Name: imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells
Uploaded: 2015-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells at JoVE.com

This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.

Biz insan nöroblastom SH-SY5Y hücrelerinde yerel Ca 2 + olayları görüntüleme ayrıntılı prosedürler sunuyoruz. Bu prosedürler, çoğu hücre tipinde 8-10 görüntü hücre içi Ca + 2 sinyallere uyarlanabilir. Hücreler 1. Hazırlık <ol><li> Kültür hücreleri tedarikçinin Web sitesinde listelenen talimatlara göre yansıması için. </li><li> Görüntü vermeden önce birkaç gün, hasat hücreleri, 1 ml 0.25% tripsin / EDTA (2-3 dakika) kullanılarak bir doku kültürü şişesi içinde büyütülür. Dekolmanı ardından, tripsin inaktive kültür ortamı eşit hacimde ekleyin. </li><li> Tabağı başına 3-7 x 10 4 hücre yoğunluğunda cam alt görüntüleme kapları içine bir hemasitometre ve tohum hücreleri kullanılarak bir hücre sayımı yapın. Görüntüleme deneyleri için hücreleri seçin onlar% 60 izdiham (2-3 gün) ulaştığınızda. </li></ol> Çözümler ve Reaktifler 2. Hazırlık <ol><li> Tamponlu Ca 2+ çözülebilmekle HEPES hazırlayın(mM) oluşan tuz çözeltisi (Ca 2 + -HBSS): 135 NaCl, CaCI2, 1 MgCl2, 10 HEPES, 10 glukoz 5.4 KCI, 2; pH = 7.4 NaOH ile oda sıcaklığında (RT). 4 ° C &#39;de glikoz ve mağaza eklenmeden Ca 2 + -HBSS hazırlanması; kullanımdan hemen önce solüsyona glikoz ekleyin. </li><li> Floresan Ca2 + göstergesi Cal-520 (1 mM) zara nüfuz edici formları çözünür, Cı-IP 3 (200 uM) ve EGTA% 20 Pluronic F-127 içeren bir dimetil sülfoksit (100 mM), (DMSO). -20 ° C de, nem ve ışıktan korunan Eppendorf tüpleri ve mağaza içine, bu reaktif maddeleri bir kısım. </li></ol> 3. Yükleme Hücreler Membran-geçirgen, Cal-520 ci-IP 3 ve EGTA <ol><li> Ca + 2 -HBSS sırasıyla 5 uM ve 1 uM nihai bir konsantrasyona kadar zara nüfuz edici Cal-520 ve CI-IP 3 stok çözelti seyreltilerek &quot;yükleme tamponu&quot; hazırlayın. </li><li> Aspire culture medya ve Ca 2+ -HBSS üç kez medya değiştirerek hücreleri durulayın. </li><li> Ca2 + çıkarın -HBSS ve karanlıkta, oda sıcaklığında 60 dakika süre ile yükleme tampon maddesi içinde hücrelerin inkübe edin. </li><li> Yükleme tamponu çıkarın ve Ca 2+ -HBSS üç kez medya değiştirerek hücreleri durulayın. <ol><li> Arzu edildiği takdirde, bu aşamada, daha sonra yük Ca 2 + -HBSS 5 mM&#39;lik bir son konsantrasyona kadar stok çözelti seyreltilerek EGTA / AM ile hücreler ve karanlıkta, oda sıcaklığında, 30-60 dakika boyunca kuluçkalayın. Bu inkübasyonun ardından, 3.5 adıma devam etmeden önce, hücreler Ca + 2 -HBSS ile üç kez yıkayın. </li></ol></li><li> Yüklenen reaktifler de-esterifikasyonu için izin vermek için 30 dakika süre ile Ca + 2 -HBSS hücreleri inkübe edin. </li><li> Görüntüleme hemen önce, son inkübasyon sırasında banyoya sızan olabilecek boya kaldırmak için &quot;taze&quot; Ca 2 + -HBSS Ca 2+ -HBSS değiştirin. </li></ol> 4. Ca 2+ </sup&gt; Image Acquisition <ol><li> 100X APO TIRF objektif üzerine daldırma yağ küçük bir damla (NA 1.49) yerleştirin. </li><li> Ters mikroskop sahnede görüntüleme çanak monte ve iletilen ışık kullanarak odak noktası haline getirmek hücreleri. Bu kayıt sırasında hareket etmesini önlemek için görüntüleme çanak sabitlemek için önemlidir. </li><li> Yüksek hızlı EMCCD kamera kullanılarak yayılan floresan (λ&gt; 510 nm) Cal-520 heyecanlandırmak ve toplamak için bir 488 nm lazer ile hücreleri aydınlatın. NOT: mikroskop faaliyet yazılım paketi kullanıcı lazer ışını ya (&quot;WF&quot; uyarma için) daha merkezi ya da (TIRF uyarma için) objektif arka diyafram aşırı kenarında tanıtılacak sağlayan bir odaklama lens çevirmek için izin verir. </li><li> EMCCD yazılımı kullanarak, yerel Ca 2 + olayları