Bu çalışma, Çin Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (3157270) alınan hibelerle desteklenmiştir. Dr. Feng Shao'ya (Ulusal Biyolojik Bilimler Enstitüsü, Çin) iBMDM'yi sağladığı için teşekkür ederiz.

1. Küçük hücre dışı veziküllerin izolasyonu
NOT: Tüm santrifüjleme işlemlerini 1.1-1.11 adımlarında 4 °C'de gerçekleştirin.
<ol><li>sEV içermeyen fetal sığır serumunun (FBS) hazırlanması: Endojen sEV'leri çıkarmak için FBS'yi gece boyunca 4 °C'de 110.000 × g'de bir ultrasantrifüj aracılığıyla santrifüjleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Süpernatanı toplayın, filtreleyin, 0,2 μm ultrafiltrasyon membranı ile sterilize edin ve -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>150 mm'lik bir kültür kabına yaklaşık 3 x 107 ölümsüzleştirilmiş kemik iliği türevli makrofajları (iBMDM'ler) yerleştirin ve 20 mL DMEM kültür ortamı ekleyin (bkz.</li>
	<li>sEV'leri toplamadan önce ortamı atın. Hücreleri bir kez PBS (fosfat tamponlu salin; Malzeme Tablosu) ve %10 sEV içermeyen FBS içeren bir ortamla değiştirin.</li>
	<li>Deneyin ihtiyaçlarına göre, hücre süpernatanı toplayın ve 50 mL santrifüj tüplerine aktarın.</li>
	<li>Hücreleri çıkarmak, peleti atmak ve süpernatanı yeni 50 mL santrifüj tüplerine aktarmak için hücre süpernatanı 300 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Ölü hücreleri çıkarmak, peleti atmak ve süpernatanı yeni yüksek hızlı santrifüj tüplerine aktarmak için süpernatanı 2000 × g'da 10 dakika santrifüjleyin (bkz.</li>
	<li>Hücre kalıntılarını ve mikro-parçacıkları çıkarmak, peleti atmak ve süpernatanı yeni ultrasantrifüj tüplerine aktarmak için süpernatanı 30 dakika boyunca 10.000 × g'da 30 dakika santrifüjleyin (bkz. Açık ultrasantrifüj tüplerinin hacmi 38.6 mL'dir; Her tüpe 35 mL hücre süpernatanı yerleştirin.</li>
	<li>Ham sEV peleti elde etmek için süpernatanı 110.000 × g'da 70 dakika boyunca sallanan kovalı rotor santrifüjünde ( Malzeme Tablosuna bakınız) santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı atın ve sEVs ile zenginleştirilmiş peleti 1 mL PBS ile yıkayın. Bir Masaüstü ultrasantrifüjde 70 dakika boyunca 110.000 × g'da santrifüjleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Süpernatanı atın ve bir ultrasantrifüj tüpüne 1 mL PBS ekleyin.</li>
	<li>Ardından çökeltiyi sürekli olarak pipetleyin, 1 mL PBS'yi başka bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve tüm ultrasantrifüj tüpleri pipetleme ile karıştırılana kadar bu şekilde devam edin.</li>
	<li>Süpernatanı atın ve peleti sEV'ler olan 100 μL PBS'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Aşağıdaki adımları izleyerek Bikinkoninik Asit (BCA) yöntemini kullanarak sEV'lerin toplam proteinini ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).<ol><li>Protein standardının hazırlanması: Protein standart çözeltisini (25 mg / mL) hazırlamak için tamamen çözmek için standart bir protein tüpüne (30 mg BSA) 1.2 mL protein hazırlama çözeltisi ekleyin. Daha sonra PBS ile 0.5 mg / mL'lik bir son konsantrasyona seyreltin.</li>
		<li>96 oyuklu plakaya 0 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL, 8 μL, 12 μL, 16 μL ve 20 μL protein standardı ekleyin ve 20 μL'yi oluşturmak için PBS ekleyin. Aynı zamanda, test edilecek numune kuyucuklarına 18 μL HEPES lizis tamponu (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM NaF,% 0.5 Triton X-100) ve 2 μL sEV numunesi ekleyin.</li>
		<li>Gerekli BCA çalışma solüsyonunu üreticinin talimatlarına göre hazırlayın, her kuyucuğa 200 μL BCA çalışma solüsyonu ekleyin ve 20-30 dakika oda sıcaklığında (RT) bekletin.</li>
		<li>Bir mikroplaka okuyucu ile 562 nm dalga boyunda absorbansı ölçün ve standart eğriye ve seyreltme faktörüne göre sEV'lerin toplam protein konsantrasyonunu hesaplayın. NOT: Bu protokol ile 40 mL süpernatanttan ekstrakte edilen sEV'ler, protein belirteçlerinin (western blot) daha sonra tanımlanması için kullanılabilir. Bununla birlikte, 200 mL hücre süpernatantından ekstrakte edilen sEV'ler hem morfolojik gözlem (transmisyon elektron mikroskobu, TEM) hem de partikül boyutu analizi (nanopartikül izleme analizi, NTA) için kullanılabilir. Spesifik olarak, adım 1.11'de hasat edilen sEV'ler için 100 μL PBS ile yeniden süspanse edin. Morfoloji gözlemi (TEM) için 20-30 μL alın ve partikül boyutu analizi (NTA) için kalan