Yazarlar utero elektroporasyon teknoloji CS laboratuar kurulması Eva Hadzimova Pierre Mattar ve Christopher Kovaç ilk çalışma için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü (CIHR) hibe (MOP 44.094) ve CS ve bir Alberta Çocuk Hastanesi Araştırma Vakfı Hibe DMK Takım Grant (00.933-000) Gelişmekte olan CIHR / Hazırlık Mücadele Körlük (FFB) tarafından finanse edildi. RD CIHR Kanada Umut Bursu tarafından desteklenen, RC FFB Bursu tarafından desteklenen ve LML Genetik CIHR Eğitim Grant ve Çocuk Gelişimi tarafından desteklenmiştir.

1. Set-up <ol><li> Set-up cerrahi alanında Şek. 1A, A &#39;. Set-up anahtar bileşenleri, iğne tutucu, Leica steromicroscope, fiber optik aydınlatma sistemi, elektrotlar ile ECM 830 Kare Dalga Elektroporasyon Sistem, ısıtma yastığı ve isofluran anestetik bir buharlaştırıcı Narishige mikromanipülatör bir Eppendorf FemtoJet mikroenjektör içerir. </li><li> Tüm aletleri, cerrahi aletler sonicating için Metriclean2 Düşük köpük çözüm kullanarak Bransonic Ultrasonik Temizleyici ile temizleyin. Otoklavlayarak araçları sterilize edin. Steril araçları sonra Germex tutulur. </li><li> Şırınga ılık steril serum fizyolojik ve steril Laktatlı Ringer çözeltisi ile hazırlayın. </li></ol> 2. Anestezi <ol><li> Küçük (12cm x 20cm) anestezi kamara içinde Yeri hayvan. Buharlaştırıcı kullanarak, 1L/min (Şekil 1A, A &#39;)% 5 isofluran anestetik ve oksijen sağlar. Özellikle, bir atma sistemi kullanarak izofluran egzoz toplamak için önemlidir. </li><li> Hayvan solunum derin ve düzenli hale odasından çıkarın. , Burun pinching ve göz kırpma refleks testleri, tam bir anestezi sağlamak için kullanılır. </li><li> Bir ısıtma yastığı (37 ° C) üst sırtını hamile fare yerleştirin. % 70 etanol ile silerek ilk ısıtma yastığı sterilize edilmiştir ve daha sonra steril lintless bir gazlı bez ile kaplıdır. Bir solunum tüpü ve maske (% 2.25) ameliyat sırasında izofluran sunmak aparat kullanın. </li><li> Buprenorfin (0.1mg/kg vücut ağırlığı) subkütan boynun ense deri altına enjekte edilir. </li><li> Derin ve düzenli nefes almayı için ameliyat boyunca hayvan izleyin. Hayvan, gasp, basık veya hızlı nefes olmamalıdır. Sığ, hızlı nefes alıp verme, hafif anestezi bir işareti olabilir, ve izofluran akışının artırılması gerekmektedir. Hayvan gasp başlarsa, izofluran akışını azaltır. Solunum durması durumunda, izofluran kapatın ve hayvan iyileşene kadar oksijen akışını artırmak. Daha düşük bir konsantrasyonda izofluran yeniden başlatın. </li></ol> 3. Cerrahi Hayvan Hazırlama <ol><li> Teyp, ısıtma yastığı hayvan ön ayakları ve künt forseps ile ayağın arka kısma bir retraksiyon yanıt için tekrar kontrol edin. </li><li> Kullanarak, steril bir pamuk uçlu çubukla, karın üzerine tüy dökücü krem ​​kalın bir tabaka (yani, Nair) yayıldı. Firma vuruş, underfur tamamen kaplanmış sağlar. Steril bir epilasyon için temiz bir bez ile aralıklı kontrol, ortalama üç dakika bekletin. Steril bir gazlı bez steril su ile ıslatın ve tüm izlerini gitmiş kadar karın silin. Su klorheksidin (yani, Stanhexidine) cildin daha temiz ve daha tekrarlayın. Karın, temiz, steril gazlı bez ile kurulayın. </li><li> Kesi yeri, daha steril su ile takip bir klorheksidin (yani, Stanhexidine) ile sterilize edin. Karın, temiz, steril gazlı bez ile kurulayın. % 70 etanol ve temiz, steril bir pamuklu çubukla kullanarak bu adımı yineleyin. </li><li> Steril bir gazlı bezle rahim boynuzları ameliyat sırasında çekilmiş olacak ortasında bir yarık ile karın üzerine yerleştirin. </li></ol> 4. İnsizyon ve Rahim Horns maruz kalması <ol><li> Rahim boynuzları göstermek için, ilk, orta hatta cilt altında soluk bir çizgi olarak linea alba bulun. Forseps kullanarak, karın duvarı uzak deri çekin ve cilt makas (yaklaşık 1 cm uzunluğunda) ile orta karın aşağıya doğru küçük, düz bir kesi kesmek. </li><li> Kavisli bir forseps ve makas kullanarak, periton işlemi tekrarlayın. </li><li> Üzerinde küçük bir kesi dikey yarık ile steril gazlı bez koyun ve ısınmış steril tuzlu su ile