We thank Dr. S. Szobota for helpful discussion on neuron culture and Ca-P transfection. L.W. acknowledges support from The Salk Innovation Grant, the California Institute for Regenerative Medicine (RN1-00577-1), and the National Institutes of Health (1DP2OD004744).

Mevcut çalışmada tüm işlemler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) Biyolojik Araştırmalar, The Salk Enstitüsü, La Jolla, CA hayvan taşıma için protokolleri onayladı kullanılarak yapıldı 1. UAA Kir2.1 Şirketleşme ve İlköğretim Nöronal Kültür Sonuç Pirk İfadesi <ol><li> DNA İnşaat <ol><li> UAA katılması için Kir2.1 bir hedef site seçin. Işığa cevap UAA Incorporated ile seçilen sitesi Kir2.1 fonksiyon 21 optik modülasyon sağlar, böylece Kir2.1 yapısı ve fonksiyonu hakkında ön bilgi ve bilgi Exploit. </li><li> TAG amber durdurma kodonunun mutasyona seçilen site ile bir rekombinant DNA şifreleyen Kir2.1 gen yapısı. Bir memeli ifade plazması içine Kir2.1-Tag DNA klonlamak için standart klonlama teknikleri 25 kullanın. </li><li> UAA için spesifik olan ve tepki olarak UAA dahil Klon tRNA / sentaz genleriBaşka bir memeli ifade içine TAG durdurma kodonu 21 plazmid. Not: iyi UAA dahil için, (tRNA, sentetaz ve Kir2.1 için), farklı promoterler ve gen kasetlerinin kombinasyonları, değişik plazmid test edilebilir. </li><li> miniprep kullanarak yüksek kaliteli plazmid DNA&#39;lar elde veya üreticinin protokolüne göre ticari kitler Maxiprep. 260/280 oranı 1.9 etrafında saflaştırılmış DNA için en uygunudur. Gerekli olduğunda, prepped DNA 25 saflığını kontrol etmek için bir agaroz jel elektroforezi gerçekleştirin. yüksek saflıkta, süper plazmid DNA&#39;lar nöronal transfeksiyon için en iyisidir. </li></ol></li><li> Kültür Sıçan Hipokampal İlköğretim Nöronlar <ol><li> Talep cam lamelleri (daireler, 12 mm çapında) 24 oyuklu plakalar içerisinde, her bir ilgili bir lamel ve kaplama her bir 0.5 mg, 250 ul / ml poli-D-lisin (100 mM borat tamponu: 1.24 g borik damıtılmış iyonu giderilmiş 400 ml asit ve 1.90 g sodyum tetraborat H2, O ya da GKD 2 </suOda sıcaklığında 10 saat boyunca üzerinde pH 8.5&#39;te b&gt; O) sızdırmaz. yavru başına yaklaşık 10-12 kaplı lamelleri hazırlayın. </li><li> Diseksiyon gününde, izofluran ile anestezi ve decapitating sonra doğum sonrası sıçan yavrularında (1-4 doğum sonrası gün) yenidoğan beyinleri toplamak. izofluran (% 2-4) ihtiva eden bir Anesthetization odası içinde yavrular anestezisi. Onlar bilincini kaybeder ve dokunsal uyaranlara ve pençeleri kısma yanıt vermeyen kadar bekleyin. </li><li> Standart teknik kullanımı 26 (~ 37 ° C), tuzlu su (10 mM HEPES ve Hank dengeli tuz çözeltisi içinde 20 mM D-glukoz), sıcak beyin hippocampi incelemek ve 4.5 ml ılık salin ile konik bir tüp içinde hippocampi toplamak . </li><li> Hipokampuslardan (% 0.25 son tripsin konsantrasyon)% 2.5 tripsin 500 ul ekleyin ve 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde 10 dakika inkübe edilir. </li><li> İyice tuzlu su (3 x 10 mi) ile öğüterek ile doku yıkayın. </li><li> 1 ml w ayrışmış nöronlar kurtarma% 5 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş en az temel ortam (MEM) içeren bir kolu büyüme ortamı, 21.2 mM D-glukoz, 2 mM L-glutamin,% 2 B-27 ve% 0.1 serum uzatıcı içermektedir. Not: yeni büyüme ortamı hazırlamak için diseksiyon gün L-glutamin ve B-27 ekleyin. </li><li> Bir hemasitometre ile nöronların sayın ve 1.0-1.5 x 10 5 hücre 24 oyuklu plakalarda lamelleri üzerine bunları plaka / oyuk 500 ul büyüme ortamı ile yoğunluğu sonra 40 um naylon elekle filtrelenmiştir. </li><li> % 5 CO2 içinde 35 ° C &#39;de nöronal kültür inkübe:% 95 hava nemlendirilmiş kuluçka 2-3 hafta. En iyi sonuç için, inkübasyon sırasında mümkün olduğunca kültürü rahatsız etmemek. </li></ol></li><li> İlköğretim Nöronal Kültür kalsiyum fosfat (Ca-P) Transfeksiyon <ol><li> 4 ° C&#39;de stok çözelti ve mağaza sağlayın: 0.5 M BES (N, N-bis [2-hidroksi-etil] -2-aminoetansülfonik asit) diretkeni (10x); 150 mM Na-2 HPO 4 (100x); 2.8 M NaCI (10 x); Steril GKD 2 O; Steril 1 N NaOH. </li><li> Transfeksiyon gününde, 0.22 um filtre ile GKD 2 O taze 2.5 M CaCI2 çözeltisi ve steril filtre edin. 0.22 um filtre ile pH 7.00 (NaOH ile pH ayarlanır) ve steril filtre 50 mM BES, 1.5 mM Na 2 HPO 4 ve 280 mM NaCI ihtiva eden taze 2x BES tamponlu tuz (BBS) tampon sağlayın. Not: transfekte edilecek CaCl2 çözeltisi ve lamelleri sayısına bağlı olarak BBS tampon miktarını hesaplayın. Ayrıca 1.3.4 bak. </li><li> 500 ul taze önceden ısıtılmış transfeksiyon büyüme ortamı ile kültür büyüme ortamı değiştirin. (Transfeksiyon ortamı MEM artı 21.2 mM D-glükoz ile yapılabilir). Not: eski medya atmayın. </li><li> GKD 2 O miktarını hesaplayın ve 1.65 ul CaCl2, 0.7 ug DNA ve 16.5-ihtiva eden transfeksiyon solüsyonu (her lamel başına 33 ul) yapmak için eklemek için hazırlamak# 181; l 2x BBS. </li><li> Kültür eklemeden hemen önce transfeksiyon solüsyonu hazırlayın. Yavaş yavaş tüp çalkalanırken hazırlamak için, öncelikle CaCl2 ve GKD 2 O birleştirir. solüsyon içine DNA eklemek yavaş yavaş ajitasyon devam edin ve. ajite ederken Son olarak, 2x BBS tampon damla damla ekleyin. </li><li> Hemen nöronal kültür her lamel transfeksiyon solüsyonu 30 ul ekle. </li><li> 45 dakika-1 saat boyunca bir% 95 hava nemlendirilmiş kuluçka makinesinde: çözelti karışımı ve% 5 CO2 içinde 35 ° C de inkübe etmek kültür kabı birkaç kez sallayın. nöronlar transfeksiyon solüsyonu ile inkübe edildikten sonra, çok ince bir Ca-P çökeltiler nöronlar kapsayan bir tabaka oluşturmak olacaktır. </li><li> 500 ul önceden ısıtılmış yıkama tamponu (135 mM NaCI, 20 mM HEPES, 4 mM KCI, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na 2 HPO 4, pH 7.3, 10 mM glukoz, steril transfeksiyon ortamı yerine 0.22 um&#39;lik bir filtreden süzüldü) ve 35 inkübe6; C,% 5 CO 2: 15-20 dakika boyunca% 95 hava nemlendirilmiş kuluçka makinesinde. Ca-P çökeltiler yıkama adımından sonra yok olur. </li><li> 500 ul taze büyüme ortamı ile yıkama tamponu değiştirin. Yine, kaydedilmiş orijinal medya ile büyüme ortamı değiştirin. </li><li> 1 mM nihai konsantrasyon elde etmek kültür (50 ul, sıcak büyüme ortamı içinde önceden karıştırılmış) UAA CMN ekleyin. </li><li> % 5 CO2 içinde 35 ° C &#39;de, transfekte kültürü inkübe:% 95 hava nemlendirilmiş kuluçka deneylerinden önce 12-48 saat. </li></ol></li><li> Işık Aktivasyon ile tüm Hücre Kaydı <ol><li> Ekstra / hücre içi çözümler hazırlayın. Hücre-içi solüsyon 135 mM potasyum glukonat, 10 mM NaCI, 2 mM MgCI2, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, 2.56 mM K 2 ATP ve pH 7.4&#39;te 0.3 mM Li 2 GTP içerir. Hücre dışı kayıt çözeltisi, 150 mM NaCI, 3 mM KCI, ihtiva eden 5 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2, 5 mM glukoz, pH 7.4, 10 mM