Tavuk siliyer ganglion, gözün arka kısmında lokalize bir yapıdır, koroid fissür optik sinir bitişik. Ve silikya ganglion nöronlar, parasempatik sinir sistemine ait, ve kolinerjik nöronlar, ve böylece kolinerjik sinapslar kurabilirsiniz. Siliyer ganglion siliyer nöronlar ve koroidal nöronların büyük bir nüfus oluşur, yapısal ve fonksiyonel olarak farklı.
Yani siliyer nöronlar göz içi kas innervates, ve koroidal nöronlar gözde ruh kası innerve eder. Ve kültürün ilk günlerinde, silyary ganglion nöronlar çok kutuplu morfolojisi sunarlar, ve bunlardan sonra, nötronlardan birinin uzanıp aksonu oluşturduğu tek kutuplu bir duruma geçmeye başlarlar. Silyary ganglion nöronlar kullanarak en yaygın çalışmalardan biri, nöromüsküler sinapsbir çalışma, kolinerjik sinaps, ve silyary ganglion nöronların kullanımı iyi bir alternatif haline gelmiştir, önceki modellere göre, elde edilen nöronal popülasyon, anlamda homojen olduğu için, tüm nöronlar kolinerjik, ve böylece kas hücreleri ile fonksiyonel sinaps oluşturabilirsiniz , Biz bir nöronal popülasyon ile çalışırken olmaz, bu tamamen kolinerjik değildir.
Kimlik ve siliyer ganglion diseksiyon ilk kez bunu yapan biri için oldukça zor olabilir, bu yüzden burada biz adım protokolü ile bir adım sağlamak, uygun tanımlama ve siliyer ganglion diseksiyon için, yanı sıra bu nöronların başarılı kültür için kurallar. Kapak kapaklarının hazırlanması için 13 milimetrelik cam kapaklar, aside dayanıklı bir kap, %65 nitrik asit, cımbız, Milli-Q su, %75 etanol ve orbital shaker gerekir. Birincil kültürler için kapak kapaklarının hazırlanması, işlemden iki gün önce yapılmalıdır.
Asit dirençli bir kap içine istenilen sayıda cam kapaklı dudak yerleştirin ve tüm kapaklar kapsanakadar %65 nitrik asit ekleyin. Bir orbital shaker konteyner yerleştirin ve ajitasyon ile oda sıcaklığında gece boyunca kuluçka. Ertesi gün, dikkatle nitrik asit kaldırmak ve yeniden kullanmak için yıldız.
Kapakları yıkayın, konteynere Milli-Q su ekleyin. Bir kez daha, 30 dakika ajitasyon yerleştirerek, yıkama çözeltisi atın ve bu işlemi beş kez tekrarlayın. %75 etanol kullanarak kapakları iki kez durula.
Özenle ayrı ve alüminyum folyo ile kaplı bir metal raf, bireysel kapakları yerleştirin ve 50 derece kuluçka, için 10 ila 15 dakika, ya da tamamen kuruyana kadar. 10 ila 15 dakika boyunca, UV ışığında kapakları sterilize. Kapakları kaplamak için, ihtiyacınız olacak, steril cam kapakları, 24-Well plaka, steril cımbız, mililitre PDL çözeltisi başına 0.1 miligram, steril su, mililitre laminin çözeltisi başına 10 mikrogram, düz nörobazal orta, ve silyary ganglion komple orta.
Kapak kaplaması, işlemden bir gün önce yapılmalıdır. Steril bir cızırtıcı kullanarak, 24-Well plaka her kuyuya bir coverslip yerleştirin, poli diyaliz çözeltisi 500 mikrolitre ekleyin, mililitre başına 0.1 miligram konsantrasyonda, ve 37 derece gecede kuluçka. Ertesi gün, kapakları steril suyla üç kez yıkayın, suyu atın ve her kuyuya mililitre başına 10 mikrogram konsantrasyonla 350 mikrolitre laminin çözeltisi ekleyin.