nemlendirin. </li><li> Kesi forseps Slayt ve rahim bulun. Uterin boynuz çıkarırken forseps ile açık kesi tutun. </li><li> Dikkatli bir şekilde birinci ve ikinci görünen embriyoları arasında rahim kavramak ve embriyolar gazlı bez üzerine çekin. Steril gazlı bez üzerine yerleştirerek uterus boynuzu her iki tarafını kaldırın ve herhangi bir rezorbsiyonlar ya da &quot;sağlıksız&quot; (örneğin daha küçük vücut büyüklüğü) embriyolar belirterek, embriyo sayısını. Serum fizyolojik ile rahim boynuzları Islak ve dikkatli bir rahim karın içine yarım dönüş. </li></ol> 5. Ventrikül içine DNA enjeksiyonu <ol><li> Cerrahi iğneler, kılcal damarları ile borosilikat mikropipetler kullanarak Sutter Flaming Mikropipet Çektirme hazırlanır (Program: ısı = 750, = 30 çekin, Vel = 90, Zaman = 150) . Iğne ucu steril bir neşter bıçak kullanarak, 45 derecelik bir açıyla yavaşça kazınıyor. </li><li> Iğne yüklemek için, Pasteur pipetler bir alev altında dar bir çap çekti. % 0.01 metil yeşil karışık 3mg/ml endotoksin içermeyen DNA ~ 10 ul (metil yeşil boya DNA enjeksiyonları görüntülenebilmekte sağlar unutmayın). Ağızlık çizmek için yükleme pipet bağlı Dolu iğne daha sonra bir mikromanipülatör stand üzerine monte edilir ve enjektör FemtoJet&#39;te bağlı. </li><li> Yumurtalığa yakın embriyo ile başlayarak, dairesel forsepsenjeksiyonları bir rostral kaudal yönde gerçekleşmesini sağlayan, &quot;yüzü ileri konumlandırılmış böylece hafifçe desidua içinde embriyo açmak için kullanılır. Aydınlatma için fiber optik ışık kaynağı, rostral bölgelerde büyük lateral ventriküller (Şekil 1B, B &#39;) ile çevrili olan embriyonik beyin, orta hat görselleştirmek yardımcı olmak için kullanılır. </li><li> Embriyo dairesel forseps kullanarak pozisyonda tutulur. Beyin girdiği açısı yaklaşık 45 derece olacak şekilde iğne rahim yukarıda konumlandırılmış. Mikromanipülatör, hızlı ve kararlı hareket kullanarak, iğne ucu rahim duvarına ve embriyonun lateral ventrikül içine sokulur. Enjeksiyonlar lateral ventriküller, 3. ventrikül veya sırasıyla telencephalon diensefalon ve retina, hedef subretinal alana doğru yönlendirilir. DNA lateral ventriküller içine enjekte 3. ventrikül içine akacaktır böyle erken embriyonik aşamada embriyonik beyin veziküller açık olduğunu unutmayın. </li><li> Eppendorf FemtoJet mikroenjektör kullanarak endotoksin DNA (1-3 mcL) enjekte etmek için ayak pedalına basın. Başarılı bir enjeksiyon metil yeşil boya embriyonik beyin ventriküller boyunca yayarak kolayca görüntülenmiştir. Iğne kırılmaları önlemek için geri çekerek daha sonra yavaş yavaş kaldırılır. </li></ol> 6. Elektroporasyon <ol><li> Enjekte embriyonun rahim içinde (hala), annenin karın ve ısınmış tuzlu su ile iyice ıslak örten steril gazlı bez yerleştirilir. Lütfen dikkat ** membran yüzeyine tuzlu su yanı sıra verimli bir elektrik akımının geçmesine izin esastır. </li><li> DNA enjeksiyonu takiben rahim kavrama GenePaddle elektrotlar kullanılır. 40-50V ve 50 ms beş kare elektrik darbeleri ECM8300 BTX elektroporasyon sistemi (Şekil 1C, C &#39;) kullanarak saniyede bir darbe hızında teslim edilir. </li><li> Enjekte / electroporated embriyo koruyucu ıslak bir gazlı bez ile örtün ve bir sonraki embriyo devam edin. </li><li> İstenen tüm embriyoların enjeksiyon / elektroporasyon tamamlanmasından sonra dikkatli bir şekilde karın (Şekil 1D) rahim boynuzları geri itin. </li><li> Diğer uterin horn dikkatlice çıkarın ve yumurtalık yakın embriyo yeniden başlar. </li></ol> 7. Sütür ve Zımbalama <ol><li> Tüm embriyolar geri rahim içinde, karın boşluğuna ~ 2-3 ml ılık tuzlu su ekleyin. </li><li> Yarayı kapatmak için gazlı bez karın kaldırılması ve periton iki tespit başlar. Periton sütür örgülü siyah ipek satırını kullanarak başlayın. Bu genellikle zayıf ve ameliyat sonrası kanama ve enfeksiyona yol açabilir, bu işlem için sütür kullanmak için tavsiye edilmez. Sternumun en yakın periton hattı Çapa ve çapa uzak dikiş geçin. Tüm dikişler sıkı ve altta yatan organ veya cilt yanlışlıkla periton içine dikili olmuştur olun. Klip ve kalan dikiş hattı atın. </li><li> Forseps ile dikiş hattı üzerinden çekin cilt kapalı. 