yakalamak için gerekli zamansal çözünürlükte veri toplamak için tam 512 x 512 piksel görüntüleme alanını azaltır. NOT: Örneğin, orta dörtlü256 x 256 piksel edinimi 66 fps&#39;ye satın alma oranını hızlandırır. Bundan başka, bir izole edilmiş Bitki Mod fonksiyonu kullanılarak 500 fps EMCCD kameranın kare hızını arttırmak için de mümkündür. </li><li> Otomatik, bazal aktivite birkaç saniye kayıt hücrelere UV flaş teslim ve başka 10-30 saniye kayıt devam etmek yazılım yapılandırın. NOT: UV flaş mikroskop arka limanında dikroik ayna yansıtan bir UV ile tanıtıldı Xenon ark ışık kaynağı kullanılarak teslim edilir. UV flaş süresi ve yoğunluğu yerel Ca 2 + olayların İstenen frekansı uyandırmak için ampirik ayarlanır. </li><li> Görüntü off-line analiz için yığılırken dosyaları kaydedin. </li></ol> 5. Otomatik Ca 2+ Görüntü Analizi NOT: Bu görüntülemek, süreç ve birçok ticari yazılım paketleri kullanılarak yakalanan verileri analiz etmek mümkündür. Ancak, hızla tanımlanması bir otomatikleştirmek için bir algoritma geliştirdikYerel Ca 2 + sinyalleri d analizi. Bu algoritma, mekansal ve zamansal filtre ayrıntılı bir tarifi, mesafe kadar taşınmış / F 0 ve kimlik / analiz rutinleri üretimi 11 bulunabilir. Bu algoritma, açık kaynak kodlu bir yazılım platformu Python üzerinde çalıştırmak için geliştirilmiştir, tarafından, birlikte örnek deneysel verilere ve detaylı kullanıcı talimatları ile elde edilebilir, e-posta gelen yazar (ismith@uci.edu). <ol><li> Dosyalarını dönüştürme çoklu uçağın .tiff dosya formatına özel yazılmış algoritma ithal edilecek. </li><li> Analiz algoritması içeren klasörü bulun ve çift tıklayın RUN.EXE. </li><li> .tiff Dosyayı seçin analiz edilecek. </li><li> Açık iletişim kutusunda analiz parametrelerini seçin. Örnek verileri için varsayılan parametreleri Şekil 2A bakın. </li><li> Siyah seviyesini belirlemek ya n yapar görüş alanının bir kısmına imleci hareket ettirerek görüntü yığını ofset edilecekot hücreyi içerirler (Şekil 2B bakınız) veya elle &#39;Set Siyah Seviye&#39; istemini kullanarak siyah seviyesi girerek. </li><li> Yazılım (Şekil 2C-F) tarafından analiz aşağıdaki ekranda dört pencere gözlemleyin. C hücrelerinden floresan istirahat bir tek renkli görüntü analiz ediliyor. Bu resmin üzerine bindirilmiş Beyaz kareler olaylara takılı iki boyutlu Gauss fonksiyonları sentroid pozisyonları olarak belirlenen etkinlik konumları vardır. </li><li> Her olay yere tıklayın ya da olaylar arasında dolaşmak için imleç tuşlarına basın. Bunu yaparken üzerine arka plan çıkarılır, Gauss penceresi D. bu siteler güncelleme her floresan oranı değişiklikleri (mesafe kadar taşınmış / F 0) düzeltti NOT: Kırmızı olayları komşu sitelere lokalize faaliyetten &#39;sızdırma-through&#39; o belirli sitesinden kaynaklanan ve kararlı olduklarını vurguladı. Seçilen yerinde floresan sinyal algılama aştı nerede alt mavi iz gösterirSiyah çizgi söz konusu sitesinden kaynaklanan olayları tanımlar ise eşik, (kırmızı karşılık gelen olayları vurgulanan). </li><li> Bir kırmızı tıklayın olayın zamansal evrimi görüntüler pencere E, ve birlikte takılan Gauss fonksiyonu mekansal profili ile, olayın mekansal profil zamanı boyunca ortalama görüntüler pencere F güncellemek için olay vurgulanır. </li><li> El eserler analiz reddedilmesi, böylece tespit edilmiştir olaylarını. Sağ kırmızı tıklayarak tür olayları silmek olayları vurgulanır. NOT: Bizim ellerde, Ca tek bir IP 3 R kanallardan 2+ akı kadar taşınmış / F 0 yaklaşık 0.11 ile sinyalleri çağrıştırıyor, bu nedenle bu ölçüde daha küçük herhangi bir tespit &#39;etkinlikleri&#39; yanlış pozitif olması muhtemeldir. </li><li> Kaydet CellR ilgi hücrenin etrafında çizim ve &#39;seçerek hücre bazında bir veri veya ihracat&#39; Excel kaydet &#39;seçerek İhracat verileri17 ;. NOT: Veriler, orijinal görüntü yığınıyla aynı klasöre kaydedilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li><li>Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+smooth+muscle.">Calcium signaling in smooth muscle.