We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.

1. Virüs Hazırlıklar ve Transkripsiyon Faktör Birleşmeleri <ol><li> PSIN-EF1α lentiviral sentezleme plasmidi ETV2, gata1, GATA2, TAL1 ve LMO2 (Tablo 1) için protein kodlayıcı DNA&#39;yı içeren çözelti hazırlayın. </li><li> 230 nm, 260 nm ve 280 nm&#39;de bir spektrofotometre UV absorpsiyonu kaydederek lentiviral üretimi için kullanılan plazmid preparasyonlarının konsantrasyon ve saflık ölçün. Not: 1.8 daha fazla DNA preparatları gösteren A260 / 280 ve A260 / 230 değerleri genellikle kaliteli olarak kabul edilir. Alt A260 / 230 değerleri tuzları ya da bazı çözücü gibi fenol ile kirleri işaret ederken alt A260 / 280 değerleri protein kontaminasyonu gösterebilir. Önerilen plazmid konsantrasyonu 1-3 mg / ml olduğunu. </li><li> Daha önce yayınlanmış protokollere 11&#39;de tarif edildiği gibi transdüksiyon için lentivirüsler üretir. Pan-miyeloid potansiyeli olan HE indüksiyonu ETV2 ve gata1 veya ETV2 ve GATA2 ko-ifadesini gerektirir.Eritro- ve megakaryositik potansiyeli olan HE indüksiyonu GATA2 ve TAL1 gerektirir. LMO2 ilavesi, GATA2 ve TAL1 10 mevcudiyetinde hPSCs gelen eritro-megakaryositik hücrelerin verimini geliştirir. </li></ol> 2. hPSCs Kültür Protokolü <ol><li> Alt kültüre önce% 70-80 confluency keskin kenarlı dar kolonilerde pluripotent kök hücreleri büyütün. Mark ve kaldırmak kendiliğinden hücrelerin Pasajlanması önce koloniler farklılaşmış. </li><li> Gece boyunca 4 ° C &#39;de, üreticinin talimatlarına ve kılıf 6-çukurlu plakalara göre, ticari hücre dışı matris jel (bakınız Tablo 2) ile seyreltilir, veya kullanımdan önce 37 ° C&#39; de en az bir saat karıştırıldı. Hücreleri Pasajlanması önce, matris aspire taze ticari komple culturemedium 2 ml ekleyin (bakınız Tablo 2) ve 37 plakaları tutmak ° C, hücreler kadar% 5 CO 2 tohumlama için hazırız. </li><li> Passage hPSCs <ol><li> Aspira(0.22 um filtre içinden süzme ile sterilize edilmiş DMEM / F12 içinde 2 mg / ml), bir konfluent hPSCs ile 6 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu ve önceden ısıtılmış Dispase II çözeltisi 1.5 mi ilave gelen te ortamı. Kolonilerin kenarları yüzeyinden kaldırılması için başlayana kadar 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 5-7 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Aspire Dispase II çözümü ve dikkatle ekleme ve sonra taze DMEM / F12 orta 2 ml aspire kez koloniler yıkayın. Daha sonra, 5 ml&#39;lik serolojik cam pipet ile, taze ticari tam kültür ortamı içinde 3 ml hPSCs ayrıştırmaları yukarı ve aşağı birkaç kez hücre süspansiyonu pipetleme (bakınız Tablo 2). </li><li> Her bir oyuğa, ticari tam kültür ortamı içinde 1.5 ml ihtiva eden bir 6-yuvalı plaka hücre süspansiyonu 0,5 ml ilave edilir (bakınız Tablo 2). Kuvöz içine plaka situating zaman homojen hücre dağılımını sağlamak için ileri ve geri ve sağa sola birkaç kez plaka çalkalayın. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 1 için hücreleri tutun8-24 saat. </li><li> Taze ticari komple kültür ortamına ertesi gün değişim ortamı (bakınız Tablo 2) ve hPSCs morfoloji inceleyin. HPSC morfoloji istinat küçük, iyi-ekli kolonilerde Başarılı Pasajlanması sonuçları. hPSCs de günlük olarak 2.5-3 ml freshmedium başı ile beslenen ve 70-80% konfluansa fazla olmayacak şekilde, her 4-5 gün geçişli olması gerekir. Not: hiPSCs fare embriyonik fibroblastlar (MEF&#39;ler) muhafaza edildi, bunlar besleyici içermeyen koşullar aktarılır ve etkin farklılaşmasını sağlamak için transdüksiyon önce 2-3 kez geçirilmiştir gerekmektedir. </li></ol></li></ol> HPSCs (gün 0, hPSCs transdüksiyonu) için Hematoendothelial Pprecursors 3. İndüksiyon <ol><li> Reaksiyon ortamı, ticari komple serumsuz ortam içinde 1.3 ml kombine hazırlamak için, virüs, polybrene ve Y27632 ROCK inhibitörü (Tablo 1) (bakınız Tablo 2): nihai konsantrasyonları 1.3 ml ortama 10 mM ROCK inhibitörü 1,3 ula bir nihai konsantrasyonu 6 ng / ml, 10 uM tion ve polibren. <ol><li> Hücre