9 mm Reflex ™ deri kapatma zımba, zımba dikiş hattı altında umurumda değil alarak, cilt üzerinde yara klip, ya da çok sıkı cilt çekin. Tercih edilen yöntem, forseps ile vücuttan deri ve uzak tutun ve zımba aracı ile 90 derecelik bir açıyla gelir. Yara kapanana kadar devam edin (yaklaşık üç zımba). Bittiği zaman, zımba yavaşça dikiş aracı (Şekil 1D) ile birlikte basarak sıkı olduğundan emin olun. </li></ol> 8. Post-cerrahi Bakımı <ol><li> Anestezik kurtarma izlemek için, kadın midesinin üzerine çevirin ve kapalı izofluran açmak. Solunum cihazı içindeki hayvanın yüz tutulması, anestezi kurtarma yardımcı olmak için% 3 oksijen açmak. Hayvan hipotermi önlemek için ısıtma yastığı üstüne temiz, kuru bir gazlı bez konulmalıdır. </li><li> Hayvan sersemlemiş olsa da, hayvanın boynuna cilt altında subkutan 2 ml Ringer solüsyonu enjekte edilir. </li><li> Hayvan canlandırmak amacıyla birkaç dakika ve ısınma gazlı bez için oksijen akışı altında hayvan tutarak devam edin. Normal bir solunum paterni döner hayvan hareketinin Kısa hamlelerle dikkat edilmelidir. Hayvan bilinçli ve uyanık görünene kadar birkaç dakika süreyle uyun. </li><li> Kadın Gentamisin sprey ile karın Sprey ve hayvan steril bir gazlı bezle sarın. </li><li> Hayvan otoklavlanmış yatak ve karton konut ile steril bir kafes içine aktarın. </li><li> Su şişeleri iyice temizlenir, steril ve steril su ile dolu olmalıdır. Su için 500 mL, 2 mL sulfametazin antibiyotik (% 25 hisse senedi) ekleyin. </li><li> 0.05 mg / kg buprenorfin subkutan sabah cerrahi sonrası yönetme. </li><li> Kadın ameliyat sonrası ilk 24 saat için yakından izleyin. Hayvanların 24 saat daha uzun süre tutulur, kadınlarda yeni ster taşınır2 gün ile kafesleri. </li></ol> 9 - Temsilcisi Sonuçlar Neokorteks Neokorteks, görsel ve sensorimotor işleme ve daha yüksek bilişsel işlevler sorumlu CNS bölgedir. Sırasıyla dorsal ve ventral telencephalon türetilmiştir glutamaterjik projeksiyon nöronları ve GABAerjik internöronlar oluşur. Neokortikal gelişiminde farklı genlerin rolleri ele almak için, ya misexpress utero elektroporasyon kullanımı ya da dorsal veya ventral telencephalon 1,3,4 farklı genler ifade bloğu (yani, shRNA yapıları kullanımı yoluyla). Embriyonik telencephalon genler misexpress için, biz, bir CMV βactin organizatörü geliştirici ve bir iç ribozom giriş yeri (IRES) gelişmiş yeşil flüoresan protein içeren bir bicistronic ifade vektör (pCIG2) kullanımı (EGFP; pCIG2) kaset, transfekte izin hücreleri Epifloresans (Şekil 2A-C) tarafından tespit edilmesi. Biz E11.5 E15.5 (Şekil 2 gösterildiği gibi veri E12.5) telencephalon ifade yapıları tanıtmak için bu teknolojiyi kullandı. Embriyolar birkaç gün sonrası elektroporasyon geliştirmek izin vererek, GFP etiketli atalarıdır farklılaşma ve göç takip edebiliyoruz. Farklılaşması devam ederken, 3 gün, post-elektroporasyon GFP + hücrelerin ayırt etmek ve ventriküler zon (vz), subventricular bölgesi (SVZ) ve ara bölge (iz) ve kortikal plaka (cp; Şekil 2C) içine dışına göç . , Bazal atalarıdır (yani Tbr2; E12.5 az electroporated 24 saat sonra beyinleri analiz yapıyorsanız, biz progenitör olgunlaşması ve nöronal göç apikal atalarıdır belirteçleri ile birlikte-etiketleme (Şekil 2A, yani Pax6) tarafından önceki olaylar izleyebilir; Şekil 2B) ve postmitotic neokortikal nöronların (yani, Tbr1 Şekil 2C). Diencephalon Hipotalamus, endokrin ve otonom sinir sistemi arasında bir ağ geçidi olarak merkezi sinir sistemi ve işlevleri ventral dibinde yatıyor. Gelişimi sırasında, olgun hipotalamus makyaj çoklu çekirdeklerin ortak bir progenitör bölgesi ayırt embriyonik diensefalon ventral en bölge bu satırları. Şu anda, progenitör hücre çoğalması, nöronal farklılaşma ve hipotalamik çekirdeğinin oluşumunu düzenleyen moleküler yollar tam olarak anlaşılamamıştır. E12 embryos.We 3. ventrikül içine DNA enjekte edilerek embriyonik diensefalon muhabiri gen ekspresyonu