kaldırılır beslenir. Gevşek hücreler ve ekstrasellüler boya odasının perfüzyon tarafından kaldırılır ederken hazırlanması, en az 10 dakika süreyle karanlıkta bırakılmıştır. Sıcaklık kararlılığı küçük dalgalanmalar sadece hücre Ca 2 + homeostazı etkilemez, çünkü en önemlisi önemli, ama aynı zamanda boya K d etkileyebilir. Deneyler, normalde 25 ° C, bu düzeyde karanlık oda sıcaklığını muhafaza ederek elde etti. Biz istenilen düzeyde oda sıcaklığında muhafaza, ısı kontrollü bir sahne ya da tuzlu su girişi bir termostatik kontrollü ısıtıcı kullanarak daha fazla sıcaklık ve odak istikrar sağladığı bulduk. </li><li> Hücreler faz kontrast (40x veya 60x oil-immersion) objektif ve görüntüleme için bir alan seçilir altında incelendi. Tuzlu su akışı laminer ve tutarlı olduğu, giriş limanı yakınlarında poli-D-lizin kaplı alanın bölümünü tercih edilir. Hücre yoğunluğu uygun bir alanda kullanmak da önemlidir (aşırı yoğunluk komşu hücrelerden sinyal alma yoluyla verilerin kalitesini ve bütünlüğünü etkiler) ve hücreler yeterince bağlı ama flagellar faaliyet ayırt. Bir faz kontrast görüntü kaydedilir. Net bir floresan (genellikle 50-200 ms) elde etmek için gerekli olan minimum süre azalır ve pozlama mikroskop sonra floresan modunda (emisyon 540 nm eksitasyon 480 nm) açılır. </li><li> Deney zaman serisi görüntü elde etme yazılımı (IQ) aktive ederek başladı. Tipik olarak 0.1 Hz görüntü elde edilir ve aydınlatma sadece bir softwa kullanarak görüntü elde etme dönemleri ile sınırlıyeniden kontrollü enstantane. Çok daha fazla görüntü elde etme oranları kullanılabilir ancak ödenek beyazlatma sorunları ve hücreleri (tartışma) fotoğraf hasar nedeniyle eserler nesil için yapılmış olmalıdır. IQ (ve diğer birçok kazanım yazılım platformları), deney sırasında gerçek zamanlı grafik floresan sağlayacaktır. </li><li> 3-5 dakika süresi tuzlu bileşenlerinin manipülasyon (örneğin, [Ca 2 +] o) ve ilaç uygulama kontrol döneminden sonra perfüzyon başlığında tuzlu değiştirilmesi ile elde edilir. Görüntüleme odasında varış o zaman yavaş yanıtlar (0.1 Hz de örneklenmiş) Burada anlatılan değerlendirilmesi için yeterli hassasiyeti sağlayan hesaplanır, böylece her uyarının yanı sıra zamanı olduğunu kaydetti. Daha hızlı tepki için daha doğru Warner RC20 odasında ikinci bir giriş bağlantı noktası üzerinden doğrudan tuzlu su akışı uyaranlara ekleyerek elde edilebilir. </li><li> Görüntüler IQ kullanarak çevrimdışı analiz edilmektedir. (Faiz (ROI) Bölgeler her bir hücrenin (veya hücre parçası) yuvarlak çizilir ve aynı zamanda bir hücre boş alan yazılım tarafından seçilir (otomatik arka plan çıkarma için resim serisi, akrozom reaksiyon öldü ya da uygulandı hücreleri çıkarmak için kontrol edilir sırasında sitoplazmik boya kaybı) floresan deney ve zaman serisi olarak analiz edildiğinde eserler neden yeterli hareket gösteren bu büyük ve hızlı artış gibi görünür. </li><li> Bir zaman floresan serisi sonra her bir yatırım getirisi için elde edilir ve bu verileri Excel çevrimdışı analiz edilir. Başlangıçta floresan denklemi kullanarak, kontrol döneminde elde edilen ortalama değeri ile normalize R = [(FF rest) / F geri kalanı] x% 100, R kontrol dönemine göre% değişim floresan nerede, F Floresans şiddeti bir zaman t ve F geri kalanı, kontrol döneminde elde edilen F en az 30 tayin ortalamasıdır. