Başlamak için, kültürlü iPSC'leri Dulbecco'nun PBS veya DPBS'si ile yıkayın. Ve bir mililitre proteolitik ve kollajenolitik karışım ekleyin. Hücreleri ayırmak için çanağı iki dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra, reaksiyonu durdurmak için 1,5 mililitre önceden ısıtılmış iPSC kültür ortamı ekleyin. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücreleri hücre kültürü kabından yedi ila 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek ayırın. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın.
Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200xg'de pelet yapın. Ve süpernatanı aspire et. Pelet, 50 mikromolar Y27632 ile desteklenmiş iki mililitre iPSC kültür ortamında tekrar askıya alın.
Şimdi, bir Neubauer odası kullanarak hücreleri saymak için 10 mikrolitre hücre süspansiyonu kullanın. 50 mikromolar Y27632 ile desteklenmiş iPSC kültür ortamını kullanarak hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu 150 mikrolitre başına 9.000 hücreye ayarlayın. Embriyoid cisimleri veya EB'ler üretmek için, ultra düşük bir bağlantı 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 150 mikrolitre hücre süspansiyonu tohumlamadan önce hücre çökelmesini önlemek için hücre süspansiyon tüpünü sallayın.
EB'leri 48 saat boyunca humifiye bir atmosferde kültürleyin. İnkübasyonun sonunda, kuyucuk başına 100 mikrolitre ortamı çıkarın. Ve Y27632 olmadan 150 mikrolitre önceden ısıtılmış taze ortam ekleyin.
Parafilm ızgarasını kağıt zarflı tarafı yukarı bakacak şekilde 0,2 mililitrelik tüp rafına yerleştirerek parafilm üzerinde dörte dört çukur ızgara oluşturun. EB'leri bodrum membran matrisine yerleştirmek için eldivenli parmağınızı her raf deliğine hafifçe bastırın. Ardından kağıdı çıkarın ve boyutunu 60 mililitrelik bir hücre kültürü kabına sığacak şekilde ayarlamak için makas kullanarak gamze ızgarasını parafilm karesinden kesin.
Çukurlu parafilmi, bazal membran matrisi damlacık üretimi için bir temel sağlamak üzere 0,2 mililitrelik tüp rafına geri yerleştirin. EB'leri, 200 mikrolitrelik pipet ucu kesilmiş bir pipet kullanarak kültür kabının kuyusundan parafilm çukurlarına birbiri ardına dikkatlice aktarın. 16 EB'yi ızgaraya taşıdıktan sonra, 200 mikrolitrelik yeni bir pipet ucu alın ve kalan ortamı çukurlardan çıkarın.
Şimdi, bir EB içeren her çukurun üzerine bir damla bazal membran matrisi pipet edin. 10 mikrolitrelik bir pipet ucu alın ve damlacık sınırlarını bozmadan EB'leri her damlacığın merkezine hızlıca hareket ettirin. Çukurlu parafilmi bazal membran matrisi damlalarıyla 60 milimetrelik bir hücre kültürü kabına yerleştirin. Matrisin polimerleşmesine izin vermek için 37 santigrat derecede 15 ila 30 dakika inkübe edin.
Ayrıca, matrise gömülü EB'leri parafilmden ayırmak için, yemeğe A vitamini içermeyen beş mililitre farklılaşma ortamı ekleyin. Forseps kullanarak parafilm karesini baş aşağı çevirin, böylece EB'lerin bulunduğu taraf çanağın dibine bakacak şekilde çevrilir. EB'leri içeren bazal membran matris damlalarını parafilmden ayırmak için çanağı dikkatlice çalkalayın.
Bazıları hala bağlıysa, forseps kullanarak parafilm karesinin bir kenarını alın ve çanak çanağın ortasına doğru birkaç kez hızla yuvarlayın. Daha sonra serebral organoidleri, 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ve% 95 hava ile nemlendirilmiş bir atmosferde 55 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde kültürleyin. Organoidleri A vitamini olmadan DM'de tutun ve her geçen gün orta değişikliklerle tutun.
Periferde ventrikül benzeri yapılara ve kompakt, sağlıklı bir morfolojiye sahip 32 günlük tohumlama sonrası insan serebral organoidinin parlak alan görüntüsü gösterilmiştir.