başına her virüsün 0,5-1,0 MOI değerinde bir nihai konsantrasyona (enfeksiyon çokluğu), viral bir konsantre (ler), uygun bir miktarda ekleyin. Tek bir hücre süspansiyonu hazır olana kadar buz üzerinde ya da 4 ° C &#39;de, reaksiyon ortamı tutun. Not: gata1 / ETV2, GATA2 / TAL1 bölgesindeki her bir virüs için MOI aynı miktarda ve GATA2 / TAL1 / LMO2 reaksiyon karışımları farklılaşmasının indüksiyonu için en uygunudur. ETV2 göre GATA2 için MOI katlama Ancak ETV2 in / GATA2 transduse kültürler, türev geliştirir. Bu nedenle, bu kültürlerin, oran 1: ETV2 MOI&#39;de ve GATA2 1 MOI 2 önerilir (viral konsantre, yaklaşık 6.8 x 10 7 parçacık / ml olduğu tahmin edilmektedir, eğer, ETV2 10 ul ve GATA2 viral konsantreleri 20 ul ekle örn Bir 6-plaka, 35 mm oyuk bir ETV2 / GATA2 reaksiyon başına 0,68 x 10 6 hücre). </li></ol></li><li> Tek bir hücre asmalar içinde hPSCs hazırlayınension. <ol><li> 4. günde bölüm 2&#39;de tarif edildiği gibi, en son geçiş aşağıdaki besleyici içermeyen koşullarda hPSCs büyümeye tersine bir mikroskop altında hücre yoğunluğu ve şekil görmekteyiz. hPSCs iletimi gününde ~% 60-70 confluency hiç kendiliğinden farklılaşma ile keskin kenarlı sıkı koloniler halinde büyür ve ulaştırılması gerekmektedir. </li><li> Kültür ortamı basınçla, oyuk başına ticari hücre ayırma reaktifi (Tablo 1) 1,5-2 ml ekleyin ve 5-7 dakika için% 5 CO2 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Ticari tam orta eşit hacimlerde içine hücreleri toplamak hücrelerin sayısı ve canlılığı belirler, ROCK inhibitörünün 10 uM (bakınız Tablo 2). Santrifüj Pelet hücreleri 5 dakika 200 x g&#39;de ve daha sonra, ml başına 3,4-5 x 10 6 hücre konsantrasyonunda ROCK inhibitörünün 10 uM ticari tam bir ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri. NOT: Hücre canlılığı, başarılı bir viral transdüksiyon ve daha sonra farklılaşması için çok önemlidir.Tipik haliyle, transdüksiyon önce hücre yaşayabilirliği% 90 fazla olmalıdır. </li></ol></li><li> 3.1 hazırlanan reaksiyon ortamının 1.3 mi içine 0,68-1 x10 6 hücreleri ihtiva eden bir hücre süspansiyonu 200 ul ilave edin. </li><li> 2.2 hazırlanan gece boyunca kaplanmış 6-çukurlu plaka matrisi çözeltisi aspire., 6-çukurlu bir levhanın bir oyuğuna, reaksiyon karışımı transferi ve hücreler eşit dağıtırlar. 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe edilir. 24 saat sonra hücreler en az 80% matrisine bağlı olmalıdır. </li></ol> HPSCs gelen Hematoendothelial Öncülerinin 4. indüksiyonu (Gün 1-7) <ol><li> SCF 100 ng / ml, TPO: 24 saat sonra transdüksiyonu, virüs ihtiva eden orta kaldırmak ve ticari tam olmayan hücre kültür ortamı ile bağlanmış yıkama hücreleri, hematopötik sitokinler (Tablo 1 e bakınız) ve daha sonra ticari bir tam olmayan hücre kültür ortamında oyuk ihtiva başına 3 ml ilave 50 ng / ml bFGF (bundan sonra 3F-ortam olarak adlandırılır), 20 ng / ml. </li><li> Ölü hücreleri ve enkaz kaldırmak için günde 2, 3 ve 4. günde taze 3F-orta toplam orta yerine. Yüzen hematopoietik hücreler ortaya çıkıyor zaman 4 ml toplam hacim korurken 4 gün sonra, her gün 3F-orta yarısı değiştirin. Not: pSIN-EF1α lentiviral sentezleme plasmidleri, böylece kalıt aktarımlı hücrelerin pozitif seçimi için izin puromisin direnç geni içermektedir. Puromycin 1 ug / ml herhangi bir kalıntı farklılaşmamış hPSCs ortadan kaldırmak için farklılaşma ilk 1-2 gün boyunca ortama ilave edilebilir. </li><li> Tersine bir mikroskop altında, 4. günde hücre morfolojisi dikkate alınmalıdır: tipik bir endotel morfolojisi olan hücrelerin yoğun kümeleri ortaya çıkmaya başlar (Şekil 2A, 3A). Bazı alanlarda hPSCs morfoloji tutabilir ise Yuvarlak kan hücreleri, farklılaşma günde 7 günden 5 anlaşılmaktadır. Aşağıda tarif edildiği gibi HE ve hematopoetik farklılaşma analiz edin. NOT: Başarılı hematoendothelial farklıiation gevşek yatan düz bir endotel hücrelerine bağlı olarak refraktil Yuvarlak hücreleri görünür kan hücrelerinin üretimi ile sonuçlanır. Bu