Başlamak için, endojen sEV'leri çıkarmak için FBS'yi gece boyunca 110.000 G ve dört santigrat derecede bir ultrasantrifüjde santrifüjleyin. Süpernatanı 0,2 mikronluk bir ultrafiltrasyon membranından filtreleyerek sterilize edin ve sEV içermeyen FBS elde edin. Daha sonra 150 milimetrelik bir kültür çanağında, 20 mililitre DMEM kültür ortamında yaklaşık 3 kez 10 ila yedinci ölümsüzleştirilmiş kemik iliği türevi makrofajları plakalayın.
Makrofajlardan sEV'leri toplamadan önce çanağı gece boyunca %5 karbondioksit altında 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, ortamı attıktan sonra, hücreleri fosfat tamponlu salin veya PBS ile yıkayın. Hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe etmeden önce% 10 sEV içermeyen serbest fetal sığır serumu içeren DMEM ile değiştirin.
Deneyin gereksinimlerine göre, hücrelerin süpernatantını toplayın ve 50 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Hücreleri çıkarmak için tüpleri 300 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Sonucu süpernatan olarak her tüpten yeni bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve peleti atın.
Bu sefer, ölü hücreleri çıkarmak için süpernatanı 2000 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Ardından süpernatanı yeni yüksek hızlı santrifüj tüplerine aktarın ve peletleri atın. Enkaz ve mikro-parçacıkları çıkarmanın ardından, elde edilen süpernatanı yüksek hızlı bir santrifüj kullanarak 30 dakika boyunca 10.000 G'de santrifüjleyin.
Elde edilen süpernatanı, her tüpe 35 mililitre ekleyerek ve peletleri atarak yeni ultrasantrifüj tüplerine aktarın. Ultrasantrifüj tüplerini, süpernatanı atmadan önce 70 dakika boyunca 110.000 G'de sallanan bir kova rotor santrifüjünde santrifüjleyin. Elde edilen ham sEVs ile zenginleştirilmiş peleti bir mililitre PBS ile yıkayın.
Yine tüplerden birinde yıkanmış peletin içine bir mililitre PBS ilave edin ve sürekli pipetleyerek karıştırın. Elde edilen bir mililitre PBS süspansiyonunu pelet içeren başka bir tüpe aktarın ve tüplerdeki tüm peletler pipetleme ile karışana kadar aynısını tekrarlayın. Elde edilen bir mililitre sEV bakımından zengin PBS'yi yeni bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın.
Daha sonra yeni tüpü 70 dakika boyunca 110.000 G'de bir masa üstü ultrasantrifüjde santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, elde edilen ham sEVs ile zenginleştirilmiş peleti 100 mikrolitre PBS ile yıkayın. İçinde bulunan 30 miligram BSA'yı çözmek için standart bir protein tüpüne 1.2 mililitre protein hazırlama çözeltisi ekleyin.
Konsantrasyonunu mililitre başına 25 ila 0.5 miligram arasında azaltmak için elde edilen protein standart çözeltisini PBS ile seyreltin. 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına sekiz farklı hacimde seyreltilmiş protein standart çözeltisi ekleyin ve PBB kullanarak hacmi her bir oyukta 20 mikrolitreye getirin. Numune kuyucuklarına 18 mikrolitre HEPES lizis tamponu ekleyin, ardından iki mikrolitre sEV numunesi ekleyin.
Daha sonra, her bir kuyucuğa üreticinin talimatlarına göre hazırlanan 200 mikrolitre BCA çalışma solüsyonu ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika dinlendirin. Son olarak, bir mikroplaka okuyucu kullanarak 562 nanometrede absorbansı ölçün.
Elde edilen sonuçları kullanarak sEV'lerdeki toplam protein içeriğini hesaplayın. İzole edilmiş sEV'lerin transmisyon elektron mikroskobu görüntüleri, tipik bir fincan benzeri morfoloji sergiledi. Nanopartikül izleme analizi, izole edilen sEV'lerin çoğunlukla 136 nanometrede yoğunlaştığını gösterdi.
Western blot, izole edilmiş sEV'lerin CD9, beta-aktin ve TSG101 dahil olmak üzere sEV belirteçlerinden önemli ölçüde zenginleştirildiğini gösterdi. Endoplazmik retikülat belirteç GRP94 sadece tüm hücre lizatında tespit edildi. Sonuçlar, kullanılan yöntemin yüksek saflık seviyesine sahip sEV'ler verdiğini göstermiştir.