hedef utero elektroporasyon kullanılan E14 nöronların ayırt GFP dağılımı izledi. Bu metodoloji ile, başarıyla talamus, pre-talamus ve hipotalamus (Şekil 3A), GFP ifade hedeflediğiniz. Koronal bölümleri Analizi başarıyla GFP ifade progenitör hücrelerin hedef olduğunu ortaya koymaktadır 3. ventrikül ve nöronların çekirdekleri oluşturmak için manto bölge dışına göç hattı ventriküler bölgesi (Şekil 3B) Retina Retina gözün sinir tabakası, beyne iletilen elektrik impulsları ışık fotonları dönüştürmek için sorumludur. Bu embriyonik diensefalon outpocketing olarak gelişir ve bu nedenle, nöral tüp türetilmiştir. Nöral retina subretinal alan, baş mezenşimin göz ayıran boşluğuna bitişik yatıyor apikal progenitör bölmesi geliştirir. Bu nedenle retina atalarıdır DNA yapıları Hedefleme küçük bir hedef alana bu enjeksiyonları yapılır gerektirir. Mikromanipülatörler kullanarak, başarılı bir şekilde (Şekil 4 gösterildiği mCherry muhabiri ile PCIC E15.5 electroporations) E13.5 E15.5 için embriyolar bu küçük bir alanda hedef başardık. ; Electroporated retinae 24 saat sonrası transfeksiyon incelendiğinde ise, en mCherry + hücreleri dış neuroblast bölünmesi atalarıdır bulunmaktadır katmanı (onbl), ve retina ganglion hücre tabakası (inset görüntü GCL) bulunmaktadır gözlemlemek postmitotic hücreleri yerelleştirilmesine. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. Utero elektroporasyon set-up ve metodoloji Giriş (A), cerrahi set-up anahtar bileşenleri bir Eppendorf FemtoJet mikroenjektör (1), iğne tutucu (2) Narishige mikromanipülatör, Leica steromicroscope (3), fiber optik aydınlatma sistemi (4), elektrotlar (5) ve ısıtma yastığı (6) ile ECM 830 Kare Dalga Elektroporasyon Sistemi. (A &#39;) hayvan isofluran anestetik bir buharlaştırıcı kullanılarak anestezi. (B, B &#39;) Kısaca, anestezi sonra, rahim boynuzları maruz kalan ve hızlı yeşil karışık DNA embriyonik beyin veziküller içine enjekte edilir. Başarılı bir enjeksiyon hızlı yeşil boya (B &#39;) takip ederek görüntülenmiştir. DNA başarıyla enjekte edildikten sonra (C, C &#39;), rahim, positi iki tarafında, kürek elektrotlar yerleştirilirDNA seçim beyin bölgeye pozitif kutbu doğru çekilecektir, böylece embriyo oning. (D, D &#39;) istenilen tüm embriyolar enjekte sonra, rahim karın (D) içine itilir, periton sütüre edilir ve deri (D zımbalanmalı&#39;). Hamile kadın daha sonra kurtarmak için izin verilir ve electroporated yavrular istenilen zaman noktalarda toplanmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2. PCIG2 ile E12.5 electroporated bir E13.5 dorsal telencephalon aracılığıyla koronal bölümünün dorsal telencephalic elektroporasyon Temsilcisi örnek (AC) yüzey elde. Electroporated GFP + hücreler apikal atalarıdır belirteçleri ifade analiz (Pax6 +, kırmızı, A), bazal atalarıdır (Tbr2 +, kırmızı, B) ve postmitotic nöron (Tbr1 +, kırmızı, C). cp, kortikal plaka; SVZ, subventricular bölge, vz, ventriküler bölge. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3. Diensefalik elektroporasyon Temsilcisi örnek (A) pCIG2 ile E12 electroporated olmuştur, E14 beynin ventral görünüm. GFP Epifloresans talamus görünür, ön-talamus ve hipotalamus, 3. ventrikül boyunca plazmid microinjected pCIG2 yayılmasını gösteren. Electroporated beyin ile koronal bölümünde (B) yüzey elde GFP göç gösteren + ventrikül bölgesi ve hipotalamik çekirdekleri oluşturacak manto bölgesi, içine hücreleri. 3V, üçüncü ventrikül; T, talamus; Hy, hipotalamus, mz, manto bölge; Telefon, telencephalon; Pret, prethalamus; vz, ventriküler dilimi. <img src="/files/ftp_upload/2957/2957fig4.jpg" alt="Şekil 4"/> Şekil 4. Retina elektroporasyon Temsilcisi örneğidir. MCherry + hücrelerin dış neuroblast tabakası birikimi gösteren E15.5 PCIC ile electroporated bir E16.5 göz ile koronal bölümünde değil Brn3b + retina ganglion hücrelerinin ganglion hücre tabakası. Içerlek kutulu alanda daha yüksek bir büyütme görüntü. GCL, retina ganglion hücre tabakası, le, lens; onbl, dış neuroblast katmanı; yeniden, retina.