numuneyi 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Tüm santrifüjler önceden soğutulur. Adım 1.8 için, bu ultrasantrifüj tüpleri kesinlikle dengelenmeli ve en az dörtte üçü dolu olmalıdır. Değilse, makyaja orta ekleyin. Adım 1.11 için, sEV'ler kısa bir süre (12 saat) için 4 °C'de saklanabilir; aksi takdirde, peptitlerin ekstraksiyonunu engelleyen protein bozulmasını önlemek için -20 veya -80 °C'de saklanmaları gerekir. Bununla birlikte, morfolojiyi gözlemlemek ve partikül boyutunu ölçmek için kullanılan numuneler için, yalnızca kısa bir süre (12 saat) için 4 °C'de saklanması önerilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Transmisyon elektron mikroskobu ile sEV'lerin morfolojisinin gözlemlenmesi
<ol><li>Parafilm üzerine bir damla taze sEV numunesi (yaklaşık 20-30 μL) yerleştirin, bakır ağın sayı tarafını sEV damlacığının üzerine yerleştirin ve 3 dakika emmesine izin verin.</li>
	<li>Fazla sıvıyı filtre kağıdı ile emdirin ve ardından bakır ızgarayı bir damla damıtılmış suya yerleştirin ve iki kez yıkayın.</li>
	<li>Fazla sıvıyı filtre kağıdı ile emdirin. Ardından bakır ızgarayı 5 saniye boyunca negatif boyama için% 0,5 uranil asetat damlacığı üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Adım 2.2'yi tekrarlayın.</li>
	<li>Hazırlanan bakır ağı numune çubuğuna yerleştirin ve numune aşamasına yerleştirin.<ol><li>Test edilecek örneği bulmak için büyütmeyi 20.000x-25.000x olarak ayarlayın. Ardından büyütmeyi 100.000x'e ayarlayın ve transmisyon elektron mikroskobu altında gözlemlemek için uygun konumu ve gri tonlamayı ayarlayın (TEM; Malzeme Tablosu). Görüntü elde etmek için hızlanma voltajı 80 kV olarak ayarlanmıştır. NOT: Adım 2.1 için, sEV numunelerinin konsantrasyonu düşükse (<50 μg/μL), adsorpsiyon süresi 5 dakikaya veya daha uzun bir süreye kadar uzatılabilir. Alternatif olarak, adım 1.10 için, yeniden süspansiyon için daha küçük bir PBS hacmi (50 μL) kullanılabilir. Adım 2.3 için, negatif boyama süresi çok uzun olmamalıdır; aksi takdirde sEV'lerin üç boyutlu (3D) yapısını gözlemlemek zordur.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Nanopartikül izleme analizi ile partikül boyutu dağılımının ve sEV'lerin konsantrasyonunun ölçülmesi
<ol><li>Adım 1.11'de hasat edilen sEV'ler için, nanopartikül izleme analizi (NTA) için çözeltiyi 1 mL'ye seyreltin. İlk olarak, görüş alanında kirlilik kalmayana kadar cihazı damıtılmış suyla temizleyin. Ardından numuneyi yavaşça itmek için 1 mL steril şırınga kullanın (enjeksiyon hacmi: 0.5-1 mL).</li>
	<li>Numuneleri destekleyici yazılım aracılığıyla analiz edin (Malzeme Tablosuna bakın). Özellikle, Kamerayı Başlat'a tıklayın ve Kamera seviyesini uygun bir boyuta (genellikle 14-16 birimlik bir yoğunluk) ayarlayın, ardından ölçüm yöntemini, Standart Ölçüm'ü (3 veya 5 kez) seçin ve parçacıkları toplamak için Çalıştır'a tıklayın.</li>
	<li>Parçacıkları topladıktan sonra, bilgisayar hareketli sEV parçacıklarını gözlemleyebilir. Aynı zamanda, partikül boyutu dağılımını analiz etmek için algılama eşiğini (genellikle 5) ayarlayın, böylece son sayılan partiküllerin tümü arka plan yerine hareketli sEV'ler olur. Parçacıkları analiz ettikten sonra, analiz sonuçlarını kaydedin ve dışa aktarın.</li>
	<li>Kullandıktan sonra, görüş alanında belirgin parçacıklar kalmayana kadar cihazı damıtılmış suyla yıkayın ve lazeri kapatın. NOT: TEM için sEV numunelerinin aksine, NTA için sEV numuneleri çok konsantre olmamalı ve daha büyük numune hacimleri (en az 1 mL) gerektirmemelidir. Ek olarak, akış sitometrisi ve ayarlanabilir dirençli darbe algılama (TRPS) vb. gibi sEV'lerin boyut dağılımını analiz etmek için alternatif yöntemler kullanılabilir. NTA ölçümleri (NanoSight LM10) için önerilen parçacık/çerçeve sayısı 40'tır.</li>
</ol>4. sEV'lerin protein belirteçlerinin western blot ile saptanması
NOT: Hücre dışı vezikül çalışmaları için minimum bilgi (MISEV) 2018 kılavuzları17,18'e göre, sEV'lerin karakterizasyonu için 5 protein kategorisi önerilmektedir. sEV'lerin hazırlanması için her kategori 1'den 4'e kadar en az bir protein markörünü değerlendirin.
<ol><li>Adım 1.9'da hasat edilen sEV'ler için, süpernatanı dikkatlice pipetleyin ve 5 dakika boyunca 15 μL HEPES lizis tamponu ekleyin. Daha sonra eşit miktarda yükleme tamponu ekleyin ve kaynar suda 15 dakika pişirin.</li>