HEPES. </li><li&gt; Tam hücreli yama sıkma için elektrofizyoloji teçhizat ayarlayın: mikroskop 4X ve 20X hedefleri, diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve mCitrine filtresi ile donatılmış (: 495/10 nm, emisyon: eksitasyon 525/25 nm); manipülatör; patch-kelepçe amplifikatör; sayısallaştırıcı; veri toplama ve analiz yazılımı. <ol><li> 45 ° &#39;lik açıyla 1 cm uzakta odak noktasına ışık sunmak için teçhizat mikroskop ile 385 nm emisyon ile bir ışık yayan diyot (LED) yükleyin. hafif bir güç metre ile LED gücünü kontrol edin. </li></ol></li><li> 3-6 MQ pipet direncine sahip olması ticari bir mikropipet çektirmenin kullanarak cam elektrotlar yama pipetler çekin. mikropipet çektirmenin kurmak için üreticinin talimatlarını izleyin. <ol><li> pipet direnci test etmek için, öncelikle hücre içi solüsyonu ile pipet doldurmak ve elektrot tutucu üzerine yerleştirin. mikroskop p yerleştirilen hücre dışı solüsyonu ile dolu bir 35 mm kültür çanak pipet, Diplatform. Bir devreyi tamamlamak için çanak içine bir toprak elektrot batırın. </li><li> amplifikatör / sayısallaştırıcı açın ve bir veri toplama yazılımı başlatın. Bir zar test protokolü ile pipet direnci izleyin. </li></ol></li><li> inkübatör nöron kültürü bir lamel çıkarın ve hücre dışı çözeltide kez yıkayın. Vakum gres kullanarak, taze hücre dışı solüsyonu ile dolu bir 35 mm kültür çanak ortasında lamel basılı tutun. </li><li> elektrofizyoloji mikroskop platformu üzerinde lamel / çanak yerleştirin. </li><li> Standart yama sıkma teknikleri kullanılarak, mCitrine floresan 27 ile bir nöron yama. Geçerli kelepçesini (I-kelepçe) yöntemi kullanılarak Tutanak nöronal aktivitenin. İlk olarak, küçük bir akım enjekte edilerek etrafında -72 mV dinlenme potansiyelini ayarlayın. Ardından, aksiyon potansiyelinin sürekli ateş (5-15 Hz) ikna etmek için bir adım akımı (10-200 pA) enjekte edilir. </li><li> El ile ya da veri toplama yazılımı kullanarak, bir darbe flaş (bir günahnöron LED ışığı 100 milisaniye -1 sn süresi) ve gle darbe kayıt ve aksiyon potansiyelleri etkilenen olmadığını görmek ise. </li><li> Banyo için 0.5 mM BaCl 2 ekleyin ve aksiyon potansiyelleri kurtarıldı olmadığını kontrol edin. </li></ol></li></ol> 2. UAA Kir2.1 Şirketleşme ve In Vivo Fare Embriyonik Beyin Sonuç Pirk İfadesi <ol><li> DNA İnşaat <ol><li> Adım 1.1 gibi benzer plazmid DNA tasarlayın. In vivo ekspresyon için, örneğin CAG (CMV arttırıcı tavuk beta-aktin promoteri) gibi güçlü bir promoter kullanımı. </li><li> üreticinin protokolüne uygun olarak bir endotoksin içermeyen maksi ticari kit ile DNA saflaştırılır. (2-5 mg / ml kondanse) son derece yüksek kaliteli DNA elde etmek için etanol ile çökeltme 25, ardından fenol-kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Fare Embriyonik Neokortekse utero elektroporasyon Not: Temel Techniutero elektroporasyon için que önce 28 tarif edilmiştir. <ol><li> sodyum pentobarbital (intraperitoneal enjeksiyon, gram vücut ağırlığı başına 50 mg) veya izofluran (inhalasyon,% 2-4) ile embriyonik gün 14.5 (E14.5) bir zaman aşımına hamile fare anestezisi. bilinç kaybı ve dokunsal uyaranlara yanıt kontrol ederek ve pençelerinin sıkıştığı anestezi derinliği izleyin. </li><li> Karın orta hat küçük bir kesi yapmak. Yavaşça forseps ve parmak uçları ile rahim boynuzları maruz kalmaktadır. </li><li> rahim duvarı içeri sokulan bir cam pipet ile, her yavru yanal ventrikül içine 1 ul DNA çözeltisi (her plazmid 2-5 ug / ml, yapısına göre) enjekte edilir. Pek çok durumda, toplam embriyoların yaklaşık% 60-80 enjekte edilir. </li><li> Bir Elektroporatör (33-35 V, 50 msn süresi 950 msn aralık, 4-8 bakliyat) ile embriyolar electroporate. </li><li> için hafifçe karın boşluğuna rahim boynuzları dönmekceps ve parmak uçları. kas duvarını dikin ve daha sonra cerrahi sütür ile cilt embriyoların gelişimi devam etmesi için. </li></ol></li><li> UAA Mikroenjeksiyon <ol><li> E16.5 tekrar karın orta hat küçük bir kesi yapmak ve yavaşça forseps ve parmak uçları ile rahim boynuzları maruz kalmaktadır. </li><li> Elektroporasyona yan veya rahim duvarında sokulan bir cam pipet ile lateral ventrikül her iki taraf için yaklaşık 2-5 | il CMN-Ala (500 mM) enjekte edilir. In vivo 21 Kazablanka teslim dipeptit CMN-Ala (CMN-alanin) kullanın CMN biyoyararlanımını arttırmak için. </li><li> Yine, forseps ve parmak uçlarınızla hafifçe karın boşluğuna rahim boynuzları geri dönün. kas duvarını dikin ve daha sonra cerrahi sütür ile cilt embriyoların gelişimi devam etmesi için. </li></ol></li><li> Akut Beyin Dilimler elde <ol><li> 119 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 1.3 mM MgCI2, 2.5 mM CaC ihtiva eden 1 L&#39;lik yapay serebrospinal akışkan (ACSF) yapmak <sub&gt; 2, pH 7.3 1 mM NaH 2 PO 4, 26.2 mM NaHCO 3 ve 11 mM glükoz. </li><li> 20-30 dakika boyunca -80 ° C&#39;de 200 mi ACSF ve hızlı dondurma al. Kabarcık% 5 CO 2 ile ACSF kalan:% 95 O 2 gazı, oda sıcaklığında. </li><li> Hazırlayın ve embriyoların beyinleri hasat cerrahi aletler sterilize. Ayrıca bir kova buz hazırlamak. </li><li> bir mikrodalga içinde ısıtılarak bir şişe içinde ~ 100 mi% 4 düşük erime noktasına sahip agaroz çözeltisi olun. katılaşmaya başlamadan önce yaklaşık 5 dakika boyunca çözelti önce soğumaya. </li><li> CO 2 doz aşımı ile CMN-Ala enjeksiyonundan sonra fare 12-24 saat euthanize. Karın alanda büyük kesiler yapmak ve ince makas ve forseps ile rahim Electroporated / microinjected embriyoların teşrih. </li><li> ince makas ve forseps ile embriyoların hasat beyinleri. </li><li> buz kovası yerleştirilen 10 cm kültür çanak her beyin yerleştirin. Keskin bir bıçak kullanarak iki hemisfer bölün ve her yeryemeğin dibini dokunmadan midsagital uçağı ile yemeğin üzerine yarımkürede. Çabuk (yarımkürede başına 500 ul civarında) beyinleri üzerinde agaroz çözüm dökün. </li><li> Keskin bir bıçak kullanarak, kare bir beyin gömülü agaroz blok yapmak için bir beyin çevresinde agaroz kesti. </li><li> doku yapıştırıcısı kullanarak, vibratome için bir montaj üzerinde agaroz bloğunun midsagital düzlem yüzeyi aşağı tutkal. Önceden soğutulmuş ACSF vibratome odasına doldurun ve 200 mikron sagital beyin dilimleri kesti. </li><li> % 95 O 2 gaz:% 5 CO2 ile kabarcıklar ise 42 dakika boyunca 33 ° C&#39;de 3 mM miyo -inositol, 0.4 mM askorbik asit ve 2 mM sodyum piruvat ile takviye edilmiş ACSF akut dilimleri inkübe edin. </li><li> 42 dakika sonra, ısıtıcıyı kapatın ve köpürme ile oda sıcaklığında dilim inkübe devam ediyor. ısıtıcı kapattıktan sonra tüm hücre yama kaydetmeye en az 15 dakika başlatın. </li></ol></li><li> Işık Aktivasyon ile tüm Hücre Kaydı <ol><li> InTrac hazırlayın130 mM potasyum glukonat, 4 mM MgCI2, 5 mM HEPES, 1.1 mM EGTA, 3.4 mM Na-2 ATP, 10 mM sodyum fosfat, kreatin