<ol>
	<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos.">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li><li>Langevin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validating+in+utero+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+gene+regulatory+elements+in+the+murine+telencephalon.+Dev+Dyn+236.">Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236.</a> , 1273-1286 (2007).</li><li>Mattar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+helix-loop-helix+transcription+factors+cooperate+to+specify+a+cortical+projection+neuron+identity.">Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity.</a> Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).</li><li>Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-+and+loss-of-function+in+chick+embryos+by+electroporation.">Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation.</a> Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).</li><li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system.">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li><li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation.">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).</li><li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus.">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li><li>Vue, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice.">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li><li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice:+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections.">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).</li><li>Buffo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+pattern+of+the+transcription+factor+Olig2+in+response+to+brain+injuries:+implications+for+neuronal+repair.">Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).</li></ol>

In utero elektroporasyon, gelişimsel süreçlerini geniş bir yelpazede analiz etmek için kullanılır . Örneğin, GFP, mCherry veya alkali fosfataz gibi muhabir genlerin transfeksiyon soy izleme ve nöronal göç deneyler yapmak için kullanılabilir. Alternatif olarak, Cre recombinase geçici seçici floxed allel bir mekansal ve / veya geçici olarak kontrollü bir şekilde ortadan kaldırmak için ifade edilebilir. Ayrıca, shRNA veya dominant negatif yapıları demonte hedef genin fonksiyonu electroporat...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog Numarası </th><th> Kategori </th></tr><tr><td> Güzel makas </td><td> Güzel Bilim Araçlar A.Ş. </td><td> 14078-10 </td><td> Cerrahi Aletler </td></tr><tr><td> Kavisli Iris makas, </td><td> Güzel Bilim Araçlar A.Ş. </td><td> 14061-10 </td><td> Cerrahi Aletler </td></tr><tr><td> Olsen-Hegar Ex-Hassas İğne Tutucu </td><td> Güzel Bilim Araçlar A.Ş. </td><td> 12002-12 </td><td> Cerrahi Aletler </td></tr><tr><td> Halka forseps, 9mm </td><td> Güzel Bilim Araçlar A.Ş. </td><td> 11103-09 </td><td> Cerrahi Aletler </td></tr><tr><td> Göz soyunma forsepsle </td><td> Güzel Bilim Araçlar A.Ş. </td><td> 11051-10 </td><td> Cerrahi Aletler </td></tr><tr><td> Dumont # 7 DMX forsepsle </td><td> Güzel Bilim Araçlar A.Ş. </td><td> 11271-30 </td><td> Cerrahi Aletler </td></tr><tr><td> Dumont # 5 DMX forsepsle </td><td> Güzel Bilim Araçlar A.Ş. </td><td> 11251-30 </td><td> Cerrahi Aletler </td></tr><tr><td> Doku forsepsle-Adson </td><td> Güzel Bilim Araçlar A.Ş. </td><td> 11027-12 </td><td> Cerrahi Aletler </td></tr><tr><td> Refleks Klip tabancasına </td><td> Dünya Hassas Çalgı </td><td> 500343 </td><td> Cerrahi Aletler </td></tr><tr><td> Delikli Kaşık, 15 mm çap </td><td> Güzel Bilim Araçlar A.