Başlamak için, izole edilmiş küçük hücre dışı vezikülleri veya SEV'leri 70 dakika boyunca 110.000 G ve dört santigrat derecede ultrasantrifüjleme ile iki kez yıkayın. Vezikülleri 500 mikrolitre fosfat tamponlu salin veya PBS içinde tekrar süspanse edin. Ardından, beş mikrolitre 100X proteaz inhibitörü ekleyin.
Numuneyi 10 dakika boyunca 40 watt'ta ultrasonik kırmaya tabi tutun, üç saniye ultrasonik süre ve beş saniye aralık süresi ile. Ezilmiş karışımı 13.700 G'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Elde edilen süpernata 50 milimolar nihai konsantrasyona kadar ditiotreitol ekleyin.
Ve 30 dakika boyunca 56 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin. Daha sonra süpernatanıma 50 mikrolitre bir molar iyodoasetamid ekleyin. Ve karanlıkta 20 dakika oda sıcaklığında reaksiyona girmesine izin verin.
Karışımı 13, 700 G ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Ve ham peptit ekstraktını içeren süpernatanı 10 kilodaltonluk bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın. Ultra filtrasyon tüpünü bir saat boyunca 13, 700 G ve dört santigrat derecede santrifüjleyerek ham peptitten proteini çıkarın.
Toplanan atık suyu 45 santigrat derecede vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcıda kurutun. Tuzdan arındırma için, tüm reaktifler için çözücü olarak kütle spektrometrisi sınıfı saf su kullanın. İlk olarak, kuru peptitleri 100 mikrolitre% 0.1 triflorasetik asit veya TFA içinde çözün ve bir kenara koyun.
Daha sonra her tuzdan arındırma kolonuna 100 mikrolitre saf asetonitril ekleyin. Kolonları oda sıcaklığında üç dakika boyunca 400 G'de santrifüjleyin ve atık suyu atın. Daha sonra tuzdan arındırma kolonu başına 100 mikrolitre %50 asetonitril ekleyin ve atık suyu atmadan önce santrifüjlemeyi daha önce belirtildiği gibi tekrarlayın.
Ardından, daha önce belirtildiği gibi santrifüjlemeden önce her bir tuzdan arındırma kolonuna 100 mikrolitre %0.1 TFA ekleyin. Bir kez daha, atık suyu atın. Şimdi, tuzdan arındırma peptitlerini tuzdan arındırma kolonuna pipetleyin.
Numuneyi yüklemek için sütunları daha önce belirtildiği gibi santrifüjleyin. Yüklemeyi tekrarlamak için geri kazanılan atık suyu tuzdan arındırma kolonuna geri ekleyin. Ardından, 100 mikrolitre% 0.1 TFA ekleyin.
Daha önce belirtildiği gibi santrifüjleyin ve atık suyu atın. Son olarak, tuz giderme kolonundaki peptitlere %0.1 TFA içeren 50 mikrolitre %50 asetonitril ekleyin. Santrifüjden sonra, daha önce de belirtildiği gibi, atık suyu yeni bir kütle spektrometresi dereceli santrifüj tüpünde toplayın.