ve KOH ile ayarlanmış pH 7.3 0.1 mM Na-3 GTP ihtiva ellular çözeltisi. </li><li> 3-6 MQ pipet direncine sahip olması ticari bir mikropipet çektirmenin kullanarak cam elektrotlar yama pipetler çekin. </li><li> tam hücreli yama sıkma için dilim elektrofizyoloji teçhizat kurmak ve 2 ml / perfüzyon pompası ile en az oranda ACSF kayıt odasına superfuse. yaklaşık 33 ° C&#39;ye odası sıcaklığını ayarlamak. Not: Dilim elektrofizyoloji teçhizat bir perfüzyon odasının, bir suya daldırma objektif ve bir sıcaklık kontrolörü ile donatılmıştır. Ayrıca, GFP filtresi (uyarma: 480/30 nm, emisyon: 535/40 nm) ve mCherry filtre (uyarma: 580/20 nm emisyon: 675/130 nm) gereklidir. <ol><li> Bir 45 ° 1 cm uzakta odak noktasına ışık sunmak için teçhizat mikroskop ile 385 nm emisyon LED yükleyinaçısı. hafif bir güç metre ile LED gücünü kontrol edin. </li></ol></li><li> Dikkatle perfüzyon odasında bir cam pipet ve yer ile bir beyin dilim almak. Bir harp ile dilim basılı tutun. </li><li> Neokortikal bölgeden 27 MCherry / GFP floresan ile bir nöron yama. Gerilim kelepçesini (V-kelepçe) yöntemini kullanarak kayıt Pirk etkinliği. İlk olarak, -60 mV membran potansiyeli tutun. Ardından, sabit negatif membran potansiyelleri (-100 mV) veya voltaj rampaları (40 mV -100 mV) rekor akımları. Özellikle, -100 mV Kir2.1 belirli içeri doğru akımlar izlemek. </li><li> El ile ya da veri toplama yazılımı kullanarak, kayıt sırasında nöron LED ışık darbe (100 milisaniye -1 sn süresi, tek bir darbe) yanıp söner ve Pirk proteinleri aktive olmadığını görmek. Pirk aktive edildiğinde, -100 mV&#39;de içeri doğru akımlar önemli ölçüde artacaktır. </li><li> Banyo için 0.5 mM BaCl 2 ekleyin ve Pirk yeniden inaktive olup olmadığını kontrol edin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Fork, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Stimulation+of+Nerve+Cells+in+Aplysia.">Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia.</a> Science. 171 (3974), 907-908 (1971).</li><li>Callaway, E. M., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photostimulation+using+caged+glutamate+reveals+functional+circuitry+in+living+brain+slices.">Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (16), 7661-7665 (1993).</li><li>Cambridge, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline-dependent+photoactivated+gene+expression+in+eukaryotic+systems.">Doxycycline-dependent photoactivated gene expression in eukaryotic systems.</a> Nat. Methods. 6 (7), 527-531 (2009).</li><li>Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitatory+cortical+neurons+form+fine-scale+functional+networks.">Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks.</a> Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).</li><li>Bernstein, J. G., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+tools+for+analyzing+the+neural+circuits+of+behavior.">Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior.</a> Trends Cogn. Sci. 15 (12), 592-600 (2011).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annu. Rev. Neurosci. 34 (1), 389-412 (2011).</li><li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li><li>Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+ion+channels+for+remote+control+of+neuronal+firing.">Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing.</a> Nat. Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).</li><li>Volgraf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+control+of+an+ionotropic+glutamate+receptor+with+an+optical+switch.">Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch.</a> Nat. Chem. Biol. 2 (1), 47-52 (2006).</li><li>Szobota, S., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+neuronal+activity.">Optical control of neuronal activity.</a> Annu. Rev. Biophys. 39 (1), 329-348 (2010).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo.">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+disulfide+connectivity+using+backbone+ester+hydrolysis.">Mapping disulfide connectivity using backbone ester hydrolysis.</a> Biochemistry. 38 (43), 14409-14415 (1999).</li><li>Philipson, K. D., Gallivan, J. P., Brandt, G. S., Dougherty, D. A., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+caged+cysteine+and+caged+tyrosine+into+a+transmembrane+segment+of+the+nicotinic+ACh+receptor.">Incorporation of caged cysteine and caged tyrosine into a transmembrane segment of the nicotinic ACh receptor.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 281 (1), C195-C206 (2001).</li><li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+decaging+leads+to+substantial+membrane+trafficking+during+modulation+of+an+inward+rectifier+potassium+channel.">Tyrosine decaging leads to substantial membrane trafficking during modulation of an inward rectifier potassium channel.</a> J. Gen. Physiol. 117 (2), 103-118 (2001).</li><li>Liu, C. C., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adding+new+chemistries+to+the+genetic+code.">Adding new chemistries to the genetic code.</a> Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 413-444 (2010).</li><li>Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code+of+Escherichia+coli.">Expanding the genetic code of Escherichia coli.</a> Science. 292 (5516), 498-500 (2001).</li><li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code.">Expanding the genetic code.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35 (1), 225-249 (2006).</li><li>Wang, Q., Parrish, A. R., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+genetic+code+for+biological+studies.">Expanding the genetic code for biological studies.</a> Chem. Biol. 16 (3), 323-336 (2009).</li><li>Shen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoding+unnatural+amino+acids+in+neural+stem+cells+and+optically+reporting+voltage-sensitive+domain+changes+in+differentiated+neurons.">Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons.</a> Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoding+unnatural+amino+acids+for+cellular+and+neuronal+studies.">Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies.</a> Nat. Neurosci. 10 (8), 1063-1072 (2007).</li><li>Kang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+expression+of+a+light-activatable+potassium+channel+using+unnatural+amino+acids.">In vivo expression of a light-activatable potassium channel using unnatural amino acids.</a> Neuron. 80 (2), 358-370 (2013).</li><li>Bichet, D., Haass, F. A., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merging+functional+studies+with+structures+of+inward-rectifier+K(+)+channels.">Merging functional studies with structures of inward-rectifier K(+) channels.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (12), 957-967 (2003).