50 mililitrelik konik tüplerde %60 ve %70 ayırma ortamının 12 mililitre seyreltilmesini hazırlayın. Ardından, beş mililitrelik bir pipet kullanarak %70 seyreltme üzerine %60 seyreltme seferinde dört mililitre ekleyerek gradyanı aşağıdan yukarıya hazırlayın. Daha sonra 12 mililitre heparinize kanı yoğunluk gradyanının üzerine dikkatlice yerleştirin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 200G'de santrifüjleyin.
Plazma ve mononükleer hücre katmanlarını atın. Daha sonra eritrosit peletinin üzerindeki tabakanın yaklaşık 7,5 mililitresini dikkatlice iki adet 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Tüpleri 300G'de 19 santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin.
Hücre peletini Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi veya HBSS ile yıkamaya devam edin. Sonra hipotonik lizis yapın ve kalan kırmızı kan hücrelerini çıkarın. Süpernatanı attıktan sonra, kalan tampondaki polimorfonükleer nötrofilleri yavaşça yeniden süspanse edin ve buz gibi soğuk bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.
Daha sonra, hücre süspansiyonunun üç adet bir mikrolitrelik alikotunu temiz bir cam slayta aktarın. Hücre morfolojisini ve saflığını değerlendirmek için hızlı panoptik ile boyayın. Hücreleri mikroskop altında gözlemleyin ve her kuyucukta 300 rastgele hücre sayın.
Ayırmanın saflığını değerlendirmek için nötrofilleri ve diğer hücre tiplerini işaretleyin. Daha sonra, hücre süspansiyonunun bir mikrolitresini 49 mikrolitre% 0.2 tripan mavisi boyaya aktarın ve bir Neubauer odası kullanarak ölü ve canlı hücreleri sayın. Kalsiyum ve magnezyum ile desteklenmiş% 50 otolog plazma ve% 50 HBSS ile hücre konsantrasyonunu mikrolitre başına 6.667 hücreye ayarlayın.
Daha sonra hücre süspansiyonunu, negatif kontrol de dahil olmak üzere test koşullarına karşılık gelen 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpleri arasında eşit olarak bölün. Her koşul için bir aktivasyon sistemi hazırlayın ve nihai hücre konsantrasyonunun mikrolitre başına 6.600 polimorfonükleer nötrofilde kalmasını sağlayın. Dönmeden 37 santigrat derecede inkübe edin.
