Murin-saf nöronal hücre süspansiyonunu sekiz dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyerek başlayın. Süpernatanı nazikçe aspire edin ve peleti 0.5 BSA çözeltisi ile 80 mikrolitre HBSS'de yeniden süspanse edin. Spesifik antikoru ekledikten sonra, tüpleri 10 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Fazla antikoru HBSS-BSA solüsyonu ve santrifüj ile yıkayın. HBSS-BSA'da yeniden süspanse edilen pelete 20 mikrolitre antibiyotin mikroboncuk ekleyin. Tüpü dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin.
Daha sonra, yedi hücreye her 10 için% 0.5 BSA çözeltisi ile 0.5 mililitre HBSS ekleyin. Kolonu 0,5 mililitre HBSS ile% 0,5 BSA çözeltisi ile durulayın. Damlama durduğunda, kolonun altına 15 mililitrelik bir tüp yerleştirin ve içinden 0,5 mililitre hücre süspansiyonu geçirin.
Spesifik olmayan nöronal hücreler içeren elüatı toplayın, daha sonra% 0.5 BSA ile 0.5 mililitre HBSS'nin üç yıkamasıyla kolonu temizleyin. Şimdi sütunu mıknatıstan çıkarın ve 15 mililitrelik yeni bir tüpe yerleştirin. % 0.5 BSA ile bir mililitre HBSS ekleyin ve hedeflenen hücreleri temizlemek için pistonu kullanın.
Santrifüjleme ve süpernatan aspirasyonundan sonra, peleti 0,5 mililitre kaplama ortamında yeniden süspanse edin. Neubauer sayım odasındaki hücreleri parlak alan mikroskobu altında sayın. Hazırlanan 24 oyuklu plakada hedeflenen hücreleri pozitif kontrol ve spesifik olmayan hücreleri negatif kontrol olarak plakalayın.
37 santigrat derecede 12 saat inkübe edin. LepR pozitif nöronlar 48 saat sonra nörit oluşturmaya başladı. DIV4'te aksonal uzantılar ilerleme gösterirken, dendritik süreçler ortaya çıkmaya başladı.
DIV6'da nöronlar yeterince gelişmiştir. İmmünofloresan çalışmalar, glial hücrelerin veya diğer nöronal olmayan hücrelerin gözlenmediğini göstermiştir. Hücrelerin nöronal doğası, mikrotübül ile ilişkili protein 2 boyaması ile doğrulandı.
DIV10'da, LepR pozitif hücrelerin% 30'u POMC'yi eksprese etti. Heterojen hipotalmik nöronal popülasyonları içeren genel kültürlerde sinaptik bağlantı ve işlevsellik gözlendi.