hücreler, aktif ayırmak ve şamandıra (Şekil 2A ve 3A) sonunda küçük agregalar oluşturan çoğalırlar ve. Canlı kan hücreleri ışığı yansıtır ve kültür koşullarında genişletmek için kendi yeteneklerine göre ölü ve ölmekte olan hücrelerden görsel ayırt edilebilir. </li></ol> 5. Farklılaşma Hemogenic Endotel (HE) Sahne Analizi. <ol><li> Endotel morfolojisi hücrelerin mikroskobik gözlem yoluyla günde 3 ve farklılaşma 4 arasında HE oluşumunu algılar. Farklılaşma, bu aşamada kültürde yüzen kan hücreleri bulunmaktadır. HE varlığı immunofluorescent boyama ile doğrulandı ve VE-kaderin, CD73, CD226 ve CD43 antikorları kullanarak flow sitometri yöntemi olabilir. <ol><li> 3. günde akım sitometri analizi kullanımı hücreleri tarafından HE oluşumunu değerlendirmek içintek deneyden ve gün 4. Ticari hücre ayrışma reaktifi ile kültürlerin inkübe hücreleri toplamak, 37 ° C&#39;de 5-10 dakika süreyle (Tablo 1 e bakınız), daha sonra% 5 CO2 ve boyama reaksiyon başına 1 x 10 5 hücre kullanabilir (anlatılan boyama işlemi akış sitometrisi 12). NOT:-kaderin VE + HE hücrelerin erken hematopoetik işaretleyici CD226 ifadesini elde, ama CD73 ve CD43 6 ifadesini yoksundur. Tersine, HE-hücreleri CD73 (Şekil 2B, 3B) ifade etmektedir. </li></ol></li><li> HPSC türetilmiş HE için immünofloresan boyama. <ol><li> Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile hücrelerin bağlanmış tek tabaka yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika ila 60 den% 4 paraformaldehid içinde hücrelerin tespit. </li><li> Yıkama Hücreler tekrar PBS ile ve daha sonra oda sıcaklığında 20 dakika boyunca PBS içinde% 0.1 Triton X-100 kullanarak Permeabilize. </li><li> Üç kez PBS, iki hücrelerin yıkayın ve daha sonra inkübe30 ila 120 dakika süre ile,% 10 cenin sığır serumu (FBS) ile PBS oluşan blokaj tamponu. </li><li> Birincil antikorlar hem de içeren, boyama çözeltisi hazırlayın (1: 1000 seyrelti) fare anti-insan CD43 ve tavşan anti-insan% 5 FBS içeren PBS içinde (Tablo 1)-kaderin. A.Ş. </li><li> Hücrelerinden engelleme tampon aspire ve ilave primer antikorlar ile lekeleme tampon maddesi içinde oyuk başına 1 ml ekleyin; Oda sıcaklığında 3 saat veya gece boyunca 4 ° C enkübe edilir. </li><li> % 5 FBS içeren PBS içinde 2 ml ekleyerek hücreler üç kez yıkayın. </li><li> 1 de sekonder antikorlar ihtiva eden, ikinci bir boyama tamponu hazırlayın: 5% FBS içeren PBS içinde 500 seyreltme: eşek, yeşil floresan boya ve kırmızı bir floresan boya (Tablo 1) ile konjuge edilmiş anti-fare ile konjüge edilmiş anti-tavşan. İkincil lekeleme tampon maddesi, oyuk başına 1 ml ilave edilir ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Serum olmaksızın PBS ile üç kez yıkanır. 300 nM DAPI dH çözüm çalışma ile Leke hücreleri10-15 dakika süreyle 2 O. </li><li> PBS ile hücreler iki kez yıkayın ve içine de lekeli hücreleri ile PBS 2-3 ml ekleyin. Yeşil, kırmızı ve mavi mikroskop filtreleri ile floresan gözlemleyin. </li></ol></li></ol> Kaynaklı Hematopoetik Öncülerinin 6. Analizi <ol><li> 3.1 açıklandığı gibi yüzen hücreleri 3F-orta yarısını değiştirerek, 10-14 güne kadar, önemli ölçüde genişletmek kadar her iki günde bir, farklılaşma kültürleri korumak. </li><li> Ayrıştırmaları ticari bir hücre ayrışma reaktifi ile muamele etmek suretiyle hücrelerin hücrelerin tek tabakalarını ayırt toplamak 37 ° 5-10 dakika için (Tablo 1 e bakınız) ° C,% 5 CO2. </li><li> Kültürler 12 hematopoezisi değerlendirmek için anti-VE-kaderin, CD43 ve CD45 antikorları kullanarak flow sitometri gerçekleştirin. Kadar ETV2 ve GATA2 kalıt aktarımlı hücrelerin% 40 hücrelerinin büyük bir kısmı, eş-ifade eder VE-cad olduğu ve CD43 edin. Aşağıdaki antikorlar e, aşağıdaki spesifik hücre soyları tespit etmek için kullanılabilirXpansion veya indüklenmiş kan progenitörlerinin farklılaşması: CD235a (eritroid hücreleri), CD41a (megakaryositik), CD32 (miyeloid hücrelerin her türlü), CD66b (nötrofiller) ve CD163 (makrofajlar) vardır. </li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir ticari klonojenik ortamı (Tablo 1) kullanarak CFC tahlil gerçekleştirin. <ol><li> Ticari klonojenik ortamının 3 ml 2/1 x 10 4 hücreleri aktarın koloni oluşturan hücreler ve hematopoietik koloni tiplerinin sayısını belirlemek için (bakınız Tablo 3). Optimal tohum yoğunluğu birbirinden ayrı büyür ve üst üste gelmez tek koloniler tanımlanması ve izole edilmesi için izin verir. Tohum yoğunluğu farklılaşma verimliliğine bağlı olarak deneyler arasında değişebilir, ancak ticari klonojenik ortamının 1 ml&#39;si başına 1 x 10 4 hücrelerini geçmemelidir. </li><li> Yumuşak bir girdaplamadan ticari klonojenik hücrelerin ortam içinde karıştırın ve iki adet 35 mm&#39;lik çok düşük bağlanma yemekler süspansiyonun 3 ml aktarmakCFC tahlilinde, her bir çanak süspansiyonun 1.5 ml için. Eşit orta dağıtın ve 14 gün süreyle 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 inkübe edilir. Yemekler rahatsız etmemek; Gün 7 ve analiz gününe 10 koloni oluşumunu görmekteyiz. </li><li> 14. günde kendi morfolojilerine göre hematopoetik koloniler tespit ve sayım. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Zape, J. P., Zovein, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemogenic+endothelium:+origins,+regulation,+and+implications+for+vascular+biology.">Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology.</a> Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).</li><li>Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+history+of+hemogenic+endothelium.">A short history of hemogenic endothelium.</a> Blood Cells, Mol &amp; Dis. 51, 206-212 (2013).</li><li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+lymphocyte+potential+marks+the+emergence+of+definitive+hematopoietic+progenitors+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures.">T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+and+hematopoietic+cell+fate+of+human+embryonic+stem+cells+originates+from+primitive+endothelium+with+hemangioblastic+properties.">Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties.</a> Immunity. 21, 31-41 (2004).</li><li>Rafii, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ESC-derived+hemogenic+endothelial+cells+undergo+distinct+waves+of+endothelial+to+hematopoietic+transition.">Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition.</a> Blood. 121 (5), 770-780 (2012).</li><li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+hemogenic+endothelial+progenitor+and+its+direct+precursor+in+human+pluripotent+stem+cell+differentiation+cultures.">Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures.</a> Cell Rep. 2, 553-567 (2012).</li><li>Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukosialin+(CD43)+defines+hematopoietic+progenitors+in+human+embryonic+stem+cell+differentiation+cultures.">Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures.</a> Blood. 108, 2095-2105 (2006).</li><li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta+inhibition+enhances+the+generation+of+hematopoietic+progenitors+from+human+ES+cell-derived+hemogenic+endothelial+cells+using+a+stepwise+strategy.">TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy.</a> Cell Res. 22, 194-207 (2012).</li><li>Uenishi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin+C+promotes+hematoendothelial+development+and+T+lymphoid+commitment+from+human+pluripotent+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions.</a> Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).</li><li>Elcheva, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+induction+of+haematoendothelial+programs+in+human+pluripotent+stem+cells+by+transcriptional+regulators.">Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators.</a> Nat Commun. 5, 4372 (2014).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoendothelial+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6 (2007).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).</li></ol>