</li><li>Burrone, J., O'Byrne, M., Murthy, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+synaptic+plasticity+triggered+by+selective+suppression+of+activity+in+individual+neurons.">Multiple forms of synaptic plasticity triggered by selective suppression of activity in individual neurons.</a> Nature. 420 (6914), 414-418 (2002).</li><li>Johns, D. C., Marx, R., Mains, R. E., O'Rourke, B., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+genetic+suppression+of+neuronal+excitability.">Inducible genetic suppression of neuronal excitability.</a> J. Neurosci. 19 (5), 1691-1697 (1999).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A laboratory manual. , (2001).</li><li>Beaudoin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex.">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).</li><li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+protein+phosphorylation+with+a+genetically+encoded+photocaged+amino+acid.">Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid.</a> Nat. Chem. Biol. 3 (12), 769-772 (2007).</li><li>Coin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+chemical+probes+in+cells+reveal+the+binding+path+of+urocortin-I+to+CRF+class+B+GPCR.">Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR.</a> Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).</li><li>Takimoto, J. K., Xiang, Z., Kang, J. Y., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esterification+of+an+unnatural+amino+acid+structurally+deviating+from+canonical+amino+acids+promotes+its+uptake+and+incorporation+into+proteins+in+mammalian+cells.">Esterification of an unnatural amino acid structurally deviating from canonical amino acids promotes its uptake and incorporation into proteins in mammalian cells.</a> Chembiochem. 11 (16), 2268-2272 (2010).</li><li>Parrish, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+Genetic+Code+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Bacterial+Aminoacyl-tRNA+Synthetase/tRNA+Pairs.">Expanding the Genetic Code of Caenorhabditis elegans Using Bacterial Aminoacyl-tRNA Synthetase/tRNA Pairs.</a> ACS Chem. Biol. 7 (7), 1292-1302 (2012).</li><li>Lu, H., Klaassen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution+and+thyroid+hormone+regulation+of+Pept1+and+Pept2+mRNA+in+rodents.">Tissue distribution and thyroid hormone regulation of Pept1 and Pept2 mRNA in rodents.</a> Peptides. 27 (4), 850-857 (2006).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li><li>Plaster, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+Kir2.1+cause+the+developmental+and+episodic+electrical+phenotypes+of+Andersen's+syndrome.">Mutations in Kir2.1 cause the developmental and episodic electrical phenotypes of Andersen's syndrome.</a> Cell. 105 (4), 511-519 (2001).</li><li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+form+of+short+QT+syndrome+(SQT3)+is+caused+by+a+mutation+in+the+KCNJ2+gene.">A novel form of short QT syndrome (SQT3) is caused by a mutation in the KCNJ2 gene.</a> Circ. Res. 96 (7), 800-807 (2005).</li><li>Beene, D. L., Dougherty, D. A., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+mapping+ion+channel+function.">Unnatural amino acid mutagenesis in mapping ion channel function.</a> Curr Opin Neurobiol. 13 (3), 264-270 (2003).</li><li>Hoppmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoding+photoswitchable+click+amino+acids+in+Escherichia+coli+and+mammalian+cells.">Genetically encoding photoswitchable click amino acids in Escherichia coli and mammalian cells.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).</li><li>Hoppmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Formation+of+an+Azo+Bridge+on+Proteins+Controllable+by+Visible+Light.">In Situ Formation of an Azo Bridge on Proteins Controllable by Visible Light.</a> J Am Chem Soc. 137 (35), 11218-11221 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Etkili fotoğraf modülasyon elde etmek için, önemli ilk adımdır nerede hedef protein ışığa cevap UAA&#39;yı dahil etmek karar vermektir. hedef proteinin yapısal ve işlevsel bilgiler aday sitelerin seçimi rehberlik çok yararlıdır. Aynı zamanda, hafif yönetmeliğin amacı en uygun hangi site belirleyecek. Aday siteleri seçtikten sonra, biz birincil nöronlar ve in vivo geçmeden önce İnsan Embriyonik Böbrek (HEK) kolay kültür ve manipülasyon için hücreler gibi memeli hücre hatlarında siteleri test etmek için tavsiye ediyoruz. Kir2.1 fotoaktivasyon için bir site tanımlamak için, Kir2.1 ve gözenek boyunca birden çok site başlangıçta HEK hücrelerinde test edilmiştir. CMN yan zincirleri iyonik geçişini engellemek için C169 bulunduğu Kir2.1 gözenek boyutu CMN yan zincirler barındıracak kadar büyük ama yeterince küçük olduğundan Kir2.1 ve C169, optimum bulundu. CMN Kir2.1 bölgesindeki C169 de dahil edildiğinde HEK hücreleri olarak ifade to mutant Kir2.1 inaktif olduğunu ve sonuç ancak başarılı Pirk gelişimini 21 doğrulayan bir ışık kısa pule üzerine devreye oldu. Etkin dik tRNA sentetazı ekspresyonu ve hücreler ve in vivo yüksek UAA dahil verim elde etmek için kritiktir. Ortogonal sintetaz geninin etkili bir şekilde genellikle memeli hücreleri ve nöronların kullanılan polimeraz II promoteri ve poli-A sinyallerini kullanarak ifade edilir. Daha önce tarif edildiği gibi 18,20 birlikte 3&#39;-komşu dizisi ile Burada kullanılan H1 promoter olarak ortogonal tRNA, özel bir tip-3 polimeraz III promoter sentezlenmesi için ihtiyaç vardır. In vivo çalışmalar için, biz tRNA ifade kasetinin üç nüsha bir kopyasını (Şekil 5A) ile karşılaştırıldığında Kazablanka kuruluş verimliliğini artırdığını buldular. Memeli hücrelerinde bir başka çalışmada, tRNA sentezleme kasetinin artan sayıda da UAA dahil verim 30 artmıştır. TherUAA dahil etkinliği geliştirme ihtiyacı olduğunda efore, farklı UAAS hücreler ve hedef proteinler için tRNA ekspresyon kasetlerinin sayısını optimize öneriyoruz. Hücreler ve in vivo UAAS Biyo UAA dahil edilmesi için bir başka önemli bir faktördür. Daha önceki çalışmalar UAAS bu esterleştirme memeli hücrelerinde 31 bunların kabul artışlar göstermiştir, ve dipeptit şeklinde UAAS Bu hazırlık Caenorhabditis elegans 32 hücrelere UAA alımını arttırır. Biz doğrudan doğruya nöronal kültür ortamına Kazablanka besleme vivo 21 fare beyninde edilmek üzere Kir2.1 içinde CMN şirketleşme kültüre birincil nöronlar ifade için yeterli, ancak yetersiz olduğunu gördük. Bu nedenle, dipeptit CMN-Ala sentezlendi ve fare beyin içine enjekte edildi. Oligopeptid taşıyıcı PEPT2 yüksek nöronlara dipeptidin taşıma kolaylaştırabilir kemirgen beyin 33 olarak ifade edilir. içselleştirilmiş DIPEptide dahil edilmesi için UAA CMN vermek üzere, hücresel peptidazlar ile hidrolize olacaktır. Nitekim, bu optimizasyon biz neocortex, talamus ve hipotalamus 21 olmak üzere embriyonik fare beyninin birden fazla bölgeye, nöronal proteinlerin içine verimli CMN birleşmesini sağlamıştır. nöronlarda başarılı Pirk ifadesi sağlıklı nöronal kültür hazırlanması kuvvetlice bağlıdır. protokolde her adımda bir hassas ve titiz bir şekilde yapılmalıdır. Kültür hazırlanmasından sonra, bu rahatsızlık olmadan inkübatör kültürünü korumak için en iyisidir. Açılış ve inkübatör kapısını kapatarak, yanı sıra ve inkübatör dışına kültür çanak hareketli kültür kalitesinin zarar ekleyebilirsiniz. Alt enkübatör sıcaklığı, (yerine 37 ° C, 35 ° C), eksitotoksisiteyi azaltmada yardımcı olur. Benzer bir not, Ca-P transfeksiyon ekstra dikkatli yapılmalıdır. 