	<li>Bu protokolde, sEV'lerin proteininin yüklenmesi 8-10 μg idi. Proteinleri% 10 jel içinde 80 V (yaklaşık 30 dakika) sabit voltajda elektrofore uygulayın.<ol><li>Numune ayırma jeline girdiğinde, voltajı 120 V'a (yaklaşık 45 dakika) ayarlayın. Numune, cam plakanın altından 2-3 cm uzakta olduktan sonra, güç kaynağının bağlantısını kesin ve elektroporasyon için numune şeridini kesin. Elektroforez çözeltisinin bileşimi alt adım 4.2.1.1'de açıklanmıştır.<ol><li>5x elektroforez çözeltisi hazırlamak için sırasıyla 15.1 g, 5 g ve 94 g Tris, SDS ve glisin tartın ve deiyonize su ile 1 L'ye seyreltin. Kullanıldığında 5 kez su ile seyreltilmesi gerekir.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Elektroporasyon cihazını monte edin ve yeterli elektroporasyon çözeltisine (yaklaşık 1 L) koyun ve proteini nitroselüloz (NC) membran üzerinde 90 mA sabit akımla 3,5 saat boyunca buz üzerinde elektropoze edin. NOT: 10x elektroporasyon çözeltisi hazırlamak için sırasıyla 30.25 g ve 144.1 g Tris ve glisin tartın ve deiyonize su ile 1 L'ye seyreltin. Kullanıldığında, 7: 2: 1 oranında deiyonize su hazırlanması gerekir: metanol: elektroporasyon çözeltisi.</li>
	<li>Elektroporasyondan sonra, NC membranını RT'de 1-2 saat veya gece boyunca 4 ° C'de bloke edici çözeltiye (% 0.1 Tween 20 (TBST) ile 50 mL Tris tamponlu salin içinde 2.5 g yağsız süt tozu) yerleştirin. TBST'nin bileşimi alt adım 4.4.1'de açıklanmıştır.<ol><li>10x TBST hazırlamak için sırasıyla 60.56 g ve 175.32 g Tris ve NaCl tartın ve ardından 10 mL Tween-20 ve 34 mL konsantre hidroklorik asit ekleyin. Konsantre hidroklorik asit ile pH = 7.6'yı ayarlayın ve deiyonize su ile 2 L'ye tamamlayın. Kullanıldığında, on kez su ile seyreltilmesi gerekir.</li>
	</ol></li>
	<li>Protein belirteçlerini üç sEV belirteci (farklılaşma kümesi 9 [CD9]; β-aktin; tümör duyarlılık geni [TSG101]) ve bir sEV olmayan belirteç (glikoz tarafından düzenlenen protein 94 [GRP94]) ile tanımlayın.<ol><li>Yukarıdaki antikorlardan 2 μL pipetleyin ve 1:500'de seyreltin, ardından NC membranlarını RT'de 3 saat veya gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Seyreltici, adım 4.4'teki engelleme çözümüdür.</li>
		<li>Birincil antikor ile inkübasyondan sonra, her seferinde 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıda 1x TBST ile 3 kez yıkayın.</li>
	</ol></li>
	<li>NC membranını seyreltilmiş ikincil antikora (1:500) yerleştirin ve RT'de bir çalkalayıcı üzerinde 45-50 dakika boyunca yavaşça çalkalayın. Her seferinde 10 dakika boyunca bir çalkalayıcıda 1x TBST ile 3 kez yıkayın.</li>
	<li>Kemilüminesan substratlar A ve B'yi (Malzeme Tablosuna bakınız) 1: 1'de karıştırın, karışık reaktifi NC membranına ekleyin ve RT'de 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Bir leke görüntüleyici kullanarak NC membranını görüntüleyin (Malzeme Tablosuna bakın)<ol><li>Image Lab yazılımını açın ve Yeni Deneysel Protokol'ü seçin.</li>
		<li>Blotting-colorimetric uygulamasını seçin, Vurgulama'yı iptal edin, Deneysel Protokolü Çalıştır'a tıklayın, işaretçiyi alın ve kaydedin.</li>
		<li>Ardından Blotting-chemi uygulama programını yeniden seçin ve Toplam görüntü sayısını ve Pozlama süresini sırasıyla 30 sn ve 300 sn olarak ayarlayın.</li>
		<li>Deneysel Protokolü Çalıştır'a tıklayın, görüntüleri alın ve kaydedin. Son olarak, NC membranını çıkarın ve bilgisayarı kapatın. NOT: Adım 4.6 için, ikincil antikorun inkübasyon süresi 50 dakikayı geçmemelidir; aksi takdirde arka plan çok karanlık olacaktır.</li>
	</ol></li>
</ol>5. sEV'lerin peptitlerinin ekstraksiyonu
<ol><li>SVH'leri 70 dakika boyunca 4 ° C'de 110.000 × g'da ultrasantrifüjleme ile iki kez yıkayın ve yeniden süspanse etmek için 500 μL PBS ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) ve 5 μL 100x proteaz inhibitörü ekleyin (bkz.</li>
	<li>Numuneyi ultrasonik kırma için yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın). Ultrasonik homojenizasyon ayarları aşağıdaki gibidir: güç: 40 W, toplam süre: 10 dakika, ultrasonik süre: 3 s ve aralık süresi: 5 s.</li>
	<li>Ezilmiş karışımı 13.700 × g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Santrifüjlemeden sonra ditiyotreitol (DTT; Malzeme Tablosu) süpernatantı 50 mmol/L'lik nihai konsantrasyona kadar ve 56 °C'de bir su banyosunda 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Daha sonra, 50 μL iyodoasetamid (IAA; Malzeme Tablosu) süpernatanı 1 mol / L konsantrasyonda ve karanlıkta 20 dakika boyunca RT'de reaksiyona girmeye bırakın.</li>