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).</li><li>Hagenston, A. M., Bading, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+synapse-to-nucleus+communication.">Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564 (2011).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+and+global+aspects+of+calcium+signalling.">Elementary and global aspects of calcium signalling.</a> J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).</li><li>Lipp, P., Niggli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchical+concept+of+cellular+and+subcellular+calcium+signalling).">A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling).</a> Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).</li><li>Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics+of+calcium+liberation+induced+in+Xenopus+oocytes+by+photoreleased+inositol+trisphosphate.">Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate.</a> Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).</li><li>Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+calcium+based+on+rhodamine+and+fluorescein+chromophores.">Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores.</a> J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).</li><li>Demuro, A., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+activity+and+localization+of+single+voltage-gated+Ca(2+)+channels+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).</li><li>Smith, I. F., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+quantal+substructure+of+single+inositol+trisphosphate+receptor+channel+activity+during+calcium+puffs+in+intact+mammalian+cells.">Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).</li><li>Reissner, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+postsynaptic+mechanism+for+heterosynaptic+sharing+of+short-term+plasticity.">A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity.</a> J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).</li><li>Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+algorithm+for+automated+detection,+localization+and+measurement+of+local+calcium+signals+from+camera-based+imaging.">An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging.</a> Cell Calcium. , (2014).</li><li>Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+puff+sites+adjacent+to+the+plasma+membrane:+Functional+and+spatial+characterization+of+calcium+signaling+in+SH-SY5Y+cells+utilizing+membrane-permeant+caged+inositol+trisphosphate.">Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate.</a> Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).</li><li>Shuai, J., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+single-channel+recording+by+imaging+calcium+flux+through+individual+ion+channels:+theoretical+considerations+and+limits+to+resolution.">Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution.</a> Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Biz burada açıklamak floresan Ca 2 + göstergeleri kullanarak kültürlü memeli hücrelerinde yerel Ca 2 + olayları görüntüleme için protokolleri. Ayrıca, kimlik ve elde edilen verilerin analizi otomatik bir sezgisel kullanıcı arayüzü ile bir algoritma tanımlamaktadır. Burada tarif edilen prosedür floresan Ca 2 + göstergesi Cal-520 kullanmak, ancak Flu-3, Flu-4, Flu-8 ve Oregon Yeşil BAPTA-1 gibi diğer birçok Ca 2 + duyarlı boyalar görüntü Ca yeterince ...