IS Cynata için kurucu ortağı ve danışmanlık yapmaktadır.

TFs aşırı ifadesi ile hPSCs hematopoietik farklılaşması için yukarıda tarif edilen yöntem olup, HESC ve böylece en fazla 30 milyon kan hücrelerinin üretimini gelen izin iPSCs gelen HE ve miyeloid ve eritropent-magakaryocytic öncüller için hızlı ve etkili bir yaklaşımı temsil etmektedir Bir milyon pluripotent kök hücreleri 10. Bu yöntem, çok sayıda HESC ve iPSCs hatları 10 tutarlı farklılık sergiledi. ETV2 ve GATA2 tarafından farklılaşma sırasında gata1 faktörleri ...

Kendini yenilemek ve kanda olmak üzere üç germ, hücre içine ayırt etmek, hematopoetik gelişim mekanik çalışmalar için onlara değerli bir araç yapmak, kan hastalıkları modellenmesi, ilaç taraması insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) benzersiz yeteneği, toksisite çalışmaları ve hücresel tedavilerin geliştirilmesi. Endotel hematopoetik geçiş 1,2 ile (HE) hemogenic endotel embriyo hasılatı kan oluşumu, kültürlerde HE nesil hematopoetik geçiş ve hematopoetik şartnameye endotelyal düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için gerekli olacaktır çünkü. HE çalışmaları için geçerli yöntem hematopoez destekleyici stromal hücreler 6,7 ya da hücre dışı olan iki boyutlu kültürlerde hPSCs hematopoietik sitokinlerin 3-5 ilavesi ile agrega (EBS) &#39;de hematoendothelial farklılaşmanın başlaması ve birlikte-kültür dayanmaktadır matrisler ve c8,9 ytokines. Bu, klasik yöntemler farklılaşma, hücre yüzeyinde hareket eden ve en sonunda hematoendothelial gelişimi yol transkripsiyonel program aktivasyonuna yol molekül yolların kaskadlar başlatılması harici sinyaller giriş dayanmaktadır. Bu nedenle, bu sistemlerde hPSCs farklılaşmalar etkinliği bu sinyallere etkili bir indüksiyonu, çekirdeğe sinyal iletimi, spesifik kopyalama düzenleyicilerinden oluşan elde edilen aktive edilmesine dayanır. Buna ek olarak, geleneksel bir farklılaşma kültürlerde HE çalışma hücre sıralama kullanarak HE hücrelerin izole edilmesi ek aşamasını gerektirmektedir. Burada, hematopoetik transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi ile HE ve kanın doğrudan indüksiyon için basit bir protokol açıklar. Bu yöntem, bir hantal hücre sıralama işlemi kullanılarak HE ayırmaya gerek olmadan, bir çanak ve hematopoietik geçiş endotelyal doğrudan gözlem HE etkin aşılanmasını da olanaklı kılar. Insan pluripotent kök hücrelerden HE oluşumu ve kan verimli bir kaç transkripsiyon faktörlerini (TF) aşırı eksprese eden indüklenebilir. HPSCs gelen sağlam pan-miyeloid hematopoeze indükleyebilen TFs optimal kombinasyonu ETV2 ve gata1 veya GATA2 içerir. Bunun aksine, GATA2 ve TAL1 kombinasyonu erythromegakaryocytopoiesis 10 neden olur. CD73 - - yavaş yavaş, erken hematopoietik markör CD43 7 ekspresyonu ile tanımlanan hematopoietik fenotipi edinebilir HE hücreleri bu faktörlerin aşırı ekspresyonu yoluyla hPSCs Programlama şirketinden The için hPSCs VE-cad + CD43 ayırır. İnsan pluripotent kök hücreleri, bir yöntem doğrudan programlanması için bu lentiviral bazlı yöntem mekanik çalışmalar, hematopoietik geçiş endotelyal çalışmaları ve hematopoietik gelişimi ve tarifnamenin transkripsiyonel düzenleme için olan HE ve kan hücrelerinin üretimi için de geçerlidir. C rağmeneçerli protokolü benzer sonuçlar modifiye mRNA 10 kullanılarak elde edilebilir transgenlerin bünyesel anlatımı ile, kan üretimini açıklar.

Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61061</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61063</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61062</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61062</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid #61064</td>
			<td>Lentiviral Vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadimethrine bromide (Polybrene)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>107689-10G</td>
			<td>Cationic polymer used to increase the efficiency of infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72302</td>
			<td>RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td rowspan="2"><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td rowspan="2">A11105-01</td>
			<td rowspan="2">Cell Dissociation Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete (growth factor- free) culture medium&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; mTeSR1 Custom formulation&#160;</td>
			<td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td>
			<td>MCF</td>
			<td><a name="RANGE!D12">Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-07</td>
			<td>Premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human TPO</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-18</td>
			<td>Research grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Premium grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD144 (VE-cad) FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560411</td>
			<td>Endothelial marker (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD226 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>338305</td>
			<td>Hematopoietic (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD43 PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560199</td>
			<td>Hematopoietic (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD73 APC</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>FAB5795A</td>
			<td>Endothelial marker (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 APC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555485</td>
			<td>Hematopoietic (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A1310</td>
			<td>Live/Dead assay (FACS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Cell fixation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284-500ML&#160;</td>
			<td>Permeabilization&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SH3007003</td>
			<td>Fetal bovine serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD43</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551457</td>
			<td>Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-human VE-cadherin</td>
			<td>BenderMedSystem</td>
			<td>BMS158</td>
			<td>Primary (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated</td>
			<td>JacksonResearch</td>
			<td>715-486-152</td>
			<td>Secondary (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated</td>
			<td>JacksonResearch</td>
			<td>715-516-150&#160;</td>
			<td>Secondary (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI nucleic acid stain</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td>D1306&#160;</td>
			<td>Live/Dead assay (IF)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>4435</td>
			<td>CFC-assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright Stain solution</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>32857</td>
			<td>Staining cytospins</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Table 2. hPSCs culture.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)&#160;</td>
			<td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td>
			<td>hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells</td>
			<td>hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete serum-free medium for culture of hPSCs&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; mTeSR1 media&#160;&#160;</td>
			<td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td>
			<td>M500&#160;</td>
			<td>Serum-free&#160; medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences/ Corning&#160;</td>
			<td>356234</td>
			<td>Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, powder&#160;</td>
			<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td>12500-062</td>
			<td>Basal Medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Dulbecco&#39;s PBS powder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>dSH30013.04</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dispase II, powder</td>
			<td rowspan="2"><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td>
			<td rowspan="2">17105-041</td>
			<td rowspan="2">Neutral protease, Cell dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.
<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Primer&#39;s Name</td>
			<td>Forward (Fwd)&#160; 5&#8217; --&#62;3&#8217;</td>
			<td>Reverse (Rev) 5&#8217;--&#62;3&#8217;</td>
			<td>Discription&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN EF1a Fwd</td>
			<td>TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA</td>
			<td>--</td>
			<td>EF1a promoter sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA1 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATA2 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAL1 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LMO2 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ETV2 Rev</td>
			<td>--</td>
			<td>GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC&#160;</td>
			<td>&#160;Coding Region&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct induction of hemogenic endothelium and blood by overexpression of transcription factors in human pluripotent stem cells