	<li>Karışımı 13.700 × g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı, ham peptit ekstraktını toplayın. Daha sonra kullanmak üzere -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>Elde edilen peptitlerin ham ekstraktını 10 kDa'lık bir ultrafiltrasyon tüpü19 ile ultrafiltre edin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 1 saat boyunca 4 ° C'de 13.700 × g'da santrifüjleyin. Atık suyu toplayın ve 45 °C'de vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcıda (Malzeme Tablosuna bakın) kurutun.</li>
	<li>Kurutulmuş numuneleri 5.8.1-5.8.8 adımlarını izleyerek tuzdan arındırın. Reaktifler için çözücü olarak kütle spektrometresi sınıfı saf su kullanın.<ol><li>Kurutulmuş peptitleri tamamen çözmek için her numuneye 100 μL %0.1 trifloroasetik asit (TFA) ekleyin.</li>
		<li>Her tuzdan arındırma kolonuna 100 μL %100 asetonitril (ACN) ekleyin, RT'de 3 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjleyin ve atık suyu atın. Daha sonra 100 μL %50 ACN ekleyin, 400 × g'da 3 dakika santrifüjleyin ve atık suyu atın.</li>
		<li>Her tuzdan arındırma kolonuna 100 μL %0,1 TFA ekleyin, 400 × g'da 3 dakika santrifüjleyin ve atık suyu atın.</li>
		<li>Adım 5.8.3'ü tekrarlayın.</li>
		<li>Adım 5.8.1'de çözünen peptitleri tuzdan arındırma kolonuna pipetleyin, 400 × g'da 3 dakika santrifüjleyin ve atık suyu geri kazanın. Peptit örneğinin tuz giderme kolonuna adsorbe olmasına izin vermek için örnek yükleme adımını tekrarlayın.</li>
		<li>Adım 5.8.3'ü iki kez tekrarlayın.</li>
		<li>Tuzdan arındırma kolonuna 50 μL %50 ACN (%0.1 TFA içerir) ekleyin, 400 × g'da 3 dakika santrifüjleyin ve atık suyu (peptitler) yeni bir kütle spektrometresi dereceli santrifüj tüpünde toplayın.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Tuzdan arındırılmış peptitlerin kurutulması
<ol><li>Tuzdan arındırılmış peptitleri vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcıda kurutun (Ayarlar: V-AQ modu, sıcaklık: 45 °C ve süre: 50 dakika) ve bunları sonraki kütle spektrometrisi analizi için kullanın. NOT: Protein bozulmasını önlemek için sEV'lerin peptitlerinin ekstraksiyon işlemi mümkün olduğunca buz üzerinde yapılmalıdır. Kullanılan tüm reaktifler, plastik kontaminasyonunu önlemek için kütle spektrometresi dereceli su ile hazırlandı. Adım 5.8 için, tuzdan arındırma, peptit numunelerinin kaçınılmaz kaybına neden olur. Bu kayıp, 5.8.5 ve 5.8.7 adımları tekrarlanarak azaltılabilir.</li>
</ol>7. Sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) analizi
NOT: Peptitlerin örneğini sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS), özellikle bir EASY-nLC 1000 nano-yüksek performanslı LC sistemine bağlı Orbitrap Q Exactive HF-X kütle spektrometresi ile analiz edin (bkz.
<ol><li>Numuneleri bir C18 analitik kolonunda (1,9 μm tane çapı, 15 cm uzunluk x 150 μm iç çap) 60 nL/dk akış hızında 65 dakikalık bir gradyanla ayırın: 4 dakika boyunca %4-%15, 28 dakika boyunca %15-%28, 10 dakika boyunca %28-%40, 10 dakika boyunca %40-%69, 7 dakika boyunca %95 sabit, %95 1 dakika boyunca %6'ya düştü ve 5 dakika boyunca sabit kaldı (çözücü A, %0.1 formik asit [FA] içeren su; çözücü B, %0.1 FA içeren %80 asetonitril, v/v).</li>
	<li>Ayrıştırılan peptitleri bir nano-elektrosprey iyonizasyon (nano-ESI) püskürtücüde 320 °C kılcal sıcaklıkta ve 2.2 kV püskürtme voltajında iyonize edin.</li>
	<li>Tam tarama modu için 120.000 ve MS /MS modunda 15.000 çözme gücüne sahip veriye bağlı toplama modunu kullanarak kütle spektral verilerini toplayın.<ol><li>Orbitrap'te 250 m/z ila 1800 m/z tarama aralığından ve 1,6 m/z ile izolasyon penceresinden tam taramalar gerçekleştirin.</li>
		<li>%29'luk normalleştirilmiş çarpışma enerjisi ile daha yüksek enerjili çarpışma ayrışması (HCD) parçalanması için ilk 20 yoğun iyonu seçin ve iyon ayırıcıda ölçün. NOT: Tipik kütle spektrometrik koşulları aşağıdaki gibidir: Otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedefleri, tam taramalar için 3 x 106 iyon ve MS/MS taramaları için 2 x 105 iyondu; maksimum enjeksiyon süresi tam taramalar için 80 ms ve MS/MS taramaları için 19 ms idi; ve 13 s boyunca dinamik dışlama kullanıldı.</li>
	</ol></li>
</ol>