Kalsiyum iyonları (Ca 2+) yayg gen ifadesi, sekresyon ve sinaptik plastisite 1 uzun ömürlü değişiklikler dahil olmak üzere biyolojik süreçlerin, çeşitli bir yelpazede düzenler. Ca 2 + Böyle farklı bir şekilde hareket hangi aracılığıyla bir yolu Ca 2+ farklı mekansal ve zamansal desenleri ile bir hücre oluşturabilir sinyalleri. Sitozolik örnek küresel yükselme düz kas dokusu 2 ise daha küçük [Ca 2+] tetik daralma, lokalize geçici yükselmeler (yerel Ca 2 + mikro bölgeler) için öğrenme ve bellek 3 için gerekli gen ifadesini teşvik. Ücretsiz sitozolik [Ca 2 +] ~ 100 nM dinlenme tutulur, fakat hızla Ca ile sitozolüne Ca 2+ akını aşağıdaki birkaç mikro-molar plazma zarı ve yanında bulunan 2 + -geçirgen iyon kanallarını çıkabilir hücre içi s Ca 2+ kurtuluştores. Bizim laboratuvar endoplazmik retikulum (ER) zarında bulunan Ca 2 + bırakma kanalı oluşturan inositol 1,4,5-trifosfat alıcısı (IP 3 R), odaklanır. Reseptör siteleri aktive sitozolik hem IP 3 ve Ca 2+ bağlanması üzerine, IP 3 R kanalı Ca 2 + ER lümeninde tecrit kurtarmak açılır. Ca 2+ salınımı uzamsal (Ca 2 + puf 4) 2+ Ca yerel sitozolik mikro oluşturmak için IP 3 Rs küçük bir küme sınırlı kalabilir veya IP 3 Rs komşu kümelerinin yakınlığı bağlı olabilir Ca 2+ indüklediği Ca 2 + -salınımı (YÜÇAM) 5,6 süreciyle birden puf siteleri işe bir hücre boyunca yaymak. Gelişmiş mikroskobu IMAGI ile birleştiğinde Tsien 7 Roger tarafından geliştirilen floresan küçük moleküllü Ca 2+ gösterge boyaların tanıtımı,teknikleri ng, Ca 2+ sinyalizasyon anlayışımızı büyük katkı sağlamaktadır. Mikroskopi için kullanılan kameralar son gelişmeler şimdi böyle görülmemiş mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahip ponponları gibi geçici yerel Ca 2 + olayları görüntüleme için izin verir. Şu anda mevcut EMCCD kameralar&gt; 500 kare saniye -1 (fps) ve tamamlayıcı metal oksit yarı iletken yeni nesil 128 x 128 piksel ile görüntüleme sağlayan (CMOS) kameralar biraz daha yüksek pahasına yüksek piksel çözünürlük, ve hatta daha hızlı sağlamak gürültü seviyeleri. Toplam iç yansıma (TIRF) mikroskopi ile birlikte bu görüntüye artık tek Ca 2 + kanal olayları 8,9 mümkündür. Impracticable manuel işleme, görsel kimlik ve analiz hale ve otomatik algoritmalarının geliştirilmesi yapma yükümlülüğü büyük veri setleri (min başına yaklaşık 1Gb) oluştururken Bu yaklaşım, aynı zamanda kanal / olayların yüzlerce görüntüleme için izin verir. 2 + göstergeleri kullanarak sağlam memeli hücrelerinde yerel Ca 2 + sinyalleri görüntüleme prosedürlerini ve protokolleri sunuyoruz. Biz daha TIRF ve geleneksel geniş alan epi-floresan (WF) mikroskopi hem görüntülü yerel Ca 2 + olayların belirlenmesi ve analizi otomatik açık kaynak kodlu ortam Python geliştirilen bir algoritma göstermek. Biz IP Ca 2 + sinyalleri -generated 3 bağlamında bu yaklaşımları açıklamak rağmen, [Ca 2 +] Ca çeşitli ya yüzeye bulunan 2+ -geçirgen iyon kanallarını yayılan sitozolik yerel değişiklikleri incelemek için kolayca mükellef olan Membran ya da hücre içi organellerin 8-10.

