Kontrol ve ilgili gen için yeterli miktarda elektroporasyon karışımı hazırlayarak başlayın. Petri çanak elektrot haznesini elektroporatöre bağlayın. Daha sonra Microloader uçlarını kullanarak, mikroenjeksiyon iğnelerini her elektroporasyon karışımından 8 mikrolitre ile doldurun.
İnce makas kullanarak sabit bir akış elde etmek için kullanmadan önce iğnelerin uçlarını kesin. Künt ve geniş bir uç organoidlere ciddi şekilde zarar verebileceğinden, ucun sadece küçük bir kısmını çıkardığınızdan emin olun. Bir mikroskop altında, pürüzsüz sınırları ve görünür ventrikül benzeri yapıları olan beş serebral organoid seçin.
Ardından, kesilmiş 1000 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak bunları önceden ısıtılmış DMEM/F-12 içeren 35 milimetrelik bir hücre kültürü kabına taşıyın. Şimdi, iğneyi ventrikül benzeri bir yapının duvarından dikkatlice yerleştirin ve gözle görülür şekilde dolana kadar elektroporasyon karışımı ile demleyin. Patlamayı önlemek için ventrikül benzeri yapılara aşırı basınç uygulamayın.
Bir mikroenjeksiyonlu serebral organoidi Petri çanak elektrot odasına az miktarda DMEM / F-12 ile aktarın. Organoidi, mikroenjeksiyonlu ventrikül benzeri yapıların yüzeyleri, elektroporatörün pozitif kutbuna bağlı elektroda bakacak şekilde düzenleyin. Şimdi, serebral organoidleri, her biri bir saniye aralıklarla 50 milisaniye boyunca 80 voltluk beş darbe kullanarak birer birer elektroporlayın.
Mikroenjeksiyon ve elektroporasyon steril olmayan koşullar altında gerçekleştirildiyse, elektropora organoidleri laminer bir akış başlığı altında önceden ısıtılmış DMEM / F-12 ile doldurulmuş yeni bir 35 milimetrelik hücre kültürü kabına taşıyın. Daha sonra DM'deki elektropora organoidleri, 55 RPM'de bir orbital çalkalayıcıda A vitamini ile 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ve% 95 hava humifiye bir atmosferde kültürleyin. Ertesi gün, elektroporasyondan sonra, geleneksel bir ters floresan mikroskobu altında başarılı elektroporasyon için serebral organoidleri kontrol edin.
Elektropore organoidleri, kesilmiş 1000 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak 15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın ve fazla ortamı çıkarın. DPBS'ye yeterli miktarda% 4 paraformaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Kuluçka sonunda, paraformaldehiti aspire edin.
Ardından 5 mililitre DPBS ekleyin, yavaşça sallayın ve DPBS'yi aspire edin. Organoidleri DPBS'de bir sonraki kullanıma kadar 4 santigrat derecede saklayın. Elektroporasyondan iki gün sonra, GFP-pozitif hücreler neredeyse sadece ventriküler bölgede lokalize olur ve Pax6 için pozitiftir, bu da bu hücrelerin apikal progenitörler veya yenidoğan bazal progenitörler olduğunu gösterir.
10 gün sonra, GFP-pozitif hücreler bazal bölgelerde lokalizedir. Bu hücreler ayrıca sırasıyla bazal progenitörlerin veya nöronların göstergesi olan Pax6 veya NeuN için pozitiftir. GFP-pozitif hücrelerin 3-D dağılımının bir izlenimi elde etmek için elektroporate serebral organoidlerin 3-D rekonstrüksiyonu gösterilmiştir.