Ş. </td><td> 10370-18 </td><td> Cerrahi Aletler </td></tr><tr><td> AutoCLIP Remover </td><td> Mikron </td><td> 427637 </td><td> Cerrahi Aletler </td></tr><tr><td> İpek Siyah Örgülü Sütur </td><td> Ethicon Inc. </td><td> K871 </td><td> Cerrahi Aletler </td></tr><tr><td> Reflex Cilt Kapatma Paslanmaz Çelik Yara Klipler </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 500346 </td><td> Cerrahi Aletler </td></tr><tr><td> ECM 830 Kare Dalga Elektroporasyon Sistemi </td><td> VWR-CanLab </td><td> 58018-004 </td><td> Enstrümanlar </td></tr><tr><td> Cımbız w / Değişken Gap Turu 2 5mm Platin Plaka Elektrod </td><td> Protech Uluslararası Inc. </td><td> CUY650P5 </td><td> Enstrümanlar </td></tr><tr><td> Cımbız w / Değişken Gap Turu 2 7mm Platin Plaka Elektrod </td><td> Protech Uluslararası Inc. </td><td> CUY650P7 </td><td> Enstrümanlar </td></tr><tr><td> Eppendorf FemtoJet mikroenjektör </td><td> VWR CanLab </td><td> CA62111-488 </td><td> Enstrümanlar </td></tr><tr><td> Eppendorf FemtoJet mikroenjektör Ayak Kontrolü </td><td> VWR CanLab </td><td> CAACCESS (Misc) </td><td> Enstrümanlar </td></tr><tr><td> Bransonic Ultrasonik Temizleyici Model 1510R-DTH </td><td> VWR CanLab </td><td> CA33995-534 NKP-952-118 </td><td> Enstrümanlar </td></tr><tr><td> Sutter P97 mikropipet Çektirme </td><td> Sutter Enstrüman, Carsen Group Inc. </td><td> P-97 </td><td> Enstrümanlar </td></tr><tr><td> Mikropipetler - Borosilikat filament OD: 1mm, ID: 0.78 mm, 10 cm uzunluğunda </td><td> Sutter Enstrüman </td><td> BF100-78-10 </td><td> Enstrümanlar </td></tr><tr><td> 3-Eksen Kaba Manipulator </td><td> Carl Zeiss Canada Inc. </td><td> M-152 </td><td> Enstrümanlar </td></tr><tr><td> Mikromanipülatör için manyetik Holding Aygıt </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> M1 </td><td> Enstrümanlar </td></tr><tr><td> Mikromanipülatör Çelik Üst Tabla </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 5052 </td><td> Enstrümanlar </td></tr><tr><td> Mikropipet Tutucu </td><td> Dünya Precision Aletleri </td><td> MPH3 </td><td> Enstrümanlar </td></tr><tr><td> Mikropipet Saplı </td><td> Dünya Hassas Aletler </td><td> 5444 </td><td> Enstrümanlar </td></tr><tr><td> Stereomikroskopta </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td> Enstrümanlar </td></tr><tr><td> Isofluran anestetik için Buharlaştırıcı </td><td> Porter Instruments Company </td><td> MODEL 100-F </td><td> Enstrümanlar </td></tr><tr><td> Cerrahi aletler sonicating için Metriclean2 Düşük köpük çözüm </td><td> METREX Araştırma Şirketi </td><td> 10-8100 </td><td> Cerrahi Reaktifler </td></tr><tr><td> Sütür sonra 0.2 g metilen mavisi antibiyotik sprey Gentamisin 40mg/ml </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1264 </td><td> Cerrahi Reaktifler </td></tr><tr><td> Cerrahi aletler sterilizasyon için Germex </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00141569 </td><td> Cerrahi Reaktifler </td></tr><tr><td> BNP Oftalmik merhem </td><td> Vétoquinol </td><td> DIN # 00516414 </td><td> Cerrahi Reaktifler </td></tr><tr><td> Nair ® </td><td> Church &amp; Dwight A.Ş. tarafından dağıtılan </td><td> piyasada bulunan </td><td> Cerrahi Reaktifler </td></tr><tr><td> Stanhexidine% 4 w / v cilt temizleyici </td><td> Omega Laboratories Inc. </td><td> 01938983 </td><td> Cerrahi Reaktifler </td></tr><tr><td> Buprenorfin (Temgesic) analjezik </td><td> Schering-Plough </td><td> 531-535 </td><td> Cerrahi Reaktifler </td></tr><tr><td> Sülfa &quot;25&quot; sulphamethazine oral antibiyotik </td><td> Profesyonel Veteriner Laboratuvarları </td><td> DIN # 00308218 </td><td> Cerrahi Reaktifler </td></tr><tr><td> Ringer Çözümü </td><td> Baxter Corporation&#39;ın </td><td> DIN # 0061085 </td><td> Cerrahi Reaktifler </td></tr><tr><td> Tuzlu -% 0.9 sodyum klorür </td><td> B-Braun Medical Inc. </td><td> DIN # 01924303 </td><td> Cerrahi Reaktifler </td></tr><tr><td> Soluma Anestezik - İsofluranın USP </td><td> Kanada A.Ş. İlaç Ortaklar </td><td> DIN # 02237518 </td><td> Cerrahi Reaktifler </td></tr><tr><td> Hızlı Yeşil FCF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F7252 </td><td> Cerrahi Reaktifler </td></tr></tbody></table>