<table><tbody><tr><td>Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Cal-520/AM</td><td>AAT Bioquest Inc.</td><td>21130</td><td></td></tr><tr><td>ci-IP&lt;sub&gt;3 &lt;/sub&gt;(D-23-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-Isopropylidene-6-&lt;em&gt;O&lt;/em&gt;-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-&lt;em&gt;myo&lt;/em&gt;-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester</td><td>SiChem</td><td>cag-iso-2-145-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO/20% pluronic F127</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>EGTA/AM</td><td>Invitrogen</td><td>E-1219</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glass-bottom imaging dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging local ca2+ signals in cultured mammalian cells

Sitosolik Ca + 2 iyonları, gen transkripsiyonu, elektriksel uyanlabilirliği ve hücre çoğalması gibi çok kapsamlı işlemlerin kontrol, hemen hemen tüm hücre tiplerinde hücresel aktivitesi sayısız yönlerini düzenleyen. Ca 2 + sinyalizasyon çeşitliliği ve özgünlüğü yerel geçici Ca 2 + microdomains dakika süre boyunca meydana gelen hücre çapında titreşimler ve dalgalar arasında değişen Ca 2 + sinyalleri farklı zaman ve mekansal ölçekler üzerinde hareket oluşturulur hangi mekanizmalar, türemiştir (Ca 2+ ponponları) kalıcı milisaniye. Elektron son gelişmeler CCD (EMCCD) kameralar artık&gt; 500 kare saniye -1 (fps) oranlarında 128 x 128 piksel mekansal çözünürlüğe sahip yerel Ca 2 + sinyalleri görüntüleme için izin çarpılır. Bu yaklaşım son derece paralel ve tek bir deneyde kanallar veya puf sitelerin yüzlerce eşzamanlı izlenmesini sağlar. Ancak, verilerin büyük miktarlarda üretilen (yaklaşık 1 Gb per dk) 2+ olayları uygulanamaz yerel Ca görsel kimlik ve analiz kılıyor. Burada tarif ve satın alma, algılama için prosedürleri göstermek ve geniş alan epi-floresan (WF) ve toplam iç yansıma ikisini de kullanarak Ca 2 + göstergeleri ile yüklenen sağlam memeli hücrelerinde Ca 2+ sinyalleri aracılı 3 yerel IP analizi floresan (TIRF) mikroskopi. Ayrıca, bu yerel Ca 2 + sinyallerin belirlenmesi ve analizi otomatik açık kaynak yazılım ortamı Python içinde geliştirilen bir algoritma tarif. algoritma alt piksel çözünürlüğe sahip Ca 2+ sürümü siteleri lokalize; veri kullanıcı gözden sağlar; ve bir Excel uyumlu tabloda genlik ve kinetik verileri ile birlikte floresan oranı sinyallerinin zaman dizilerini çıktılar.

Şekil 1A, CI-IP 3 yüklü insan nöroblastoma SH-SY5Y hücrelerinin Cal-520 floresan dinlenme bir WF görüntüsünü gösterir. Fotoğraf-sürüme 100 milisaniye UV flaş bu hücrelerin Pozlama i-IP 3 (Şekil 1A beyaz çevreler tarafından not) ayrık siteleri geçici Ca 2 + ponponları ortaya çıkardı. Bu sitelerde ölçülen Floresan izleri yavaş yavaş bırakma sitesinden yayılan 2+ Ca gibi bir çok yavaş düşen faz (Şekil ...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells at JoVE.com