Küçük hücre dışı veziküllerin izole edilmesi ve peptidomlarının çıkarılması

<ol>
	<li>Kalluri, R., LeBleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (6478), (2020).</li><li>Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+secreted+vesicles+and+intercellular+communications.">Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications.</a> F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+PD-L1+contributes+to+immunosuppression+and+is+associated+with+anti-PD-1+response.">Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response.</a> Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).</li><li>Ti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-preconditioned+mesenchymal+stromal+cells+modify+macrophage+polarization+for+resolution+of+chronic+inflammation+via+exosome-shuttled+let-7b.">LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b.</a> Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).</li><li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+S100A4+derived+from+highly+metastatic+hepatocellular+carcinoma+cells+promotes+metastasis+by+activating+STAT3.">Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).</li><li>Xun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer-derived+exosomal+miR-138-5p+modulates+polarization+of+tumor-associated+macrophages+through+inhibition+of+KDM6B.">Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B.</a> Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).</li><li>Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+cancer+development+and+clinical+applications.">Exosomes in cancer development and clinical applications.</a> Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).</li><li>Mashouri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+composition,+biogenesis,+and+mechanisms+in+cancer+metastasis+and+drug+resistance.">Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance.</a> Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+opportunity,+and+perspective+on+exosome+isolation+-+efforts+for+efficient+exosome-based+theranostics.">Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.</a> Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome:+A+review+of+its+classification,+isolation+techniques,+storage,+diagnostic+and+targeted+therapy+applications.">Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications.</a> International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).</li><li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+isolation+and+characterization:+toward+clinical+application.">Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+exosome+isolation+techniques.">Progress in exosome isolation techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Palanski, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+urine+peptidomics+workflow+identifies+chemically+defined+dietary+gluten+peptides+from+patients+with+celiac+disease.">An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease.</a> Nature Communications. 13, 888 (2022).</li><li>Kalaora, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+bacteria-derived+HLA-bound+peptides+in+melanoma.">Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma.</a> Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).</li><li>Hamley, I. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+bioactive+peptides+for+biomaterials+design+and+therapeutics.">Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics.</a> Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).</li><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+proteolysis+of+bioactive+peptides+using+a+peptidomics+approach.">Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach.</a> Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).</li><li>Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidome:+Chaos+or+inevitability.">Peptidome: Chaos or inevitability.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128 (2021).</li><li>Keller, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoy+exosomes+provide+protection+against+bacterial+toxins.">Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins.</a> Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).</li><li>Koeppen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let-7b-5p+in+vesicles+secreted+by+human+airway+cells+reduces+biofilm+formation+and+increases+antibiotic+sensitivity+of+P.+aeruginosa.">Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).</li></ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

sEV'lerin işlevini araştırırken, olası kontaminasyonları önlemek için karmaşık biyolojik numunelerden yüksek saflıkta sEV'ler elde etmek zorunludur. sEV'lerin izolasyonu için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir13 ve bu yöntemler arasında, diferansiyel ultrasantrifüj tabanlı yöntemler, sEV'lerin nispeten yüksek saflığını göstermiştir. Bu çalışmada, 6 saat boyunca 200 mL hücre süpernatantı toplandı ve diferansiyel ultrasantrifüjleme ile yaklaşık 200-300 μg sEV...