2x BBS tampon hazırlanması kritik bir adımdır. Cali için iyi bir fikirdirYeni DNA yapıları veya prepler transfeksiyon koşulları değişebilir, çünkü pH 6,90-7,15 arasında 2x BBS tampon için en uygun pH değeri brate. tutarlı sonuçlar elde etmek yardımcı olur, tampon pH 0.01 basamak hassasiyetle ayarlanmış olabilir. Transfeksiyondan önce, nöronal kültürünün büyüme ortamı, taze bir tane ile değiştirilir. Orijinal büyüme ortamı kaydetmek ve orijinal durumuna geri yüklemek için transfeksiyondan sonra geri kültürü eklemek için çok önemlidir. bu tür nöronlardan salınan büyüme faktörleri gibi hücre çoğalması için anahtar molekülleri yoksun beri transfeksiyondan sonra taze ortamda nöron kültürü bakımı, kurtarma gelen nöronlar müdahale olacaktır. kültürlenmiş hücreler ve doku dilimleri Pirk ışık aktivasyonu, uygun ışık kaynağı ve bir yöntem için tespit edilmesi gerekmektedir. Cmn uzun ve orta dalga UV ışıkları (280-400 nm) emer. Ancak, özellikle kısa dalga boylu UV ışığına, hücrelere zararlı olacağını, UV ışınlarına maruz kalma uzattı. sam ate zaman, uzak-kırmızı ışık hücreleri perturbing numune ısınmaya başladı. Bu nedenle, tek bir dalga boyu emisyon olan bir LED Pirk aktivasyonu için en uygunudur. seçildi; CMN photolysis, bir 385 nm (Prizmatix ~ 40 mW) emisyonu LED. LED harici mikroskop yakınına monte edilir ve bir fiber optik odak nöron tam ışık sağlamak için kullanılır. tekrarlanabilir veri toplama için, fiber optik 1 cm uzakta odak nöron 45 ° açıyla ayarlanır. Numunenin ışık gücü 40 mW / cm 2 ölçüldü. Aynı zamanda periyodik olarak bir optik güç ölçer kullanılarak LED performansını kontrol edilmesi tavsiye edilir. Bu utero elektroporasyon genetik in vivo UAAS birleştirmek için etkili bir teknik olduğunu göstermektedir. Küçük değişiklikler yapılarak, daha önce tarif edildiği gibi 34, fare embriyonik neokorteks plazmid DNA&#39;ların utero elektroporasyon gerçekleştirilir. neonata bölgesindeki Pirk proteinleri ifade etmek içinl fare beyinleri, iki cerrahi prosedürler (Şekil 5B) gereklidir. İlk adım, elektroporasyon, ardından Pirk ifadesi için gen yapıları enjekte edilmesidir. İki gün sonra, ikinci beyin enjeksiyon CMN-Ala teslim yapılır. Bu proficiently çok fazla hayvan zorlamadan ameliyatları gerçekleştirmek için pratik gerektirir. Her ameliyat sonrası, hayvanların sonra baktım edilmeli ve kurtarma boyunca düzenli olarak kontrol etti. Beyinde CMN Yeterli ve zamanında elde edilebilirliğini doğru Pirk ifadesi için gereklidir. CMN-Ala (500 mM) 2-5 | il tipik olarak bir embriyonik beyin enjekte edilir. Bazen, uzun CMN temini için electroporated tarafa dağılırdı hem Electroporated ve karşı taraftan CMN-Ala beri ters yarımkürede, üzerinde ventrikülde CMN-Ala enjekte yardımcı olur. Utero elektroporasyon genel faydasını dikkate alındığında, bu teknik, neokortikal nöronlar için değil, nöronlara sadece uygulanabilirBu elektroporasyon / enjeksiyon bölgesinde, her bir bölge için ayarlanır striatum, diensefalon ve serebellum gibi diğer beyin bölgelerinde. Embriyonik / yenidoğan beyinleri yetişkin beyinlerinde çok daha yumuşak, bu yüzden elektrofizyoloji deneyleri için akut dilim almak zor olurdu. Agaroz katıştırma vibratome kesme için embriyonik beyin yapısını stabilize yardımcı olur. düşük erime noktası agaroz beyin dokularına sıcaklık şoku en aza indirir rağmen soğuk beyinleri üzerinde erimiş agaroz dökülmesi sırasında, dikkatli gereklidir. Agaroz gömme doku sıcaklık şok etkisi tam hücre kayıt sırasında farkedilemez oldu. Genetik olarak kendi doğal ortamında ışık çeşitli nöronal protein aktivitelerini denetlemek için Optogenetic tekniği elde burada Pirk ile örneklenen, kültürlü nöronlar ve in vivo olarak ışığa cevap UAAS olacaktır kodlayan. Geçerli protokol Pirk ifade ve aktivasyon deneyleri i gerçekleştirmek için bir adım-adım prosedürü sunarnöronal kültür in vitro ve memeli beyinlerinde kullanılmak üzere UAA sisteminin ilk başarılı gelişimini temsil in vivo kemirgen beyinlerindeki, n. Birçok doğal proteinlerin araştırma gibi hastalıklarda ima yarar potansiyeline sahiptir. Örneğin, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-isoxazolepropionic asit (AMPA) receptors ve N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörleri, Kir2.1 kanalları içindeki zar yapılarını paylaşmaktadır. Nedenle, bu ligand-kapılı iyon kanallarının Pirk yöntemi uygulamak için uygun olabilir. Ayrıca, Pirk tekniği aynı zamanda Andersen&#39;in sendromu ve kalp kısa QT sendromu 35,36 olarak Kir2.1 ilgili genetik hastalıkların patofizyolojisi ele yararlanılabilir. &quot;Blok ve salım&quot; ek olarak CMN ile Cys, örneğin tirosin, serin, lisin, glutamat, aspartat, ve glisin gibi çeşitli amino asitler, farklı photoreleasable grupları 37 ile kafes edilmiştir. Böylece, benzer stratejiler kullanmak olabilird, in vitro ve in vivo olarak nöronların bu amino asitlerin fotoğrafı-düzenler. Bundan başka, döner optik kontrol UAAS azobenzen içeren ile elde edilebilir, ve bu UAAS artık genetik olarak E. kodlanmış E. coli ve memeli hücreleri, 38,39. Özet olarak, bu protokol ışıkla kendi ana ayarlar nöronal proteinlerin aktivitesini kontrol etmek için genel bir yöntem sunulur. opsin-aile ve diğer ışığa duyarlı proteinler veya etki içeren diğer optogenetic yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem genetik ışığa duyarlı UAAS ve değişimi tek bir kalıntı kodlanmış kullanır. Bu nedenle, çalışma kapsamında hedef proteinin işlevi, insan ticareti ve lokalizasyon minimal girişim olması gerekir. Yüksek site seçiciliği ayrıntılı molekül inceleme için daha fazla esneklik ve özgüllük temin eden bu genetik olarak kodlanmış ışık duyarlı UAAS ile elde edilebilir. Bu protokol aynı zamanda ilk co sağlarmprehensive, kolay takip başarılı in vitro ve in vivo nöron proteinler halinde UAAS nasıl ekleneceğini prosedürü. In vitro nöronlarda ve in vivo genetik olarak kodlanmış UAAS aracılığıyla genel proteinlerin optik kontrol temel ve translasyonel hem bilim yararına büyük bir potansiyele sahiptir ve bu protokol uygulanmasını teşvik yardımcı olacaktır.