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1, 3 mcM progesteron hücreleri uyarılır edildiği bir deney görüntüleri bir dizi gösterir. Gri-ölçekli üst satır ve film 1 floresan görüntüleri göstermek ve cool &#39;renkleri floresan yoğunluğu düşük gösterir ve aynı mageler&#39;, (Resim J tablo &#39;16_colors arama) &#39;Pseudocolor de (2 film) aşağıda gösterilmiştir. &#39;sıcak&#39; renkleri floresan yoğunluğu yüksek göstermektedir. Hücreler, deney sırasında IQ arama tabloları kullanarak Pseudocolor olarak izlenebilir, ama genellikle gri skala kullanarak değerlendirmek için daha bilgilendirici hücreleri iyi etiketli olup olmadığını olabilir. 0 s ve 100 s kayıt başlamadan sonra ilk iki görüntüler toplandı. Floresans istikrarlı ve sonrası acrosomal alan ve sperm boynu güçlü olması eğilimindedir. Progesteron yaklaşık 175 s görüntüleme odasına girdi ve 3. ve 4. görüntüleri (180 ve 220) [+ Ca 2] i (floresan), arka baş ve hücre boyun bölgesi menşeli hızlı bir artış göstermektedir . Daha sonraki görüntülerin ilk çürüme gösteren 290, 360, 740, 990 ve 1440 s, [Ca 2 +], geçici ve ikincil bir sürdürülebilir yükselme gelişme. Şekil 2 normalize floresan her ROI (floresan kontrol dönemine göre% değişim) için ham floresan değerlerini dönüştürürken, bir elektronik tablo analizi gösterir Şekil 3 3 3 mcM progesteron &#39;tipik&#39; tepkiler gösteren hücreler için zaman normalize floresan araziler gösterir. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Örnek bir hücre veri progesteron ile uyarılır. Gri tonlama (üst sıra) ve (alt sıra) Pseudocolor floresan görüntüleri bir dizi gösterilmiştir. Zaman puan 0, 180, 220, 290, 360 ve 990s. 3 mcM progesteron 175 görüntüleme odasına girdi s ROI&#39;ler ilk panelinde gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2, Excel tek bir hücre floresan veri analizi . Rakamlar siyah renkte floresan veri zaman serisi, dikey olarak düzenlenir. Rakamlar kırmızı (aşağıda), metin içinde verilen eşitlik kullanılarak elde edilen normalize edilmiş verilerdir. Grafik stimülasyon üzerine küçük salınım yavaş bir artış ve dizi floresan geçici bir artış gösterir, bu deneyde hücre 64 normalize floresan zamanlı arsa gösterir. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Floresan zamanlı 3 ayrı hücreler için izleri, saygı değer kontrol etmek için% değişim olarak ifade ... 3 mcM progesteron okla işaretli zamanda eklendi. Kesikli çizgi gösterir kontrolü floresan anlamına gelir.