Bir kuvöze yerleştirin, 37 derecede iki saat boyunca. Bu süreden sonra, ve hücre kaplama önce, laminin çözeltisi kaldırmak, ve düz nörobazal orta 300 mikrolitre ile iki kez yıkayın. Tam orta 300 mikrolitre ekleyin ve bir kuvöz yerleştirin, 37 derece ve% 5 CO2, eğer plaka hücreleri hazır olana kadar.
Diseksiyon işlemi için, embriyonik gün yedi, 75% etanol, diseksiyon forseps sayısı 545 ve sayı 55, makas, bir kaşık, siyah alt ve buz gibi HBSS çözeltisi ile diseksiyon petri kapları tavuk yumurtası gerekir. Tüm diseksiyon araçlarını %75 etanolde sterilize edin. Yumurta bir yumurta kuluçka kuluçka önce 16 derece saklanmalıdır, 37.7 derece, yedi gün, ya da diğer istenen embriyonik aşamada.
İşlem günü, kuvözden yumurtaları çıkarın, yumurtaları %75 etanol püskürtün. Bir makas kullanarak yumurta üst alın ve dikkatle bir kaşık kullanarak embroy çıkarmak. Embriyo yerleştirin, buz gibi HBSS çözeltisi ile bir petri kabına, ve hemen vücuttan baş ayırmak, boyun bölgesinde keserek.
Sonra temiz buz soğuk HBSS çözeltisi ile yeni bir petri kabına baş aktarın. En kısa sürede embriyo yumurta kaldırılır, hücre ölümü sorumlu proteazlar üretmek mümkün. Bu yüzden mümkün olduğunca çabuk vücuttan baş ayırmak için önemlidir, bir kez embriyo hücre ölümünü en aza indirmek için yumurta dışında.
Ayrıca buz soğuk HBSS çözeltisi embriyo başkanı tutmak için çok önemlidir. Embriyo başını yukarı tutun ve civciv gagası içinde düzeltmek, ve sonra göz çevresindeki deri ince tabaka kaldırmaya başlar. Dikkatlice, yavaşça baş uzağa döndürerek göz çıkarın.
Ve civciv başından göz ayırırken, optik sinir kesitli fark. Arka tarafı ile göz tutun, ve siliyer ganglion fark, sensör optik sinir ve koroid fissür bitişik. Preganglionik sinir hala siliyer ganglion bağlı olabilir, onun belirlenmesini kolaylaştıran.
Her gözden silier ganglion diseksiyon ve aşırı doku kaldırarak çok iyi temizleyin. Buzun üzerinde HBSS çözeltisi bulunan bir petri kabına parçalanmış gangliyonu aktarın. Amacıyla mililitre başına yaklaşık 1 milyon hücre verimi var, 70 gangliyonu etrafında incelemek gerekir, ve aynı zamanda hücre popülasyonu elde edilen akılda tutmak, non-nöronal hücreler de vardır, bu yüzden non-nöronal hücrelerin sayısını azaltmak için, ve aynı zamanda nöral nüfusun saflığını artırmak için, çok iyi siliyer gangliyonu temizlemek için önemlidir , tüm fazla doku çıkarmadan.
Doku dissociation için, bir 24-Well plaka, 0.1% tripsin çözeltisi, eksik silikya ganglia orta, bir yangın cilalı cam pastör pipet ve plastik pasteur pipet gerekir. Önceden ıslak steril plastik pastör pipet, ve 15 ML tüp için tüm ciliyer ganglia toplamak ve 200 Gs.Carefully iki dakika için santrifüj, daha büyük bir hacim kaldırmak için bir pastör pipet kullanarak, tüm HBSS orta kaldırmak ve sonra, pelet yakın olduğunuzda, bir mikropipet kullanın. Bir mililitre 0.1% tripsin çözeltisi ekleyin ve 20 dakika kuluçka, bir su banyosunda 37 derece.
Santrifüj iki dakika, 200 Gs.Immediately, tripsin çözeltisi kaldırmak ve eksik orta bir mililitre ekleyin. Eksik ortamda serum, hemen tripsin aktivitesini durdurur. Santrifüj iki dakika, 200 Gs ve tüm orta kaldırın.