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

imaging-local-ca2-signals-in-cultured-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

10.7K Görüntüleme.  University of California, Irvine. Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Video: Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Nörobilim

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Gelişim Biyolojisi

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Virüsle Enfekte İnsan Bağırsağı Organoid Tek Tabakalarının Kalsiyum Görüntülemesi

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory activity, actin dynamics, inflammatory responses, stem cell proliferation, and many other uncharacterized cellular functions. As such, mapping calcium signaling dynamics within the intestinal epithelium can provide insight into homeostatic cellular processes and unveil unique responses to various stimuli. Human intestinal organoids (HIOs) are a high-throughput, human-derived model to study the intestinal epithelium and thus represent a useful system to investigate calcium dynamics. This paper describes a protocol to stably transduce HIOs with genetically encoded calcium indicators (GECIs), perform live fluorescence microscopy, and analyze imaging data to meaningfully characterize calcium signals. As a representative example, 3-dimensional HIOs were transduced with lentivirus to stably express GCaMP6s, a green fluorescent protein-based cytosolic GECI. The engineered HIOs were then dispersed into a single-cell suspension and seeded as monolayers. After differentiation, the HIO monolayers were infected with rotavirus and/or treated with drugs known to stimulate a calcium response. An epifluorescence microscope fitted with a temperature-controlled, humidified live-imaging chamber allowed for long-term imaging of infected or drug-treated monolayers. Following imaging, acquired images were analyzed using the freely available analysis software, ImageJ. Overall, this work establishes an adaptable pipeline for characterizing cellular signaling in HIOs.

Yazar Spotlight: Bağırsak Epitel Sinyalizasyonunun Viral Bozulmasının Araştırılması – Araştırma Öngörüleri ve Gelecekteki Yönergeler 

This protocol describes an approach for performing calcium imaging in virus-infected human intestinal organoids and offers an approach to analysis.

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Visualizing Shifts on Neuron-Glia Circuit with the Calcium Imaging Technique

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral (dorsal root ganglia) and central tissues (cortex, subventricular zone, organoid) that are dynamically studied in terms of calcium shifts. The model chosen to illustrate the results is the retina, a simple tissue with complex cellular interactions. Calcium is a universal messenger involved in most of the important cellular roles. We explain in a step-by-step protocol how retinal neuron-glial cells in culture can be prepared and evaluated, envisioning calcium shifts. In this model, we differentiate neurons from glia based on their selective response to KCl and ATP. Calcium permeable receptors and channels are selectively expressed in different compartments. To analyze calcium responses, we use ratiometric fluorescent dies such as Fura-2. This probe quantifies free Ca2+ concentration based on Ca2+-free and Ca2+-bound forms, presenting two different peaks, founded on the fluorescence intensity perceived on two wavelengths.

Cell calcium imaging is a versatile methodology to study dynamic signaling of individual cells, on mixed populations in culture or even on awakened animals, based on the expression of calcium-permeable channels/receptors that gives unique functional signatures.

Kalsiyum Görüntüleme Tekniği ile Nöron-Glia Devresindeki Değişimlerin Görselleştirilmesi

Here, we report on selective in vitro models of circuits based on glia (astrocytes, oligodendrocytes, and microglia) and/or neurons from peripheral ...

<meta charset="utf8"></head><body>T hücrelerinde Ca2+ mikro alanları tespit etmek için yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniği

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spot Işığı: Terapötik Müdahale için Adaptif Bağışıklık Tepkisinin İlk Aktivasyonunun Çözülmesi

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

Primer T Hücrelerinde İlk Ca2+ Mikro Alanlarının Görüntülenmesi

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

Görüntüleme Yerel Ca

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging'de elegans

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

Yerel Ca^{2 +} sinyalleri membran hedefli Ca^{2 +} göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi

Kalsiyum Görüntüleme Tekniği ile Nöron-Glia Devresindeki Değişimlerin Görselleştirilmesi

Primer T Hücrelerinde İlk Ca²⁺ Mikro Alanlarının Görüntülenmesi