<ol>
	<li>Haughland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , (2002).</li><li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging.">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li></ol>

Insan spermi spontan ve uyarılmış Ca 2 + sinyalleri dağıtım ve kinetiği kayıt başarıyla yürütülen bu tekniği sağlar. Yanıtları, insan sperm spontan ve uyarılmış Ca 2 + sinyalleri bir çok varyasyon gösterebilir önemlidir hücrelerinin çok sayıda (200) elde edilebilir . Başarılı etiketleme ve kayıt sırasında hücrelerin yaşam örnek kalitesi üzerinde son derece bağımlıdır. Kötü örnekleri kötü etiketleme, kötü tepkiler ve hücreleri kayıt sırasında ölebilir verir. İnsan sperm foto-hasarı çok hassastır ve bu nedenle hücre sağkalım en üst düzeye çıkarmak ve hücre ölümü nedeniyle eserler en aza indirmek için gerekli minimum aydınlatma (şiddeti ve maruz kalma süresi) kullanın. Yüksek hassasiyetli kamera (düşük yoğunluklu aydınlatma kullanılmasına izin), kamera zayıf floresan pick up beri büyük bir fayda. Back-aydınlatmalı, EM-CCD kameralar çok pahalı olsa da, özellikle çok uygundur. LED aydınlatma (eksitasyon filtresi ile Xenon veya cıva lambası kullanarak yerine hücre sağkalım (Nishigaki ve ark, 2006) geliştirir. Biz, her oranı için iki görüntü almak için gerekli olduğundan Fura UV ışığı ile uyarma gerektirir çünkü oran-metrik görüntüleme belirgin avantajları rağmen, Fura-2 kullanımı yok. Elde edilen veriler tek bir dalga boyu, görünür ışık boyalar, floresan normalleştirilmesi, hücreler arasındaki boya yükleme fark büyük ölçüde telafi, ama ayrı bir hücre içinde boya dağıtım için, ve bu akılda olmalıdır. Tek bir dalga boyu boyalar, prensip olarak, kalibre edilebilir olsa da, tekniğin doğruluğunu yoksul ve biz bunu yapmaya çalışmayın. Kalibrasyon olmadan bile Fura-2 (veya emisyon oranı boya indo) ile elde edilen oran, nispi değişiklikler kabul edilebilir sadık bir temsil vermek Oysa [Ca 2 +] i, tek bir dalga boyu boyaların floresan, çok doğrusal [Ca 2 +] i ile ilgili Doyma eğrisinin en yararlı bir bölümü üzerinde tek bir dalga boyu boyalar ilişki genellikle logaritmik olarak yakındır. Şu anda kullandığınız Oregon Yeşil BAPTA-1 (Şekil 4) küçük değişikliklere karşı hassas olması nedeniyle, [Ca 2 +] yakın düzeyde (50-100 nM) dinlenme . [Ca2 +] 1 mcM yanıtları doyurabilecek floresan değişimi ve boya açısından altında temsil yukarıda i yükselir. UV eksitasyon başvurmadan tekniğin geliştirilmesi için bir seçenek gibi Fluo-3 ve Fura kırmızı bir boya ile yük hücreleri çift. Her ikisi de 488 nM heyecanlı ama aynı anda verdikleri yanıtlara çok farklı olabilir. 540 ve 650 nM emisyon Kayıt doğru izleme için daha iyi bir yöntem sağlayabilir oranı sağlar [Ca 2 +] (Haughland 2002) ve sperm (Nisigaki ve ark, 2006) için geçerli olabilir. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 Oregon Yeşil BAPTA-1 ve Oregon Green BAPTA-2 için ücretsiz [Ca 2 +] (nM) ve pik dalgaboyu (yaklaşık 525 nm) floresans emisyon arasındaki ilişki. OGB1 dinlenme az daha yüksek bir floresan veren [Ca 2 +] böylece, ancak daha düşük düzeyde doymuş yağ asitleri ve küçük kullanışlı bir aralığı vardır . Bu araziler için veriler Moleküler Problar el kitabı (Haughland 2002) elde edilmiştir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Low light level Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QImaging</td>
<td>Rolera XR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oregon Green BAPTA-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>06807</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>IQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Institues of Health</td>
<td>Image J</td>
<td>Public domain software</td>
</tr>
<tr>
<td>LED illumination system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cairn Research</td>
<td>Opto LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