efficient gene delivery into multiple cns territories using in utero electroporation

Birden fazla gelişimsel yolların aydınlatılmasında yol açan gen ekspresyonu manipüle etme yeteneği, günümüz deneysel embriyoloji taşıdır. Birçok güçlü ve iyi kurulmuş transgenik teknolojiler, hem kaybı ve fonksiyon-kazanç modellerinin üretimi için izin, farenin gen ekspresyon düzeyleri işlemek için kullanılabilir. Ancak, transgenik fare üretimi hem masraflı ve zaman alıcı. Bu nedenle, gen manipülasyonunun Alternatif yöntemler yaygın olarak aranmış var. Uterus içinde elektroporasyon gen teslim başarıyla 3,4 adapte olduğunu canlı fare embriyoları 1,2 içine bir yöntemdir. Bu büyük ölçüde, yaygın olarak civciv 5 kullanılan ovo elektroporasyon teknolojileri alanında başarısı üzerine dayanır. Kısaca, DNA, hücre içine DNA alımı için izin gelişmekte olan beyin ve bir elektrik akımı nedenleri, hücre zarlarında geçici gözeneklerin oluşumunu uygulama açık ventriküller içine enjekte edilir. Bizim ellerde, genç embriyoların hedefleme ultrason kılavuzluğunda mikroenjeksiyon protokol, daha önce 6 açıklanan gerektirecektir embriyolar verimli, erken embriyonik gün (E) 11,5 olarak electroporated olabilir. Tersine, E15.5 parietal ve frontal kemik farklılaşma, beyin içine mikroenjeksiyon engellemektedir başlama nedeniyle kolayca electroporate son aşamasında,. Buna karşılık, retina embriyogenezisin sonuna kadar erişilebilir. Embriyolar embriyonik ya da erken doğum sonrası dönemi boyunca, herhangi bir zaman noktasında toplanabilir. Enjeksiyon bir muhabir inşa transfekte hücreler belirlenmesini kolaylaştırır. Bugüne kadar, utero elektroporasyon en yaygın neokortikal geliştirme 1,2,3,4 analizi için kullanılır olmuştur. Daha yeni çalışmalarda embriyonik retina 7,8,9 ve 10,11,12 talamus hedef var. Burada, bir embriyonik MSS farklı etki hedef kolayca adapte edilebilir utero elektroporasyon protokolde güncellenmiştir sunuyoruz. Biz bu tekniği kullanarak, embriyonik telencephalon, diensefalon ve retina hedef olduğunu kanıtlar. Ilk lateral ventriküller içine DNA ifade yapıları tanıtmak için bu tekniğin kullanımını gösteren, bize embriyonik telencephalon progenitör olgunlaşma, farklılaşma ve göç izlemenize olanak veren Temsilcisi sonuçları sunulmuştur. Ayrıca göç güzergâhları takip edilmesi diensefalik çekirdekleri nöronların ayırt izin vererek, bu teknik, 3. ventrikül çevresindeki diensefalik toprakları DNA hedef kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Son olarak, biz, bize retina gelişimi üzerinde gen ekspresyonu manipüle etkilerini analiz etmek izin veren, mikromanipülatörler kullanımı bize doğru subretinal alan da dahil olmak üzere küçük hedef alanlar, içine DNA yapıları tanıtmak için izin verdiğini göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation at JoVE.com

