İzole edilmiş beyin hücresi süspansiyonunu sekiz dakika boyunca 300G'de santrifüjleyerek başlayın. Pelet% 0.5 BSA çözeltisi ile 80 mikrolitre HBSS içinde yeniden süspanse edin. 20 mikrolitre nöronal hücre dışı biyotin antikor kokteyli ekleyin ve inkübe edin.
Hücreleri% 0.5 BSA ile iki mililitre HBSS ile yıkayın. Daha sonra santrifüj peletini 80 mikrolitre HBSS'de% 0.5 BSA ile yeniden süspanse edin. Şimdi 20 mikrolitre anti biyotin mikro boncuk ekleyin ve iyice karıştırmak için pipetleyin.
Soğuk inkübasyondan sonra 0.5 mililitre HBSS BSA çözeltisi ekleyin. Kolonu %0,5 BSA ile 0,5 mililitre HBSS ile durulamadan önce standı kurun. Daha sonra kolonun altına 15 mililitrelik bir tüp yerleştirin ve içinden 0,5 mililitre hücre süspansiyonu geçirin.
Kalıntı nöronal hücreleri yakalamak için% 0.5 BSA çözeltisi ile 0.5 mililitre HBSS ile üç yıkama gerçekleştirin. Sütunu mıknatıstan çıkarın ve 15 mililitrelik yeni bir tüpün içine yerleştirin. % 0.5 BSA ile bir mililitre HBSS ekleyin ve manyetik olarak etiketlenmiş nöronal olmayan hücreleri toplamak için pistonu kullanın.
Hücre santrifüjünden sonra, hücreleri% 0.5 BSA çözeltisi ile bir mililitre HBSS içinde yeniden süspanse edin. Parlak alan mikroskobu altında bir neubauer sayma odasındaki hücreleri sayın. LepR pozitif nöronlar 48 saat sonra nörit oluşturmaya başladı.
DIV4'te aksonal uzantılar ilerleme gösterirken, dendritik süreçler ortaya çıkmaya başladı. DIV6'da nöronlar yeterince gelişmiştir. İmmünofloresan çalışmalar, glial hücrelerin veya diğer nöronal olmayan hücrelerin gözlenmediğini göstermiştir.
Hücrelerin nöronal doğası, mikrotübül ilişkili protein iki boyama ile doğrulandı. DIV10'da LepR pozitif hücrelerin %30'u POMC eksprese etti. Heterojen hipotalamik nöronal popülasyonları içeren genel kültürlerde sinaptik bağlantı ve işlevsellik gözlendi.
