Bu makalede sunulan yöntem BBSRC BB / tarafından finanse edilen çalışma ortaya çıktı I021507 / 1 (TB, RJTW) ve MRC doktora öğrencilik (MH).

Not: Bütün deneyler King College London, İngiltere ve İngiltere Home Office hayvan bakımı kurallarına uygun gerçekleştirilmiştir. E14 Serebellumunda 1. Diseksiyon <ol><li> Embriyonik Gün 14-38 ° C&#39;de kahverengi döllenmiş tavukların yumurtalarını kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Kullanımı yumurta makas ovo civciv embriyo başını kesmek ve buz PBS (Şekil 1A) içeren bir Petri baş kaldırmak. </li><li> Standart forseps kullanarak, gözleri ve üst çene kaldırma, doku içinden her gözün arkasında tüm yol kesiler yapmak. Tüm yol alt çene (Şekil 1B) çıkarılması farenks yoluyla ikinci bir kesi yapmak. </li><li> Standart forseps kullanarak, (Şekil 1C) onu uzak soyulması ile kafatası yüzeyinden tüm cilt kaldırmak ve beyin açığa frontal ve parietal kemikler çıkarın. </li><li> Ventral açıdan, yutak kıkırdak ve yardımcı mezenşimi çıkarın. </li><li> Bir dorsal itibaren dikkatlily pia ve ayrı tüm beyin (Şekil 1D) zarar vermemeye Beyin alarak bakım mezenşimin dorsal çıkarın. </li><li> Tüm yol orta beyin ve arka beyin ve beyincik (Şekil 1E) da dahil olmak üzere ayrı Beyin arasındaki doku içinden kesi yapmak. </li><li> Tüm yol beyincik ve Beyin alar levhanın her iki yanal kavşaklarında doku içinden kesiler yaparak, diseksiyon boyunca pia bütünlüğünü (Şekil 1F) korumak için özen tüm beyincik çıkarın. Oluşturan koroid pleksusu (Şekil 1G) sökün. </li><li> Buz gibi soğuk HBSS içine disseke beyincik taşıyın. </li></ol> E14 Serebellumunda 2. Dilim Kültür <ol><li> Bir spatula ya da ucu ile 3 ml&#39;lik Pasteur pipeti kullanarak Doku Chopper steril platforma bütün beyincik transfer diyafram genişletmek için kesilmiş. Bir pipet kullanarak fazla sıvıyı çıkarın. </li><li> T tüm tüm beyincik CutO maksimum% 50 bir kesim hızı ayarlamak doku kıyıcı kullanarak 300 mikron kalınlığında yönünü gerekli. Doku bütünlüğü en kolay sagital bölümde korunur; Bununla birlikte, yönlendirme hücre analizi için önemli bir husustur (granül hücre aksonları enine çalıştırırken, Purkinje hücresi dendritler sagital Purkinje hücresi dendritler düzlemine dik olan, hizalanmaktadır). </li><li> 3 ml Pasteur pipet kullanarak, buz dilimlenmiş serebellum soğuk HBSS kapsamaktadır. </li><li> Kesme ucu ile 3 mi bir Pasteur pipeti kullanılarak buz gibi soğuk taze HBSS içeren bir 60 mm Petri kabı, HBSS içinde dilimleri aktarın. </li><li> Bir fiber optik ışık kaynağı ile aydınlatılan bir mikroskop altında, saatçilik forseps kullanılarak her dilim ayrılmasını sağlamak. Dilimleri belirleyin onların doku bütünlüğü ve medio-lateral pozisyonda dayalı, electroporated edilecek. Not: kültür ortamında inkübasyon dilim yoluyla embriyo Her diseksiyon yaklaşık 10-20 dk bağlı UPO alırn deneyim. Bu cerebella Dekapitasyon ve ex vivo kültür arasındaki minimum zaman miktarda harcama sağlamak için bir seferde diseksiyonlara birini gerçekleştirin. </li></ol> Dilimleri 3. elektroporasyonu <ol><li> Yalıtım bandı ile 60 mm Petri kabı tabanına bir Elektroporatör anot sabitleme tarafından bir elektroporasyon odasını oluşturun. Elektrot karşılamak için HBSS yaklaşık 1 ml ilave edilir. </li><li> HBSS kaplı elektrodun üstünde 0,4 um kültürü eki