0.0005 gram NBT'yi 10 mikrolitre DMSO'da çözerek başlayın. 15 dakika girdaplamadan sonra, 90 mikrolitre Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi veya kalsiyum ve magnezyum içeren HBSS ve bir mikrolitre test maddesi ekleyin. Yine, tüpü iki dakikaya kadar girdaplayın.
NBT slayt testini gerçekleştirmek için, önceden hazırlanmış aktive edilmiş polimorfonükleer nötrofillerin iki mikrolitresini yavaşça karıştırın ve temiz bir cam slayt üzerine aktarın. Slaytı nemlendirilmiş odada 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücrelerin üzerine bir mikrolitre NBT çalışma çözeltisi ekleyin.
Işıktan koruyarak tekrar 20 dakika inkübe edin. Slaytı kuruttuktan sonra, her bir oyuğa bir dakika boyunca bir damla metanol uygulayarak sabitleyin. Slaytı bir dakika daha 0.03 safranin ile boyayın.
Her kuyucukta, formazan birikintileri olan ve olmayan nötrofilleri ayırt eden 100 rastgele hücre sayın. NBT spektrofotometri testini gerçekleştirmek için, önceden hazırlanmış aktive edilmiş polimorfonükleer nötrofillerin 90 mikrolitresini yavaşça karıştırın ve temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra dikkatlice 20 mikrolitre altı milimolar NBT çözeltisi ekleyin ve tüpü karanlıkta 37 santigrat derece boyunca 20 dakika inkübe edin.
İnkübasyondan sonra 100 mikrolitre% 10 SDS ve Vortex ekleyin. Her biri 15 saniyelik beş döngü ve 15 saniyelik aralıklar ekleyerek% 60 genlikte bir uç sonikat ile sonikate. Beş dakika boyunca 12.000 g'da santrifüjleyin.
60 mikrolitre süpernatanı 96 oyuklu şeffaf bir plakaya aktarın ve süpernatan ürünün emilimini 570 nanometrede ölçün. Spektrofotometrik testin sonuçları, 100 nanomolar PMA'nın fMLP ve kontrol gruplarına kıyasla yüksek ROS üretimini indüklediğini gösterdi. NBT slayt testi sonuçları, PMA'yı fMLP'ye kıyasla en yoğun ROS üretimini indükleyen uyaran olarak gösteren spektrofotometrik sonuçları doğruladı.