Çapı 200 nm'den küçük olan küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler) hemen hemen her tür vücut sıvısında bulunur ve idrar, ter, gözyaşı, beyin omurilik sıvısı ve amniyotik sıvı dahil olmak üzere her türlü hücre tarafından salgılanır1. Başlangıçta, sEV'ler hücresel atıkların bertarafı için kaplar olarak kabul edildi ve bu da sonraki on yılda minimum araştırmaya yol açtı2. Son zamanlarda, artan kanıtlar sEV'lerin spesifik proteinler, lipitler, nükleik asitler ve diğer metabolitler içerdiğini göstermektedir. Bu moleküller hedef hücrelere3 taşınır ve hücreler arası iletişime katkıda bulunur ve bu sayede doku onarımı, anjiyogenez, bağışıklık4 ve iltihaplanma 5,6, tümör gelişimi ve metastaz 7,8,9 vb. gibi çeşitli biyolojik süreçlere katılırlar.
sEV'lerin incelenmesini kolaylaştırmak için, sEV'leri karmaşık numunelerden izole etmek zorunludur. sEV'lerin yoğunlukları, partikül boyutları ve yüzey işaretleyici proteinleri gibi fiziksel ve kimyasal özelliklerine dayalı olarak farklı sEV izolasyon yöntemleri geliştirilmiştir. Bu teknikler arasında ultrasantrifüj tabanlı yöntemler, partikül boyutuna dayalı yöntemler, immünoaffinite yakalama tabanlı yöntemler, sEV'lerin çökeltme tabanlı yöntemleri ve mikroakışkan tabanlı yöntemlerbulunur 10,11,12. Bu teknikler arasında, ultrasantrifüj tabanlı yöntem, sEV izolasyonu için altın standart olarak kabul edilmektedir ve en yaygın kullanılan tekniktir13.
Artan miktarda kanıt, çeşitli organizmaların peptidomlarında keşfedilmemiş çok sayıda biyolojik olarak aktif peptitin varlığını göstermektedir. Bu peptitler, büyüme, gelişme, stres tepkisi14,15 ve sinyal iletimini16 düzenleyerek çok sayıda fizyolojik sürece önemli ölçüde katkıda bulunur. sEV'lerin peptidomunun amacı, bu sEV'ler tarafından taşınan peptitleri ortaya çıkarmak ve biyolojik işlevlerine dair ipuçları sağlamaktır. Burada, diferansiyel ultrasantrifüjleme yoluyla sEV'leri izole etme protokolünü ve ardından peptidomlarının daha fazla analizi için bu sEV'lerden peptitlerin ekstraksiyonunu sunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Beyotime Technology</td>
			<td>P0012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9</td>
			<td>Beyotime Technology</td>
			<td>AF1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC5010BK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357003</td>
			<td>High-speed centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescent substrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>D8220</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM culture medium</td>
			<td>Cell World</td>
			<td>N?A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRP94</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>20292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti JXN-26</td>
			<td>Centrifuge rotor (JA-25.50)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM)</td>
			<td>National Institute of Biological Sciences, China</td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>l1149</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tube polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>357448</td>
			<td>1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nano-high-performance LC system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EASY-nLC 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle tracking analysis&#160;</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight NTA3.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyallomer centrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td>Ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Bimake</td>
			<td>B14002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac vacuum concentrator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Concentrator plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima MAX-XP</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor (TLA 55)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>H-7650B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSG101</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AF8258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cell disruptor</td>
			<td>Scientz</td>
			<td>SCIENTZ-IID</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDocXRs</td>
			<td>Image lab 4.0 (beta 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3853</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of peptides of small extracellular vesicles from bone marrow-derived macrophages

Küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler) tipik olarak multiveziküler cisimlerin (MVB'ler) ekzositozu ile salgılanır. <200 nm çapındaki bu nanoveziküller, çeşitli vücut sıvılarında bulunur. Bu sEV'ler, proteinler, DNA, RNA ve metabolitler gibi kargoları aracılığıyla gen transkripsiyonu ve translasyonu, hücre çoğalması ve hayatta kalması, bağışıklık ve iltihaplanma gibi çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Şu anda, sEV'lerin izolasyonu için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bunlar arasında, ultrasantrifüj tabanlı yöntem altın standart olarak kabul edilir ve sEV'lerin izolasyonu için yaygın olarak kullanılır. Peptitler, doğal olarak 50 amino asitten daha az uzunluğa sahip biyomakromoleküllerdir. Bu peptitler, hormonlar, nörotransmiterler ve hücre büyüme faktörleri gibi biyolojik aktiviteye sahip çeşitli biyolojik süreçlere katılır. Peptidom, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) ile spesifik biyolojik numunelerdeki endojen peptitleri sistematik olarak analiz etmeyi amaçlamaktadır. Burada, diferansiyel ultrasantrifüjleme ile sEV'leri izole etmek için bir protokol tanıttık ve LC-MS/MS ile tanımlanmak üzere peptidomu ekstrakte ettik. Bu yöntem, kemik iliği kaynaklı makrofajlardan yüzlerce sEV türevi peptit tanımladı.

Small extracellular vesicles (sEVs) with a diameter of less than 200 nm are present in almost all types of body fluids and secreted by all kinds of cells, including urine, sweat, tears, cerebrospinal fluid, and amniotic fluid1. Initially, sEVs were considered as receptacles for disposing of cellular waste, which led to minimal research in the subsequent decade2. Recently, increasing evidence indicates that sEVs contain specific proteins, lipids, nucleic acids, and other metabolites. These molecules are transported to target cells3, contributing to intercellular communication, through which they participate in various biological processes, such as tissue repair, angiogenesis, immunity4 and inflammation5,6, tumor development and metastasis7,8,9, etc.
To facilitate the study of sEVs, it is imperative to isolate sEVs from complex samples. Different sEVs isolation methods have been developed based on the physical and chemical properties of sEVs, such as their density, particle size, and surface marker proteins. These techniques include ultracentrifugation-based methods, particle size-based methods, immunoaffinity capture-based methods, sEVs precipitation-based methods, and microfluidics-based methods10,11,12. Among these techniques, the ultracentrifugation-based method is widely recognized as the gold standard for sEVs isolation and is the most commonly used technique13.
An increasing amount of evidence suggests the presence of a multitude of undiscovered biologically active peptides in the peptidomes of various organisms. These peptides significantly contribute to numerous physiological processes by regulating growth, development, stress response14,15, and signal transduction16. The objective of sEVs&#39; peptidome is to uncover the peptides carried by these sEVs and provide clues to their biological functions. Here, we present a protocol of isolating sEVs through differential ultracentrifugation, followed by extraction of peptides from these sEVs for further analysis of their peptidome.