Gelişimi sırasında, hematopoietik hücreler endotel hücrelerinin özel bir alt grubundan elde edilen ortaya çıkan hemogenic endotel (HE). In vitro Modelleme HE geliştirme endotel-hematopoetik geçiş ve hematopoetik şartname mekanik çalışmalar için gereklidir. Burada, transkripsiyon faktörlerinin farklı setleri aşırı ekspresyonu yoluyla insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) için HE etkin indüksiyonu için bir yöntem tarif eder. GATA2 ve TAL1 transkripsiyon faktörlerinin bir arada eritroid ve megakaryositik potansiyeli olan HE üretimine olanak sağlar ise ETV2 ve gata1 ya GATA2 TFs kombinasyonu, pan-miyeloid potansiyeli olan HE indüklemek için kullanılır. GATA2 ve TAL1 kombinasyonu LMO2 ilavesinin farklılaşmasını hızlandırır ve eritroid ve megakaryositik hücre üretimini arttırır. Bu yöntem, hPSCs gelen HE endüksiyon etkili ve hızlı bir yol sağlar ve endotelial-hematopoieti gözlem sağlarbir kültür kabı c geçişi. Protokol hPSCs transdüksiyon usul ve HE sonrası transdüksiyon analizi ve kan atalarıdır içerir.

Bir GATA2, TAL1 +/- LMO2 kombinasyonu esas olarak eritro-megakaryositik hematopoez indükler HE ve transkripsiyon faktörlerinin aşırı ifadesi ile hPSCs kan indüksiyon şematik diyagramıdır, pan-miyeloid hematopoez indükler gata1 ya GATA2 kombinasyonu ile Şekil 1 ETV2 gösterilmiştir. Hem TF kombinasyonları doğrudan sonradan hematopoetik farklılaşma farklı bir spektrumu ile kan atalarıdır dönüştürülmüştür HE hücrelerini kaynaklı. Kana pluripotent devletten hPSCs Farklılaşma H...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Transkripsiyon Faktörleri aşırı ifadesinin doğrudan Hemogenic Endotelyumunun uyarılması ve Kan

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

direct-induction-hemogenic-endothelium-blood-overexpression

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.5K Görüntüleme.  University of Wisconsin-Madison. This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors. 

Video: Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Gelişim Biyolojisi

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

Kimyasal Güvenlik Tarama ve Sistem Biyolojisi Veri Üretimi Gelişim Toksisite Tahliller Tabanlı İnsan Pluripotent Kök Hücre

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Insan pluripotent kök hücreleri gelen melanosit besleyici içermeyen türetilmesi

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Insan pluripotent İn Vitro Farklılaşma Trofoblastik Hücreleri içine Kök Hücreler

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Periferal Kan Türevi İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrositlerin Farklılaşması

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.