yerleştirin. Kültür insert elektrot her zaman uç ile elektrot arasında orada temasa olduğundan emin yapma dinlenmek için izin verin. Not: Bu ayarda, dilim kültür eklemek devresini korumak ama katot mekansal hedefleme sağlayan, çözüm yüzey üzerine duracaktır. </li><li> Aktarım tespit dilimleri (kültür insert başına beş adede kadar) kesme ucu ile 3 ml Pasteur pipeti kullanarak kültür eklemek üzerine. Ayrı bir sagitt kültür insert üzerine yerleşmek için izinal yönelim. </li><li> Dilimler, artık çözelti içinde kalmış, böylece, bir pipet kullanarak, fazla HBSS çıkarın. </li><li> Bir dilim hedeflenen bölgenin yüzeyi üzerinde 20% hızlı yeşil ile seyreltildi (1 ug / ul bir konsantrasyonda) P10 pipet, pipet DNA kullanılarak. % 20 hızlı yeşil viskoz DNA çözümü sağlar ve prohibitively DNA&#39;nın geniş dağılma önler. Her bir dilim (Şekil 2B), yaklaşık 5 ul DNA / hızlı yeşil bir çözelti ekleyin. </li><li> İstediğiniz hedeflenen doku üzerinde katot yerleştirin ve 3 x 10 V, 10 msn süreli darbeleri ile electroporate. Doku ile katot doğrudan temastan kaçının. Bunun yerine, iletkenlik korumak (aslında doku dokunmadan mümkün olduğunca dokuya yakın katot yerleştirin) sıvının yüzey gerilimi yararlanın. </li><li> Istediğiniz gibi her serebellar dilim EGL birden bölgelerine DNA teslimat ve elektroporasyon tekrarlayın. </li><li> Elektroporasyon tamamlanması, devir kültür INSE üzerine30 mm Petri kabı rt. </li><li> Glikoz,% 1 B27 takviyesi, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penisilin - (+) - her bir kültür için, önceden ısıtılmış bir kültür ortamı (Basal Medium Eagle 1 ml% 0.5 (w / v) D ekleme Kültür uç ortamı ile temas halindedir, ancak dilimleri içinde banyo değildir, öyle ki kültür eklemek altında 100 ug / ml streptomisin). </li><li> Kadar 3 gün boyunca 37 ° C /% 6 CO2 kültürlerin inkübe edin. Kültür ortamı, taze, önceden ısıtılmış ortam ile, her 24 saat tüm değiştirin. </li><li> Kültür no kültür ortamı taze bir 30 mm çanak (4 ° C de veya O / N)% 4 paraformaldehid içinde 1 saat süre ile ekler kültürün ardından, dilimleri düzeltin. </li></ol> Serebellar Dilimleri 4. Görüntüleme <ol><li> Tespit sonra, PBS içinde 5 dakika boyunca dilimleri 3 kez yıkayın. </li><li> Bir jilet kullanarak, dilim etrafında kesme ve dilim ve yapıştırılan parçanın bölgesini kaldırarak kültür insert her Electroporated ve kültürlü serebellar dilim teşrih. Yapmakkültür insert yüzeyinden dilim çıkarmayı denemeyin. </li><li> Bir lamel alarak bakım altında (istenirse) DAPI içeren montaj orta yaklaşık 1 ml Mount dilimleri kabarcıkları tanıtmak için değil, ve görüntü lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılarak. Not: Görüntüleme parametreler elektropore yapılara göre farklılık ve bireysel kullanıcı takdirine edilebilir. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada rapor edilen protokol kesme electroporating ve piliç embriyonik gün 14 beyincik dilimleri kültürlenmesi için bir yöntemi anlatmaktadır. Bu protokol, bireysel serebellar lob izole hedefleme dahil EGL küçük odak bölgelerinde, elektroporasyon hedefleme sağlar. Bu yüksek çözünürlük ve kolaylık genetik analiz ve görüntüleme sağlar ve düşük maliyetle kemirgenler 43-47 kurulan tekniklere göre. Böyle bir analiz sonucu değişiklikler EGL etkileyebilir demektir uzatılmış gelişim ...