Yazar Spotlight: Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlardan İzole Edilen Küçük Hücre Dışı Veziküllerden Peptidom Ekstraksiyonu 

Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlardan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin Peptitlerinin Tanımlanması

We explore the functional roles of extracellular vesicles in innate immunity. We have developed a protocol to isolate small extracellular vesicles, or sEVs, via differential ultracentrifugation and identify the peptidome by LC-MS/MS, revealing the key biological functions of the peptides in sEVs. The extracellular vesicles have been shown to mediate intercellular communication by transporting cargo to recipient cells, such as proteins, lipids, and nucleic acids.By releasing antimicrobial components, they act the first line of defense against invading microbes in innate immunity. While differential ultracentrifugation yields highly pure small extracellular sEVs, it can be time-consuming and often results in low yields. In our study, these are major challenges for the stable identification of low-abundance peptides in the sEVs.

Diferansiyel ultrasantrifüj ile izole edilen sEV'ler için (Şekil 1), Uluslararası Hücre Dışı Veziküller Derneği'ne (ISEV)17 göre morfolojilerini, partikül boyutu dağılımlarını ve protein belirteçlerini değerlendirdik.
İlk olarak, sEV'lerin morfolojisi TEM tarafından gözlemlendi ve tipik bir fincan benzeri yapı gösterdi (Şekil 2A). NTA, izole edilmiş sEV'lerin çoğunlukla 136 nm'de yo?...

Watch this Scientific Journal Video about Peptidome Extraction from Small Extracellular Vesicles Isolated from Bone Marrow-Derived Macrophages at JoVE.com

Bu protokol, diferansiyel ultrasantrifüjleme ile makrofajlardan küçük hücre dışı vezikülleri izole etmek ve kütle spektrometrisi ile tanımlamak için peptidomu çıkarmak için bir prosedürü açıklar.

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of ...

Hücre dışı veziküllerin doğuştan gelen bağışıklıktaki fonksiyonel rollerini araştırıyoruz. Diferansiyel ultrasantrifüjleme yoluyla küçük hücre dışı vezikülleri veya sEV'leri izole etmek ve peptidomu LC-MS/MS ile tanımlamak için bir protokol geliştirdik ve sEV'lerdeki peptitlerin temel biyolojik işlevlerini ortaya çıkardık. Hücre dışı veziküllerin, kargoyu proteinler, lipitler ve nükleik asitler gibi alıcı hücrelere taşıyarak hücreler arası iletişime aracılık ettiği gösterilmiştir.Antimikrobiyal bileşenleri serbest bırakarak, doğuştan gelen bağışıklıkta istilacı mikroplara karşı ilk savunma hattını oluştururlar. Diferansiyel ultrasantrifüjleme son derece saf küçük hücre dışı sEV'ler verirken, zaman alıcı olabilir ve genellikle düşük verimle sonuçlanır. Çalışmamızda, bunlar sEV'lerde düşük bolluktaki peptitlerin kararlı bir şekilde tanımlanması için büyük zorluklardır.

identification-peptides-small-extracellular-vesicles-from-bone-marrow

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages

1.2K Görüntüleme.  Anhui Medical University. Hücre dışı veziküllerin doğuştan gelen bağışıklıktaki fonksiyonel rollerini araştırıyoruz. Diferansiyel ultrasantrifüjleme yoluyla küçük hücre dışı vezikülleri veya sEV'leri izole etmek ve peptidomu LC-MS/MS ile tanımlamak için bir protokol geliştirdik ve sEV'lerdeki peptitlerin temel biyolojik işlevlerini ortaya çıkardık. Hücre dışı veziküllerin, kargoyu proteinler, lipitler ve nükleik asitler gibi alıcı hücrelere taşıyarak hücreler arası iletişim...

Video: Yazar Spotlight: Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlardan İzole Edilen Küçük Hücre Dışı Veziküllerden Peptidom Ekstraksiyonu 

Small extracellular vesicles (sEVs) are typically secreted by the exocytosis of multivesicular bodies (MVBs). These nanovesicles with a diameter of &lt;200 nm are present in various body fluids. These sEVs regulate various biological processes such as gene transcription and translation, cell proliferation and survival, immunity and inflammation through their cargos, such as proteins, DNA, RNA, and metabolites. Currently, various techniques have been developed for sEVs isolation. Among them, the ultracentrifugation-based method is considered the gold standard and is widely used for sEVs isolation. The peptides are naturally biomacromolecules with less than 50 amino acids in length. These peptides participate in a variety of biological processes with biological activity, such as hormones, neurotransmitters, and cell growth factors. The peptidome is intended to systematically analyze endogenous peptides in specific biological samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Here, we introduced a protocol to isolate sEVs by differential ultracentrifugation and extracted peptidome for identification by LC-MS/MS. This method identified hundreds of sEVs-derived peptides from bone marrow-derived macrophages.

This protocol describes a procedure to isolate small extracellular vesicles from macrophages by differential ultracentrifugation and extract the peptidome for identification by mass spectrometry.