techniques for imaging ca2+ signaling in human sperm

Floresan, Ca yüklü hücreler Floresan mikroskopi<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Hassas boyalar, mekansal ve zamansal açıdan Ca ölçümü için kullanılır.<sup&gt; 2 +</sup&gt; Canlı hücreler sinyal. Burada Ca insan sperm süspansiyonlar yüklemek için laboratuvarlarda kullanılan bir yöntem tarif<sup&gt; 2 +</supBoyalar&gt; raporlama ve fizyolojik uyarılma sırasında floresan sinyal ölçüm. Hareketli hücreler doğrudan yüzmeye kadar izole edilmiş ve deney bağlı olarak, 0-24 saat süreyle capacitating koşulları altında inkübe. Ca hücre permeant AM (asetoksi metil ester) ester formu<sup&gt; 2 +</sup&gt; Raporlama boya, saat sitoplazma içine boya yükleme için izin verilen bir hücre kısım ve 1 bir süre sonra eklenir. Hücrelere foto-hasarı en aza indirmek için görünür dalga boyu boyaları kullanabilirsiniz, ancak bu oranlı metrik kayıt mümkün değildir anlamına gelir. Bu yaklaşımın avantajları ve dezavantajları tartışılmıştır. Yükleme süresi hücreleri sırasında bir görüntüleme odasına ve poli-D-lizin kaplı lamel uymak için izin verilir. Yükleme süresini aşan boya ve gevşek hücreleri sonunda perfüzyon cihazı odasının bağlantı kaldırılır. Odasının sürekli perfüze, uyarı ve modifiye Salines sonra perfüzyon başlığına eklenir. Deneyler floresan görüntüleri zaman atlamalı satın alma tarafından kaydedilen ve ilgi alanları elle çizim, detaylı çevrimdışı analiz. Veri Ca (veya bir hücrenin bir parçası), her hücre bir grafik göstermek için, bu tür ön uyaran seviyeleri normalize<sup&gt; 2 +</sup&gt; Floresan% değişim yanıt elde edilir.

Watch this Scientific Journal Video about Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm at JoVE.com

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

[Ca uyaran-uyarılmış<sup&gt; 2 +</sup&gt;] Bireysel insan sperm i sinyalleri değerlendirilir. Hareketli hücreler Ca yüklenir<sup&gt; 2 +</sup&gt; Duyarlı floresan boya (AM-ester yöntemi) ve bir perfusable odasında hareketsiz. Hücreler zaman atlamalı floresan mikroskobu ile görüntülenmiş ve perfüze ortamı üzerinden uyarılır. Yanıtları tek hücreleri (veya bölgeler) Excel kullanarak çevrimdışı analiz edilmektedir.

Görüntüleme Ca Teknikleri 2 + İnsan Sperm sinyal

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

techniques-for-imaging-ca2-signaling-in-human-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

17.0K Görüntüleme.  University of Birmingham. [Ca uyaran-uyarılmış 2 +] Bireysel insan sperm i sinyalleri değerlendirilir. Hareketli hücreler Ca yüklenir 2 + Duyarlı floresan boya (AM-ester yöntemi) ve bir perfusable odasında hareketsiz. Hücreler zaman atlamalı floresan mikroskobu ile görüntülenmiş ve perfüze ortamı üzerinden uyarılır. Yanıtları tek hücreleri (veya bölgeler) Excel kullanarak çevrimdışı analiz edilmektedir.

Video: Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

In vivo Ca 2 + - Bal Arısı Koku Öğrenme sırasında Mantar Vücut Nöronlar Görüntüleme

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Biyoloji

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Floresan In situ İnsan Sperm hibridizasyon (FISH) Protokolü

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

Vasküler Ca Görselleştirme 2 + Parakrin Türetilmiş ROS tarafından tetiklenmiş Sinyal

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

İfade Klonlama tarafından Grb2 Sinyal Kompleksi Eğitim için bir Yüksek içerik Görüntüleme İş Akışı

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu<sup&gt; 2 +</sup&gt; Geçici ve Membran Akımlar

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Hücre içi Ca Ölçme<sup&gt; 2 +</supDört Teknikleri ile İnsan rm&gt; Değişiklikler: Konvansiyonel Florometre, Akış Florometre, Sitometrisi ve Tek Hücre Görüntüleme Durduruldu

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Sabit Görüntüleme prometafaz ve Metafaz Mayoz ve I Teknikleri<em&gt; Drosophila</em&gt; Oositler

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...