Beyincik Beyin ön ucunda oturur ve olgun beyindeki duyu ve motor işleme entegrasyonu sorumlu yanı sıra yüksek bilişsel süreçleri 1 düzenleyen olduğunu. Memeliler ve kuşlar, bu yetişkin beyindeki nöronların yarıdan fazlası ürettiği gelişimi sırasında, atalarıdır geniş geçiş amplifikasyon ürünü ayrıntılı bir morfoloji sahip ve ağır foliated edilir. Beyincik yüzyıllardır Nörobiyologlar ve moleküler çağda çalışmanın konusu olmuştur aynı şekilde önemli dikkat çekmiştir. Bu, özünde ilginç biyoloji, ama aynı zamanda ağır gibi en yaygın pediatrik beyin otizm spektrum bozuklukları 2 ve en belirgin serebellar kanser, medulloblastoma 3 gibi gelişimsel genetik bozukluklar da dahil olmak üzere insanlara hastalık bulaştıran gerçeği değil sadece ilgilidir tümör. Önemlisi, bu wh içinde mükemmel bir model sistemich beyin gelişimi 4 sırasında kaderi tahsisi ve nörogenezi incelemek için. Son yıllarda, aynı zamanda omurgalı phylogeny 5-10 arasında görülen serebellar formların büyük çeşitlilik nedeniyle, beyin gelişiminin karşılaştırmalı çalışma için bir model sistem olarak kurulmuştur. Beyincik Beyin 11&#39;de rhombomere 1 dorsal yarısından itibaren gelişir ve gelişimsel iki ana progenitör popülasyonları, eşkenar dudak ve ventriküler zon oluşur. Eşkenar dudak çatı plakası sınırındaki Beyin ve neuroepithelium dorsal bölgenin çevresinde uzanır. Bu beyincik 12-14 glutamaterjik eksitatör nöronların doğduğu yerdir. Ventriküler bölge en belirgin inhibitör GABAerjik serebellar nöronların, büyük Purkinje nöronları 14,15 yol açar. Daha sonra geliştirme (fare embriyonik gün 13.5 ila yaklaşık, civciv 16 e6), glutamaterjik ProGenitors eşkenar dudaktan teğet göç ve atalarıdır bir pial bir tabaka oluşturur: ikincil progenitör bölgesi dış granül tabakası (EGL) çağırdı. Olgun beyinde bulunan granül nöronların büyük sayılara neden kapsamlı geçiş amplifikasyon uğrar bu tabakadır. EGL çoğalma uzun hücre döngüsü çıkışı ve ortasına dış EGL katmandan kendi çıkış ile bağlantılıdır progenitörlerin nöronal farklılaşma anahtarıyla, eşkenar dörtgen şeklinde dudak 17 Tanjansiyal göç kaynaklanan alt Pial konumu ile bağlantılı olmuştur EGL 18. Medial-lateral ekseninde post-mitotik granül hücrelerinin Geniş teğet göç olgun serebellar korteksin iç granül tabakası içine son radyal göç öncesi, orta ve iç EGL 19 oluşur. Serebellar yüzey üzerinde eşkenar dudak hücrelerin göç pia 20-22 den CXCL12 sinyalizasyon bağlıdır </sup&gt; Ve granül hücrelerinin CXCL12 reseptörü CXCR4 ifade eder. Onların teğet migrasyon inhibitör interneuron popülasyonları 23-25 ​​göç neokortikal teğet o böylece anımsatıyor. Şaşırtıcı, elektron mikroskobik çalışmalar 17 proliferatif morfolojiye sahip EGL hücreleri memeli korteks 26 bazal atalarıdır anımsatan tarzda çoğalma yeteneği ile hücre davranışını bağlayan, pial temas halinde olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu 18 imzaların granül ön farklı gen ekspresyonunu sahip farklı hücre dışı durumlar tarafından tanımlanan üç alt katmanlar halinde EGL yukarıda belirtilen tabakalaşma yansıtılır. OEGL progenitörlerin Çoğalma atalarıdır bireysel genetik fare embriyonik gelişim sonunda etiketli, onlar 250-500 postmitotic g medyan ortalama doğuran şekilde klon boyutları normal dağılım oluşurranule nöronlar 27,28. Çoğalma Purkinje nöronları 29-32, altta yatan mitojenik SHH sinyallemesinin bağlıdır. SHH&#39;nin cevap verme transkripsiyon faktörünün Atoh1 hücre bağımsız ekspresyonu üzerine tamamen bağlı olduğu gösterilmiştir, in vitro ve in vivo 33 34,35 hem de. Benzer şekilde, hücre döngüsü çıkışı ve farklılaşması olasılıkla Atoh1 37 doğrudan bir bastırıcısıdır alt transkripsiyon faktörü NeuroD1 36, ifadesine bağımlı olduğu gösterilmiştir. Hücre döngüsü çıkışına 38-42 hücre biyolojik temelini çözmekte bu ilerleme ve önemli ilerleme olmasına rağmen, karar altında yatan temel moleküler mekanizma (lar) hücre döngüsünü çıkmak için bir ayırt nöron bir progenitör geçiş için, ve İç EGL de ilişkili postmitotic teğet göç yanı sıra, daha sonra anahtarradyal göç, anlaşılan eksik kalır. Bu, EGL deneysel inatçılığı büyük ölçüde: geç gelişen ve aynı nörojenik moleküllerin pek çoğu önemli önceki granül öncülerinin hayatta eşkenar paralel dudak altındadır beri genetik hedef zordur. Bu sorunu aşmak için, sayısız yazar kemirgenler 43-48 doğum sonrası beyincik hedeflemek için bir yöntem olarak in vivo ve ex vivo elektroporasyon gelişmiştir. Burada, maliyet ve kolaylık açısından önemli avantajlar temsil EGL, incelemek için civciv ex vivo elektroporasyon kullanımını öncülük. Elektroporasyon ve civciv serebellar doku ex vivo dilim kültürü Bizim yöntemi 14 civciv EGL çoğalması zirvesinde embriyonik Gün doku disseke kullanır. Bu yöntem, eşkenar dudak bağımsız EGL genetik hedefleme izin verir ve granül geçişin genetik diseksiyon için sahne koyacaktırbeyincik postmitotic granül nöron progenitör.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">McIlwain tissue chopper</td>
			<td style="width:71px;">Mickle Laboratory Engineering Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Cut at 300&#956;m for best results.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Basal Medium Eagle (Gibco)</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">41010-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4&#956;m culture insert</td>
			<td style="width:71px;">Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TSS20 Ovodyne electroporator&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Intracel</td>
			<td style="width:119px;">01-916-02</td>
			<td>Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of chick cerebellar slices and spatially targeted electroporation of granule cell precursors