Geleneksel elektrik stimülasyonu ile karşılaştırıldığında, photostimulation örneklerinin fizyolojik sisteme en az müdahale ile daha zamansal ve uzamsal çözünürlük sunuyor. 1971 1 nöronların teşvik etmek lazerler kullanarak gösteri yana birçok yaratıcı yollar dışsal olarak ışık ile nöronal aktiviteyi kontrol etmek icat edilmiştir. Photocaged agonistlerin Optik sürümü uzun ligandlar 2,3,4 nöronal ağ fizyolojik yanıtı incelemek için kullanılır olmuştur. Bu teknik sayesinde kafesli agonistlerin difüzyon özgünlüğü sınırlıdır. Genetik özgünlüğü ektopik ifade ışığa duyarlı opsin kanalları ile elde ve 5,6,7 pompalar ve başarıyla çeşitli model organizmaların seçilen nöron ağları modüle uygulanmıştır edilir. Bununla birlikte, diğer proteinlere opsin proteinlerden photoresponsiveness aşılama için, optik olarak çeşitli diğer nöronal proteinlerin kontrol etmek için bu yöntemi uygulamak zor olacaktır olacağını gerÇalışmanın altında proteinin doğal özelliklerini değiştirebilir yoğun mühendislik gerektiren d. Kimyasal olarak bir proteine ​​bir ekzojen ışığa ligand kanal proteinlerinin 8,9,10 işlevselliğini kontrol etmek için başka bir yol göstermiştir hayvan zinciri. Ligand sunulan veya azobenzen yarımının fotoizomerleşme yoluyla protein bağlama sahasına geri çekilir. Bağ kimyası hücre tarafı ve hücre içi proteinleri hariç temel olarak zar proteinlerinin hücre dışı tarafına uygulanmasını kısıtlar. Işığa duyarlı UAAS, proteinler dahil edildikten sonra, ışık proteinleri işlemek için genel bir strateji sunar. Photocaged UAAS kendi yapı-işlev ilişkilerinin 12,13,14 ileri düzeyde tanıyorsanız membran reseptörleri ve iyon kanalları 11, içine UAAS dahil etmek Xenopus oosit içine mikroenjeksiyon edildi erken çabalarında, tRNAs kimyasal asile.Bu mikroenjeksiyon yaklaşım esas olarak büyük oosit ile sınırlıdır. Bir UAA&#39;nın Genetik birleşme canlı hücreleri 15,16,17,18 endojen protein çeviri yoluyla UAA içeren bir dikey tRNA / sentetaz çifti kullanarak tRNA asilleme ve mikroenjeksiyon teknik açıdan zor atlar. Nöronal proteinlere UAA birleşme birincil nöronlar ve nöral kök hücreler 19,20 ortaya konmuştur. Daha yakın zamanda, ışığa cevap UAA genetik ilk kez 21 in vivo memeli beyninde nöronal protein içine dahil edilmiştir. Bu gelişmeler kendi ana hücresel ortamda UAAS ile nöronal proteinler incelemek mümkün kılar. Içe doğru doğrulan potasyum kanal Kir2.1 hücre dışına daha içine daha kolay K + akımları geçer güçlü bir doğrultucu olduğunu ve hücre uyarılabilirliği, damar tonusu, kalp atım hızı, yeniden dahil fizyolojik süreçleri düzenleyen esastırnal tuz akışı ve insülin 22 bırakın. Kir2.1 overekspresyonu az uyarılabilir 23,24 olur hedef nöron, membran potansiyelini hiperpolarize. Optik olarak doğal hücrelerde Kir2.1 kontrol etmek için, Kang ve diğ., Genetik olarak Kir2.1 bir foto-duyarlı bir UAA memeli hücreleri, nöronlar ve embriyonik fare beyinleri 21 olarak ifade dahil. ışık kısa bir darbe böylece hedef Kir2.1 proteini aktive doğal bir amino asit Cys içine UAA dönüştürmek mümkün oldu. Bu foto-uyarılabilir içeri doğru rektifiye potasyum (Pirk) kanal proteini sıçan hipokampal primer nöron ifade edildiğinde, ışık aktivasyonuna yanıt olarak nöronal ateşleme bastırılır. Buna ek olarak, Pirk kanalı embriyonik fare neokorteks ifade edildi ve kortikal nöronlar ışık aktif Pirk akımı ölçülmüştür. Memeli beyninde in vivo UAA teknolojisinin başarılı bir şekilde uygulanması optik nöronal proteinleri kontrol etmek için kapıyı açarkendi doğal ortamında, moleküler düzeyde nöronal işlemleri ve mekanizmalarının optik diseksiyon sağlayacak olan. Bu protokolde, kültür ve in vivo olarak embriyonik fare beyninde primer nöronlara UAAS genetik dahil edilmesi için işlemleri açıklar. ışığa cevap UAA CMN ve Kir2.1 sürecini göstermek için kullanılır. Yöntem başarılı UAA katılmasını ve sağlanan nöronal protein aktivitesinin optik kontrolünü değerlendirmek için. Bu protokol, genetik olarak nöronlar ve in vivo UAAS kodlayan ve optik da ışığa UAA ile nöronal protein fonksiyonunu düzenlemek için açık bir kılavuz sağlar. Biz bu protokol nörobilim ve optogenetic biyolojik çalışmalar için in vivo UAA teknolojisinin benimsenmesini kolaylaştırmak için bekliyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1057">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:301px;">Cover Glasses, Circles, 12 mm, Thickness 0.13-0.17 mm</td>
			<td style="width:455px;">Carolina Biologicals</td>
			<td style="width:301px;">633029</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">Corning BioCoat Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:455px;">Corning Discovery Labware</td>
			<td style="width:301px;">354210</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">D-(+)-Glucose solution</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:301px;">G8769</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">Iris Spatula-curved</td>
			<td style="width:455px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:301px;">10092-12</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">Dissecting Knife - Fine Angled Tip</td>
			<td style="width:455px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:301px;">10056-12</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">GlutaMAX-I Supplement</td>
			<td style="width:455px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:301px;">35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">MITO+ Serum Extender</td>
			<td style="width:455px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:301px;">355006</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">Falcon 40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td style="width:455px;">Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:301px;">352340</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:301px;">BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid, N,N-Bis(2-hydroxyethyl)taurine)</td>
			<td style="width:455px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:301px;">B6420</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:301px;">LED LIGHT SOURCE &#8211; Black LED 385</td>
			<td style="width:455px;">Prizmatix Ltd.</td>
			<td style="width:301px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:301px;">Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade</td>
			<td style="width:455px;">Promega</td>
			<td style="width:301px;">V2111</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical control of a neuronal protein using a genetically encoded unnatural amino acid in neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

