Başlamak için mikroskobu, ışık kaynağını, kamerayı ve emme sistemini açın. Perfüzyon sistemini yıkamak için birinci haznede Ringer solüsyonunu ve ikinci haznede pirityon ile takviye edilmiş Ringer çinko solüsyonunu kullanın. Musluğu kapattıktan sonra, odaları aynı solüsyonlarla doldurun.
Numune hazırlamaya başlamak için, perfüzyon odasını oluğun dar tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve oluğun etrafına bir sızdırmazlık silikonu uygulayın. Daha sonra, ince bir cımbız kullanarak, hücreler aşağı bakacak şekilde oluğun üstündeki yıkama solüsyonundan 13 milimetrelik bir lamel aktarın. 13 milimetrelik lamellerin üzerine 22 milimetrelik bir lamel yerleştirin ve lamellerin çatlamamasına dikkat ederek cımbızı kullanarak sıkın.
Hazneyi çevirin ve sıvıları serbest bırakmak için bastırın. Ardından, oluğu 100 mikrolitre Ringer yıkama solüsyonu ile doldurun ve sızıntı olmadığından emin olarak tekrar bastırın. Perfüzyon odasını platforma monte edin ve sabitleyin.
Ardından, perfüzyon için perfüzyon ve emme tüplerini oluktaki hücrelerin üzerine takın. Perfüzyon hızını dakikada yaklaşık iki mililitre olarak değiştirin ve Ringer'ın çözelti perfüzyonunu açın. Ölçümler için görüntüleme yazılımını açın.
Mikroskobun sol tarafındaki düğmeyi kullanarak mikroskop büyütmesini 10X'e ayarlayın. Live View canlı görüntü özelliğini seçtikten sonra, platformu hareket ettirmek ve oluktaki hücrelere odaklanmak için joystick'i kullanın. mCherry için uygun dalga boyunu seçin.
Hücreler odaklandıktan sonra, uygun hücre yamalarının seçimi için platformu hareket ettirin. ROI'leri Çiz açılır menüsünü seçin. Döngüsel ROI'ler Çiz'i seçin ve mCherry ifade eden hücrelerle hücre kümelerine ROI'ler çizin.
Shift düğmesini basılı tutarak ve ardından mevcut ROI'leri basılı tutup sürükleyerek ilkinin ötesinde yeni ROI'ler oluşturun. Açılır menüden Kare Arka Plan ROI Çiz'i seçin ve hücrelerin bulunmadığı arka plan ROI'sinin konumunu ve boyutunu ayarlayın. Arka plan ROI'sinde hücrelerin bulunmadığından emin olduktan sonra, ND Alımı sekmesine gidin.
Dalgaboyu alt sekmesini seçin ve onay kutusunu işaretleyin. GFP dalga boyu onay kutusunun da işaretli olduğundan emin olun. Zaman alt sekmesine tıklayın ve ölçüm aralığını her beş saniyede bir ve süreyi 30 dakika olarak tanımlayın.
Mikroskop panelinde, Mükemmel Odak Sistemini veya PFS'yi etkinleştirmek için Açık'a basın. ND Alımı altında, PFS açık seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun. Odağı ayarlayın ve Şimdi çalıştır'a tıklayın.
Ringer'ın çözelti perfüzyonunu kullanarak 90 saniye boyunca başlangıç dönemi ölçümünü başlatın. 90 saniye sonra, Ringer çözeltisi perfüzyonundan Ringer çinko çözeltisi perfüzyonuna geçin ve floresan yükselişi doymaya başladığında ana arayüz panelinin sağ alt köşesindeki kırmızı bayrağa tıklayın. Deney süresi sona erene kadar Ringer solüsyonu ile perfüzyona geri dönün.
Verileri taban çizgisi çıkarma ile dışa aktarmak için, Arka Plan Düzeltme düğmesine basın ve ND Alma penceresindeki değişiklikleri görüntüleyin. Verileri istediğiniz konuma kaydetmek için Dışa Aktar düğmesine tıklayın. Floresanstaki bir artış, hücre içi çinko konsantrasyonunun artmasından kaynaklanırken, bir azalma, hücre zarı boyunca çinko taşıyan ZnT-1'in aktivitesini gösterdi.
Yabani tip ZnT-1, çinko yüküne hücresel tepkilerdeki değişkenlikle ilgili olarak mutanttan daha yumuşak bir floresan eğrisine sahipti. Yabani tip ve delta USCTD'nin aktivitelerini karşılaştıran bir kutu grafiği, benzer ortalama taşıma oranları gösterdi ve bu da vahşi tip ile mutant arasında bir fark olmadığını gösterdi. Bununla birlikte, yayılmadaki fark, işlevsel bir farklılığa işaret edebilir.