Serebellar dış granül tabakası (EGL) gelişmekte olan beyinde büyük Transit büyütme site ve nöronal çoğalmasını ve farklılaşmasını çalışmak için mükemmel bir model. Buna ek olarak, çoğalma yeteneği evrimsel değişiklikler beyinciği omurgalı beynin evo-devo çalışmaları için mükemmel bir model haline amniotları serebellar büyüklükte dramatik genişleme sorumlu olmuştur. EGL kurucu hücreleri, serebellar granül ataları da, Medulloblastoma için en yaygın pediatrik nöronal tümör kökenli önemli bir hücreyi temsil etmektedir. Transit amplifikasyon ardından, granül öncüleri olgun memeli beyninde büyük nöronal nüfusu temsil beyincik iç granüler tabaka içine radyal göç. Civciv, EGL çoğalması pik gebelik ikinci hafta sonuna doğru ortaya çıkar. Bu tabakaya genetik değişimine hedeflemek içinproliferasyonunun en yüksek, embriyonik gün 14 civciv embriyolarından serebellum dilimleri ex vivo elektroporasyon yoluyla genetik manipülasyonu için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, in vivo granül nöron geliştirme birkaç önemli yönlerini özetlediği ve beyincik granül hücre çoğalması ve farklılaşması tam bir anlayış oluşturmada yararlı olacaktır ve böylece beyincik geliştirme, evrim ve hastalığın.