genetik olarak nöronların bir proteinin bir UAA birleştirmek için birinci önemli bir adım, uygun bir gen sunar ve nöronlarda etkin genleri ifade etmek yapıları tasarlamaktır. UAA dahil edilmesi için, üç genetik bileşen vardır: (1) UAA dahil (2) mutasyona uğramış TAG durdurma kodonu tanımak için bir ortogonal tRNA, ve (3) bir ortogonal aminoasil için seçilen yerinde ortaya TAG amber durdurma kodonu ile hedef genin -tRNA sentetaz dik tRNA üzerine UAA şarj etmek için. Her bir bileşen, uygun bir promotör ile tahrik edilmesi gerekir. Bu üç gen kasetleri, bir plasmid dahil veya birkaç plazmid ayrılabilir. Nöronlarda Pirk ifade etmek için, foto-reaktif UAA CMN dik tRNA Leu MYA / CmnRS (CMN-tRNA sentetaz) CMN 21,29 özgü olduğu gelişti çifti kullanarak Kir2.1 içine dahil edilmiştir. Kir2.1 geninin Kalıntı Cys169 TAG amber durdurma kodonu (Kir2 için mutasyona uğratılır.1-TAG) ve mCitrine nöronal kültür Pirk tanımının görüntülenmesi için Kir2.1 C-terminine kaynaşmıştır, floresan protein (Şekil 1). İyi kalitede nöronal kültürünü edinme başarılı Pirk deneyler için bir ön koşuldur. Doğum sonrası gün 1-4 Sprague Dawley sıçan yavruları genellikle nöronal kültür hazırlanması için kullanılır, ancak sıçan embriyolar da sıkça kullanılmaktadır. 1.0-1.5 x 10 5 hücre / çukur yoğunluğunda 24-çukurlu levhalarda lamelleri üzerine kaplama olduğunda, bir çok fazla mikroglia veya diğer artık (Şekil 2A) ile iyice ayrılmış sağlıklı nöronlar göreceksiniz. Sağlıklı nöronlar geniş süreçleri var ve hücre gövdeleri (soma) (Şekil 2B) dolgun. Belirgin görünür organelcik yapısı genellikle sağlıksız kültürünün bir işaretidir. Nöronal Kültür,% 5 CO2 içinde 35 ° C&#39;de 2-3 hafta boyunca muhafaza edilebilir:% 95 hava nemlendirilmiş kuluçka. Calcium fosfat (Ca-P) transfeksiyon duyarlı nöronal kültürüne uygun çok nazik bir transfeksiyon yöntemidir. Ancak, nöronların yüksek transfeksiyon verim elde etmek için aşırı hassasiyet ve dikkat gerektirir. Stok çözeltileri 4 ° C&#39;de saklandı ve transfeksiyon günde 2x BBS tampon yapmak için karıştırılması gerekmektedir. Hassas pH ayarı tekrarlanabilir başarılı sonuçlar elde etmek için anahtardır. 2.5 M CaCI2 çözeltisi da transfeksiyon gününde taze olarak yapılmalıdır. Tüm tamponlar, filtre edilmesi gerekir. Ayrıca, yüksek saflık ve kalite ile taze DNA plazmidleri sonuçları iyileştirmek. En iyi sonuçları elde etmek için, tek bir yeni DNA mini-prepped elde edemez büyümüş Escherichia coli kültürü (~ çalkalama inkübatöründe 37 ° C&#39;de 12 saat). Tüm tamponlar hazır sonra, doku kültürü kaputu çözüm getirmek ve transfeksiyon için hazırlar. Karıştırma sırasında düşük bir hızda bir girdap kullanılarak transfeksiyon solüsyonu çalkalayın. Hemen nöronal cu karışık çözüm ekleyinlture ve geri inkübatör kültür çanak getirmek. 45 dk-1 saat sonra transfeksiyon durdurun ve sürekli inkübasyon için kültüre özgün bir büyüme ortamı ekleyin. Transfeksiyon (Şekil 3) sona ermesinden sonra transfekte nöronların 6 saat ila görülebilir. Kültür ortamında CMN varlığında, Pirk ifade edilir ve Pirk salgılayan nöronların bağlı Pirk C-terminal (Şekil 3D) kaynaşmış mCitrine protein yeşil fluoresan bulunmaktadır. Pirk salgılayan nöronların normal bazal fizyolojisi sahiptir ve enjekte edilen akımların (Şekil 4) yanıt olarak aksiyon potansiyelleri ateşleme yeteneğine sahiptir. Bununla birlikte, eylem potansiyelleri bu dizi hücre (Şekil 4a) parlayan kısa bir ışık palsı ile hemen bastırılır. 0.5 mM BaCl 2, bir Kir2.1 özel bir engelleyicisi, banyoya ilave edildiğinde, nöronal ateşleme sonra önceki bastırılması l Kir2.1 aktivasyonuna bağlı olduğunu belirten, sürdürülüright (Şekil 4B). Untransfected kontrol nöronları ışık veya Ba 2+ (Şekil 4C, D) yanıt vermez. In vivo Pirk ifade etmek için, yüksek ölçüde saf ve konsantre edildi, DNA plasmidleri (2-5 mg / ml) hazırlanmış olmalıdır. Bu deneylerde kullanılan özel plasmidler Şekil 5A&#39;da gösterilmiştir. Ortogonal tRNA Leu Cua / CmnRS çifti ve hedef Kir2.1-TAG geni, bir etiket mutasyon (GFP TAG) ile yeşil fluoresan proteini kodlayan bir gen ile birlikte, aynı zamanda, bir flüoresan raportör co-elektropore edilmiştir. GFP TAG bastırma tRNA Leu CuA ve CmnRS gerektiren hem zira GFP floresan tespiti, her üç plazmid başarılı bir şekilde iletilmesini işaret eder; Her iki gen aynı hücrede mevcut olduğundan GFP TAG cmn şirketleşme, iyi Kir2.1-TAGas içinde cmn birleşmesini öneririz. Üç gen yapılan, tüm Inje olanE14.5 fare embriyolarının lateral ventrikül (Şekil 5B, sol panel) içine cted. elektroporasyon sonra, embriyolar gelişimini devam etmesi için karın boşluğuna embriyolar dönün. İki gün sonra, DNA enjeksiyonu (Şekil 5B, orta panel) ile benzer bir şekilde, elektroporasyona ucundaki veya yanındaki bir ventrikül her iki taraf için yaklaşık 2-5 | il CMN-Ala (500 mM) enjekte edilir. Yine, sürekli gelişim için karın boşluğuna embriyolar dönün. Embriyolar görüntüleme ya da elektrofizyolojik deneyler için E17.5 hasat edilebilir. Beklendiği gibi, yalnızca CMN-Ala enjeksiyonu ile, yeşil flöresanlı hücreler, fare neokorteks gözlenir. Kırmızı ve yeşil hem de floresan ile hücreler CMN Pirk kanalları (Şekil 6A) yapmak için Kir2.1-TAG içine dahil olması gerekirdi. o nöronal kültürü üzerinde yapıldığı gibi embriyonik neokortikal dilim tam hücreli kayıt benzer yapılır. Yeşil ve kırmızı floresan nöron KD hiçbir içe akım vargatif potansiyel dayanır, ama ışık kısa bir darbe hızla içeri doğru akım (Şekil 6B) aktif hale getirir. Geçerli tamamen o Pirk tarafından oluşturulan teyit Ba 2+ eklenerek bloke edilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53818/53818fig1.jpg" /> Şekil 1:. Nöron kültürü Şeması nöronal kültüründe Pirk ifade örnek plazmid tasarımı göstermek için Pirk ifade plazmid seti. En plazmid sitomegalovirüs (CMV) promoteri altında C169 sitesinde tek bir amino asit mutasyonu ile Kir2.1 gen (gri) kodlar. C169 UAA CMN dahil olacağını TAG amber durdurma kodonu için mutasyona uğramış. Kir2.1 geni mCitrine geni (yeşil) tarafından takip edilir. mCitrine Pirk ifade eden hücreleri görselleştirmek için Kir2.1 geninin C-terminali birleştirilir. Alt plazmid Fare fosfogliserat kinaz-1 (mPGK) promoteri tarafından tahrik CmnRS (pembe), CMN Belirli sentetaz kodlar. tRNA <sup<html> &gt; Leu CUA (mavi), dik tRNA 21, aynı zamanda, ancak ters yönde, H1 promoteri tarafından tahrik edilen aynı plasmid içinde ifade edilir. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53818/53818fig2.jpg" /> Şekil 2: Sıçan hipokampal birincil nöronal kültür sağlıklı sıçan hipokampal nöronal kültürlerin gösteren Örnek resimler.. (A) in vitro 10 gün nöronal kültürünün DIC görüntüsü (DIV). Onlar dendrit ve aksonlar dışında şube olarak Nöronlar olgun. Mikroglia hücreleri (süreçler olmadan küçük ve yuvarlak hücreler) bir arada, ancak kültür mahçup etmeyin. (B) sağlıklı kültürlü nöronların büyütülmüş DIC görüntü. Sağlıklı bir nöron tombul hücre gövdesi (soma) sergiler ve dendritler / aksonlar belirgin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53818/53818fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html> 1 &quot;&gt;:&quot; keep-together.within sayfa = fo &quot;_content <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53818/53818fig3.jpg" /> Şekil 3:. Kültürlenmiş primer nöronlarında Pirk sentezleme DIC ve in vitro kültürlenmiş ve Pirk ifadesi için, Şekil 1 &#39;de gösterilen gen yapıları ile transfekte edilmiş sıçan hipokampal nöronlarının floresans ve görüntüler. CMN transfeksiyon (A ve B) uygulanmasından sonra kültür içinde eklenmez, hiçbir yeşil floresan nöronların tespit edilir. Büyüme ortamı CMN (1 mM) varlığında, transfekte nöronlar, böylece yeşil floresan (C ve D) gösteren tam uzunlukta Pirk-mCitrine proteinleri ifade yeteneğine sahiptirler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53818/53818fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> .jpg &quot;/&gt; Şekil 4:. Pirk Işık aktivasyon sıçan hipokampal nöronlar ateş bastırır (A) Tek bir ışık nabız Pirk ifade hipokampal nöron aktivitesini bastırır. Temsili gerilim izleri akım-kelepçe sürekli kaydedilir. Aksiyon potansiyeli ateşleme 20 pA akım enjeksiyon (I-adım) tarafından uyarılmış edilir. Işığa maruz kalma (385 nm, 40 mW / cm2, 1 saniye; ok ile gösterilen) hızla ve tamamen nöronal ateşleme bastırır. Ateşleme seçici Kir2.1 kanalları inhibe dışı 500 mM BaCl 2 ile geri yüklenir. (B) Ultraviyole (UV) aydınlatma (385 nm, 40 mW / cm2, 6 saniye; sarı kutusu ile gösterilir) kontrolü, untransfected nöronların heyecanlanma değiştirmez. Aksiyon potansiyeli ateşleme 50 pA akım enjeksiyon (I-adım) tarafından uyarılmış edilir. (C ve D), UV aydınlatma veya BaCl 2 (500 mM), kontrol nöronları uyarılabilirliğini etkiler. kuvvetli bir etkiyeial 50 pA akım enjeksiyon (I-adım) tarafından uyarılmış edilir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53818/53818fig5.jpg" /> Şekil 5: in vivo fare neokorteks Pirk ifadesi için prosedürler. (A) Pirk sentezleme plasmidi ayarlayın. En plazmid: dahili ribozom giriş bölgesi (IRES) ile CAG promoteri ve mCherry tarafından tahrik CmnRS plazmid. MCherry floresan CmnRS başarılı ifadesini teyit ederim. Orta plazmid: tRNA Leu CuA, CMN dahil 21 ortogonal tRNA üç nüsha ile birleştiğinde Kir2.1 gen için plazmid. Alt plazmid: GFP_Y182 TAG plazmid. GFP geni siteleri 21 TAG Kazablanka başarılı birleşme görselleştirmek için izin veren Tyr182 yerinde bir amber durdurma kodonu (GFP_Y182 TAG) ile tasarlanmıştır. (B) Karikatür shokanat in vivo Pirk ifadesi için deneysel bir prosedür. Pirk ifadesi için gen konstruktları fare neokorteks (E14.5) enjekte edilir ve utero (sol panel) elektroporasyona edilir. İki gün sonra, CMN-Ala Electroporated yan ventrikül veya beyinsel yarıkürede her iki tarafında (orta panel) enjekte edilir. Dilim görüntüleme ve elektrofizyolojik tahlil E17.5-E18.5 (sağ panel) yapılabilir. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53818/53818fig6.jpg" /> Şekil 6: Fare neokorteks ve hafif aktivasyon Pirk ifadesi. In vivo GFP ve Kir2.1 proteinlere Kazablanka ile birleşmesiyle gösteren fare embriyonik kortikal nöronların (A) Floresan görüntüleri. Şekil 5A&#39;da, üç gen yapılan in utero elektroporasyona edilir. MCherry floresan CMN belirli Synthe başarılı ifadesini gösterirTASE geni, CmnRS. GFP floresans GFP TAG ve Kir2.1 TAG olası CMN katılmasında CMN dahil edilmesini gösteren, sadece CMN-Ala enjeksiyon (alt) ile tespit edilir. Bu nedenle, yeşil ve kırmızı floresans üç plasmidler ve CMN dahil başarılı bir ifadesini gösterir. Pirk ışık bağımlı aktivasyonunu gösteren neokortikal nöronlar farelerden kaydedilen akımlar (B) IV çizimi. Şekil 5A&#39;da gen yapılan elektroporasyona edildi, iki gün sonra, CMN-Ala uterus enjekte edilmiştir; 12-48 saat CMN-Ala enjeksiyonundan sonra, neokortikal akut dilim embriyolardan hazırlanmıştır. Hem kırmızı hem de yeşil floresan tespit dilimler halinde nöronlar, Pirk ifade eden, (siyah) öncesi ve (mavi) ışığa maruz kalma (385 nm, 8 mW / cm2, doymuş pozlama için 10 sn) sonra. BaCl 2 (500 mM) foto-aktifleştirme (turuncu) sonra Pirk özgü akımları kontrol etmek için ilave edilir.