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Verimli kullanarak birden çok CNS Topraklar&#39;da Gen Teslimat In Utero Elektroporasyon

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

efficient-gene-delivery-into-multiple-cns-territories-using-utero

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

19.7K Görüntüleme.  University of Calgary. Utero elektroporasyon gelişmekte olan merkezi sinir sistemi (MSS) bir mekansal ve zamansal olarak kontrollü bir şekilde hızlı bir gen teslimat için izin verir. Burada son derece uyarlanabilir tarif telencephalon diensefalon ve retina da dahil olmak üzere birden fazla embriyonik MSS etki alanı ifade yapıları sunmak için kullanılabilir utero elektroporasyon protokol.

Video: Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. However, because the uterine wall is opaque during early embryogenesis, the ability to target specific parts of the embryo for microinjection is greatly limited. Fortunately, high-frequency ultrasound imaging permits the generation of images that can be used in real time to guide a microinjection needle into the embryonic region of interest. Here we describe the use of such imaging to guide the injection of retroviral vectors into the ventricular system of the mouse forebrain at embryonic day (E) 9.5. This method uses a laparotomy to permit access to the uterine horns, and a specially designed plate that permits host embryos to be bathed in saline while they are imaged and injected. Successful surgeries often result in most or all of the injected embryos surviving to any subsequent time point of interest (embryonically or postnatally). The principles described here can be used with slight modifications to perform injections into the amnionic fluid of E8.5 embryos (thereby permitting infection along the anterior posterior extent of the neural tube, which has not yet closed), or into the ventricular system of the brain at E10.5/11.5. Furthermore, at mid-neurogenic ages (~E13.5), ultrasound imaging can be used direct injection into specific brain regions for viral infection or cell transplantation. The use of ultrasound imaging to guide in utero injections in mice is a very powerful technique that permits the molecular and cellular manipulation of mouse embryos in ways that would otherwise be exceptionally difficult if not impossible.

Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development. Here we describe the use of high-frequency ultrasound imaging to guide the injection of retroviral vectors into the mouse brain at embryonic day (E) 9.5.

Fare önbeyin içine Ultrason Rehberliğinde Mikroenjeksiyon In Utero E9.5 az

In utero survival surgery in mice permits the molecular manipulation of gene expression during development.  However, because the uterine wall is opaque ...

Nörobilim

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals are not viable in those cases where the modified gene is expressed or deleted in the whole organism. Moreover, a variety of compensatory mechanisms often make it difficult to interpret the results. The compensatory effects can be alleviated by either timing the gene expression or limiting the amount of transfected cells.
The method of postnatal non-ventricular microinjection and in vivo electroporation allows targeted delivery of genes, siRNA or dye molecules directly to a small region of interest in the newborn rodent brain. In contrast to conventional ventricular injection technique, this method allows transfection of non-migratory cell types. Animals transfected by means of the method described here can be used, for example, for two-photon in vivo imaging or in electrophysiological experiments on acute brain slices.

This protocol describes a non-viral method of delivery of genetic constructs to a certain area of living rodent brain. The method consists of plasmid preparation, micropipette fabrication, neonatal rat pup surgery, microinjection of the construct, and in vivo electroporation.

Non-ventriküler Plazmid Enjeksiyon ve Elektroporasyon Postnatal Rat Beyin Gen Teslimat

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Topikal Transgenik Rats nesil tarafından<em&gt; Utero</em&gt; Elektroporasyon ve<em&gt; In vivo</em&gt; Biyoparlaklık Eleme

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous substances into the brain. These exogenous substances may induce injurious impact or constitute therapeutic strategy. The most common delivery methods of exogenous substances into the brain are based on systemic deliveries, such as subcutaneous or intravenous routes. Although commonly used, these approaches have several limitations, including low delivery efficacy into the brain. In contrast, surgical methods that locally deliver substances into the CNS are more specific and prevent the uptake of the exogenous substances by other organs. Several surgical methods for CNS delivery are available; however, they tend to be very traumatic. Here, we describe a mouse infusion microsurgery technique, which effectively delivers substances into the brain via the internal carotid artery, with minimal trauma and no interference with normal CNS functionality.

Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery

The present protocol describes a mouse microsurgery infusion technique, which effectively delivers substances directly into the brain via the internal carotid artery.

CNS içine Hedeflenen Madde Teslimat için Fare Mikrocerrahi İnfüzyon Tekniği<i&gt; yoluyla</i&gt; İç Karotis Arter

Animal models of central nervous system (CNS) diseases and, consequently, blood-brain barrier disruption diseases, require the delivery of exogenous ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...