Bu bölüm, embriyonik gün 14 hatundan kesit elektroporasyon ve beyincik kültürü kullanılarak elde edilebilir sonuçlarının örneklerini göstermektedir. Beyincik diseksiyon Şekil 1 içinde tasvir edilmektedir ve ayarlamak elektroporasyon haznesi, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Bu başarılı in vitro (Şekil 3A), yapı ve hücresel morfolojik korumak kültür serebellar dilimleri, elektroporasyona ve mümkün olduğ...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors at JoVE.com

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Serebellar dış granül tabakası gelişmekte olan beyinde büyük Transit amplifikasyon sitedir. Burada, embriyonik Gün 14 civciv embriyolardan ex vivo elektroporasyon ve serebellar dilim kültürü kullanarak çoğalması zirvesinde bu tabakaya genetik modifikasyon hedeflemek için bir protokol mevcut.

Ex Vivo Chick Serebellar Dilimleri Kültür ve Mekansal Elektroporasyon granül hücre öncülerinin Hedefli

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

ex-vivo-culture-chick-cerebellar-slices-spatially-targeted

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

9.2K Görüntüleme.  King's College London.  Serebellar dış granül tabakası gelişmekte olan beyinde büyük Transit amplifikasyon sitedir. Burada, embriyonik Gün 14 civciv embriyolardan ex vivo elektroporasyon ve serebellar dilim kültürü kullanarak çoğalması zirvesinde bu tabakaya genetik modifikasyon hedeflemek için bir protokol mevcut. 

Video: Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir<em&gt; Eski-ovo</em&gt; Elektroporasyon Yaklaşımı

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Gelişim Biyolojisi

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Optimize<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Kalkınma Gelişmiş Aşamaları Chick Embriyolar ekimi

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head and heart progenitor cell development with pharyngeal arches (also known as branchial arches) ex vivo. Using this method, we have recently described that the second pharyngeal arch contains self-renewing heart progenitors and serves as a microenvironment for expansion of the progenitors during mouse heart development. The progenitor cells remain undifferentiated and expansive inside the arch, but quickly become functional cardiomyocytes as they migrate out of the arch. We also reported that first pharyngeal arch contains muscle progenitors giving rise to myotubes after leaving the arch. Here, we demonstrate the procedure for the dissection and ex vivo culture of first and second pharyngeal arches from developing mouse embryos. The method enables one to study head and heart progenitor/muscle development, including cardiomyocyte and myotube formation in detail ex vivo.

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Faringeal Arches Ex Vivo Kültür Kalp ve kas atalarıdır ve Bunların Niche Eğitim için

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely limits its potential. We describe here the use of mouse embryonic stem (ES) cells as surrogate cells to screen for a phenotype of interest and subsequently introduce these cells into a host embryo to develop into a living mouse carrying the phenotype. This method provides (1) a cost effective, high-throughput platform for genetic screen in mammalian cells; (2) a rapid way to identify the mutated genes and verify causality; and (3) a short-cut to develop mouse mutants directly from these selected ES cells for whole animal studies. We demonstrated the use of paraquat (PQ) to select resistant mutants and identify mutations that confer oxidative stress resistance. Other stressors or cytotoxic compounds may also be used to screen for resistant mutants to uncover novel genetic determinants of a variety of cellular stress resistance.

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &amp;#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

Stress resistance is one of the hallmarks for longevity and is known to be genetically governed. Here, we developed an unbiased high-throughput method to screen for mutations that confer stress resistance in ES cells with which to develop mouse models for longevity studies.

İleri Genetik Yaklaşım Farelerde Stres Direnci Genler ortaya çıkarmak için - ES Hücrelerde bir Yüksek verim Ekranı

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Epikardiyal dışsal gelişimi Kültürü Deneyi ve<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Epikardiyal türetilmiş Hücre Göç Değerlendirilmesi

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

CRISPR-aracılı kaybı serebellar granül işlev analizinin gen transferi Elektroporasyon tabanlı rahim içinde kullanarak hücreleri

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

Rodent placenta 'nın ex vivo perfüzyon

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its permeability, thereby allowing different molecules to be introduced to the cell. In this paper, electroporation is used to introduce plasmids to ependymoglial cells, which line the ventricular zone of the adult zebrafish telencephalon. A fraction of these cells shows stem cell properties and generates new neurons in the zebrafish brain; therefore, studying their behavior is essential to determine their roles in neurogenesis and regeneration. The introduction of plasmids via electroporation enables long-term labeling and tracking of a single ependymoglial cell. Furthermore, plasmids such as Cre recombinase or Cas9 can be delivered to single ependymoglial cells, which enables gene recombination or gene editing and provides a unique opportunity to assess the cell&#8217;s autonomous gene function in a controlled, natural environment. Finally, this detailed, step-by-step electroporation protocol is used to obtain successful introduction of plasmids into a large number of single ependymoglial cells.

Presented here is an electroporation method for plasmid DNA delivery and ependymoglial cell labeling in the adult zebrafish telencephalon. This protocol is a quick and efficient method to visualize and trace individual ependymoglial cells and opens up new possibilities to apply electroporation to a broad range of genetic manipulations.

Yetişkin Zebrafish Telencephalon Plazmid DNA In Vivo Teslim için Elektroporasyon Yöntemi

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...