Tam orta 500 mikrolitre ekleyin ve bir P1000 mikropipet kullanarak doku dissociation başlar. Yukarı ve aşağı, 10-15 kez pipetleme ile başlayın ve sonra, bir yangın cilalı cam pastör pipet geçmek ve tekrar, pipet yukarı ve aşağı 10-15 kez. Hücre süspansiyonu, başarılı doku bölünmesinin bir işareti olarak bulanık hale gelmelidir.
Hücreleri ayrıştırmak için gerekli hacim bu elde edilen siliyer ganglia sayısına bağlıdır, ve pelet boyutu. Bir doku ayrıştırmak için yukarı ve aşağı pipetting zaman, bu oluşumu hava kabarcıkları önlemek için önemlidir, bu hücre kaybını en aza indirecektir. Hücreleri yeniden susaskıya sonra, kaplama kadar buz üzerinde hücre süspansiyon bırakabilirsiniz.
Neubauer odasında bir trippan mavi çözeltikullanarak hücresel yoğunluğu nu belirleyin. Bu kurşun hücre süspansiyon tam ortamda, 5FTU ile, istenilen yoğunlukta ve plaka 500 hücre mikrolitre başına iyi. Hücreleri 37 derecede ve %5 CO2'de kuluçkaya yatırın.
Her gün kültürümüzü kontrol ettiğinizden ve hücrelerin gelişimini takip ettiğinizden emin olun. Siliyer gangliyon hücreleri in vitro oldukça hızlı gelişir, ve bir gün sonra, biz zaten hücre vücudundan uzanan bazı nöritler görebilirsiniz. Yedi ila sekiz gün in vitro sonra, nöronal ağ çok iyi kurulmuş, ve hücreler en az 15 gün boyunca tutulabilir.
Bir gün in vitro sonra, siliyer ganglion nöronlar çok kutuplu mitoloji gösterir. Ancak, nöritler uzantısı hızla nöronlar görünür nöronal ağ kurulan oluşur, zaten 24 saat sonra. In vitro, siliyer ganglion nöronlar gözde kas innervasyonu sorumludur.
Ve böylece, bu nöronal kültürler, nöromüsküler sinapsların incelenmesi için çok uygundur. Bunun için, siliary ganglion nöronlar kas hücrelerinin üstüne kaplama olabilir. Burada, başarılı bir kültür göstermek, göz vitreus, CG nöronlar, göz V7 civciv pektral kas nöronlar üstünde.
Sinaptik vezikül belirteci, SV2, CG nöronlar aksonlar arasında kurulan aktif sinapslar göstermek, ve kas lifleri, kolayca birden fazla çekirdekleri tarafından tanımlanan. Bu protokol ile elde edilen siliary ganglion nöronlar diğerleri arasında immünositokimya, elektrofizyoloji ve sağkalım denemeler için uygundur. Bu diseksiyon protokolü, nöronların çok düşük sayıda verimleri, ama düzgün yapılırsa, kolinerjik nöronların saf nüfus sağlayacaktır.
Her gangliyonun çok iyi temizlenmesi ve fazla dokunun çıkarılması çok önemlidir. Bunun için, yüksek kaliteli aletler kullanılmalıdır, bu nedenle bu doku non-nöronal hücreler tarafından kontaminasyonönlemek için kaldırılabilir. Embriyonun yaşı protokolümüzün başarısını belirleyecek.
İdeal olarak, diseksiyon E7 ve E8 arasında yapılmalıdır. Bu zaman noktası çok önemlidir, çünkü bu aşamada, normalde in vitro olarak meydana gelen gelişimsel hücre ölümü henüz gerçekleşmemiştir. Bu nöronal olmayan hücrelerin kontaminasyonunu en aza indirmek için, glial hücrelerin ve fibroblastların büyümesini en aza indirmek için kültür medyasında 5FTU kullanıyoruz. Bu hücre modeli nueromusclar hastalığı çalışma için mükemmel bir alternatif sağlar.
Bu protokole dayanarak, örneğin belirli karbonatların ve spesifik proteinlerin alt hücre lokalizasyonunun sinaps oluşumunu ve işlevini nasıl düzenlediğigibi ek bilimsel sorular ele alınabilir. Ayrıca, nöromüsküler hastalıkların çalışma gibi daha fazla soru ele sinir kas co-kültürler kurmak oldukça kolaydır.