Watch this Scientific Journal Video about Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons at JoVE.com

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

optical-control-neuronal-protein-using-genetically-encoded-unnatural

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.9K Görüntüleme.  Tufts University. Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Video: Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Nörobilim

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and medical applications. Strengths of fluorescence include its sensitivity, specificity, and compatibility with live imaging. Unfortunately, conventional forms of fluorescence microscopy suffer from one major weakness, diffraction-limited resolution in the imaging plane, which hampers studies of structures with dimensions smaller than ~250 nm. Recently, this limitation has been overcome with the introduction of super-resolution fluorescence microscopy techniques, such as photoactivated localization microscopy (PALM). Unlike its conventional counterparts, PALM can produce images with a lateral resolution of tens of nanometers. It is thus now possible to use fluorescence, with its myriad strengths, to elucidate a spectrum of previously inaccessible attributes of cellular structure and organization.
Unfortunately, PALM is not trivial to implement, and successful strategies often must be tailored to the type of system under study. In this article, we show how to implement single-color PALM studies of vesicular structures in fixed, cultured neurons. PALM is ideally suited to the study of vesicles, which have dimensions that typically range from ~50-250 nm. Key steps in our approach include labeling neurons with photoconvertible (green to red) chimeras of vesicle cargo, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a high-resolution PALM image. We also demonstrate the efficacy of our approach by presenting exceptionally well-resolved images of dense-core vesicles (DCVs) in cultured hippocampal neurons, which refute the hypothesis that extrasynaptic trafficking of DCVs is mediated largely by DCV clusters.

We describe how to implement photoactivated localization microscopy (PALM)-based studies of vesicles in fixed, cultured neurons. Key components of our protocol include labeling vesicles with photoconvertible chimeras, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a super-resolution image.

Nöronal Yoğun çekirdekli Keseciklerinde süper çözünürlüklü Görüntüleme

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

Görüntüleme hücre içi Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Genetik olarak kodlanmış Kalsiyum Göstergelerini Kullanma Yetişkin fareler ile Striatal Astrositler Sinyalleri

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate goal is to image neuronal activity in vivo, one must be able to image activity of a single cell to ensure successful in vivo preparations. This procedure will describe how to image membrane potential in a single cell to provide a foundation to eventually image in vivo. Here we describe methods for imaging GEVIs consisting of a voltage-sensing domain fused to either a single fluorescent protein (FP) or two fluorescent proteins capable of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) in vitro. Using an image splitter enables the projection of images created by two different wavelengths onto the same charge-coupled device (CCD) camera simultaneously. The image splitter positions a second filter cube in the light path. This second filter cube consists of a dichroic and two emission filters to separate the donor and acceptor fluorescent wavelengths depending on the FPs of the GEVI. This setup enables the simultaneous recording of both the acceptor and donor fluorescent partners while the membrane potential is manipulated via whole cell patch clamp configuration. When using a GEVI consisting of a single FP, the second filter cube can be removed allowing the mirrors in the image splitter to project a single image onto the CCD camera.

A method for imaging changes in membrane potential using genetically encoded voltage indicators is described.

Genetik Kodlanmış Floresan Gerilim Sensörleri İki Türleri ile Potansiyel görüntüleme Membran

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

Beyin Dilimlerinde ve Birincil Hücre Kültüründe Piramidal Nöronların Balistik Etiketlemesi

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...