Biyokimya

Isolating Small Extracellular Vesicles (sEVs) by Differential Ultracentrifugation

Isolating Small Extracellular Vesicles (SEVs) by Differential Ultracentrifugation  

To begin, centrifuge FBS overnight in an ultracentrifuge at 110, 000 G and four degrees Celsius to remove the endogenous sEVs. Sterilize the supernatant by filtering it through a 0.2 micron ultrafiltration membrane to yield sEVs-free FBS. Next in a 150 millimeter culture dish, plate about 3 times 10 to the seventh immortalized bone-marrow-derived macrophages in 20 milliliters of DMEM culture medium.Incubate the dish at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide overnight prior to collecting the sEVs from the macrophages. The next day, after discarding the medium, wash the cells with phosphate-buffered saline or PBS. Replace the medium with DMEM containing 10%sEVs-free free fetal bovine serum before incubating the cells at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.Based on the experiment's requirements, collect and transfer the cells'supernatant to 50 milliliter centrifuge tubes. Centrifuge the tubes at 300 G for 10 minutes to remove the cells. Transfer the result in supernatant from each tube to a new 50 milliliter centrifuge tube and discard the pellet.This time, centrifuge the supernatant at 2000 G for 10 minutes to remove dead cells. Then transfer the supernatant to new high-speed centrifuge tubes and discard the pellets. Next to remove debris and microvesicles, centrifuge the obtained supernatant at 10, 000 G for 30 minutes using a high-speed centrifuge.Transfer the resulting supernatant to new ultracentrifuge tubes by adding 35 milliliters in each tube and discarding the pellets. Centrifuge the ultracentrifuge tubes in a swinging bucket rotor centrifuge at 110, 000 G for 70 minutes before discarding the supernatant. Wash the resulting crude sEVs-enriched pellet with one milliliter of PBS.Again, add one milliliter of PBS to the washed pellet in one of the tubes, and mix by pipetting continuously. Transfer the one milliliter of resultant PBS suspension to another tube containing the pellet, and repeat the same until all pellets in the tubes are mixed by pipetting. Transfer the resultant one milliliter of sEVs-rich PBS to a new ultracentrifuge tube.Then centrifuge the new tube in a tabletop ultracentrifuge at 110, 000 G for 70 minutes. After discarding the supernatant, wash the resulting crude sEVs-enriched pellet with 100 microliters of PBS. Add 1.2 milliliters of protein preparation solution in a standard protein tube to dissolve the 30 milligrams of BSA present in it.Dilute the resulting protein standard solution with PBS to reduce its concentration from 25 to 0.5 milligrams per milliliter. Add eight different volumes of the diluted protein standard solution into wells of a 96-well plate, and bring the volume to 20 microliters in each well using PBB. Add 18 microliters of HEPES lysis buffer to the sample wells, followed by the addition of two microliters of the sEVs samples.Next, add 200 microliters of BCA working solution prepared per the manufacturer's instructions into each well. Allow the plate to rest at room temperature for 20 to 30 minutes. Finally, measure the absorbance at 562 nanometers using a microplate reader.Calculate the total protein content in the sEVs using the obtained results. The transmission electron microscopy images of the isolated sEVs displayed a typical cup-like morphology. Nanoparticle tracking analysis showed that the isolated sEVs were mostly concentrated at 136 nanometers.Western blot showed that isolated sEVs were significantly enriched of sEVs markers, including CD9, beta-actin, and TSG101. The endoplasmic reticulate marker GRP94 was only detected in the whole-cell lysate. The results indicated that the method employed yielded sEVs with a high level of purity.

Diferansiyel Ultrasantrifüjleme ile Küçük Hücre Dışı Veziküllerin (sEV'ler) İzole Edilmesi

Extraction of Peptides from Isolated Small Extracellular Vesicles (sEVs)

To begin, wash the isolated small extracellular vesicles or SEVs twice by ultracentrifugation at 110, 000 G and four degrees Celsius for 70 minutes. Re-suspend the vesicles in 500 microliters of phosphate buffered saline or PBS. Then, add five microliters of 100X protease inhibitor to it.Subject the sample to ultrasonic crushing at 40 watts for 10 minutes, with three second ultrasonic time, and five second interval time. Centrifuge the crushed mixture at 13, 700 G for 15 minutes at four degrees Celsius. To the obtained supernatant, add dithiothreitol to a final concentration of 50 millimolar.And incubate it in a water bath at 56 degrees Celsius for 30 minutes. Then add 50 microliters of one molar iodoacetamide to the supernatant. And allow it to react at room temperature for 20 minutes in the dark.Centrifuge the mixture at 13, 700 G and four degrees Celsius for 15 minutes. And transfer the supernatant containing the crude peptide extract to a 10 kilodalton ultracentrifuge tube. Remove protein from the crude peptide by centrifuging the ultra filtration tube at 13, 700 G and four degrees Celsius for one hour.Dry the collected effluent in a vacuum centrifugal concentrator at 45 degrees Celsius. For desalting, use mass spectrometry grade pure water as a solvent for all reagents. First, dissolve the dry peptides in 100 microliters of 0.1%trifluoracetic acid or TFA, and keep it aside.Then add 100 microliters of pure acetonitrile to each desalting column. Centrifuge the columns at 400 G for three minutes at room temperature, and discard the effluent. Then add 100 microliters of 50%acetonitrile per desalting column, and repeat the centrifugation as mentioned previously before discarding the effluent.Next, add 100 microliters of 0.1%TFA to each desalting column before centrifuging as mentioned previously. Once again, discard the effluent. Now, pipet the desalt peptides into the desalting column.Centrifuge the columns as mentioned previously to load the sample. Add the recovered effluent back to the desalting column to repeat the loading. Then, add 100 microliters of 0.1%TFA.Centrifuge as mentioned previously, and discard the effluent. Finally, add 50 microliters of 50%acetonitrile containing 0.1%TFA to the peptide in the desalting column. After centrifusion, as mentioned previously, collect the effluent in a new mass spectrometry grade centrifuge tube.