Bu araştırma, NSF / CMMI Hemoglobin Bazlı Yapay Oksijen Taşıyıcılarının Mekanobiyolojisi (#1941655) ve NSF / CMMI Sağlıklı ve Hastalıklı Kırmızı Kan Hücrelerinin Dinamik ve Yorgunluk Analizi (#1635312) tarafından finanse edilmiştir.

Kimliği belirsiz insan tam kanı ticari olarak elde edildi. Kan örneklerini içeren çalışma, Florida Atlantic Üniversitesi'ndeki Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından onaylanan protokoller kullanılarak bir biyogüvenlik seviyesi 2 laboratuvarında gerçekleştirildi.
1. Mikroakışkan cihaz hazırlığı
<ol><li>Mikroakışkan kanal tasarımı için SU-8 ana silikon gofreti 14 cm'lik plastik bir Petri kabının içine bantlayın veN2 gazıyla temizleyin.</li>
	<li>Bir kağıt kapta 60 g polidimetilsiloksan (PDMS) bazı ve 6 g PDMS kürleme maddesi tartın. Karışım bulanık beyaz bir renk alana kadar tahta bir spatula kullanarak iki parçayı karıştırın.</li>
	<li>PDMS karışımını silikon gofret içeren plastik Petri kabına dökün. Petri kabını 3 bir musluklu vakumlu bir desikatöre yerleştirin. PDMS'deki hava kabarcıklarını gidermek için vakumu kurutucu odasına bağlamak için vananın valfini çevirin.</li>
	<li>Desikatör haznesini yaklaşık 5 dakikalık döngülerde ortama bağlamak için vana valfini ayarlayarak desikatör haznesine yeniden hava verin. Kanalların özelliklerinden tüm hava kabarcıkları çıkana kadar tekrarlayın.</li>
	<li>Petri kabını 70 °C'de 4 saat fırına koyun. Zaman geçtikten sonra Petri kabını çıkarın, oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve bir kesme matının üzerine koyun.</li>
	<li>Bir neşter kullanarak, PDMS'nin silikon gofretin üzerindeki kısmını kesin. Kesik PDMS'yi iki laboratuvar sarma filmi tabakası arasına yerleştirin. Mikrokanalın girintisi ile yarı saydam film arasında oluşan boşluk, mikroakışkan kanalın konumunun yanı sıra ilgili giriş ve çıkışının tanımlanmasını kolaylaştırır.</li>
	<li>Bir tıraş bıçağı kullanarak, büyük PDMS'den ayrı bir kanal kesin. İki boyuta göre biyopsi zımbaları kullanarak 3 mm'lik bir giriş deliği ve 1.5 mm'lik bir çıkış deliği açın (Şekil 1A).</li>
	<li>Delikli kanalı, kanal tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir cam kızak üzerine yerleştirin. İnce film İndiyum Kalay Oksit (ITO) interdigitated elektrotlar içeren 20 mm x 15 mm'lik bir cam alt tabakayı, elektrotlar yukarı bakacak şekilde aynı cam slayt üzerine yerleştirin.</li>
	<li>PDMS ve alt tabaka ile cam sürgüyü yavaşça bir plazma temizleyiciye yerleştirin. Gaz vanasını kapatın, pompa anahtarını AÇIN ve 600 - 800 mTorr'luk bir sensör okuması elde etmek için 2 dakika bekleyin.</li>
	<li>Güç anahtarını AÇIN ve 30 saniye bekleyin. RF güç düğmesini düşükten yükseğe çevirin ve 1 dakika bekleyin.</li>
	<li>Ardından, RF düğmesini düşük, güç anahtarını KAPALI, pompa anahtarını KAPALI konuma getirerek ve gaz vanasını açarak sırayı tersine çevirin.</li>
	<li>Plazma temizleyicinin haznesini açtıktan hemen sonra, PDMS'yi kanal tarafı aşağı bakacak şekilde (180°) kaldırın ve döndürün. Kanalı ITO alt tabakasının üstüne yerleştirin. Yapıştırma işlemi başladı.</li>
	<li>Cımbız kullanarak, PDMS'nin köşelerine yaklaşık 3 saniye boyunca hafifçe bastırın. Kanalın kendisine bastırmaktan kaçının. NOT: Yapıştırma işlemi, işlem görmüş iki yüzey arasındaki fiziksel temas üzerine kendiliğinden gerçekleşir.</li>
	<li>Hazırlama ortamını 23 G'lik bir iğne ile 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin. İğneyi doğrudan girişe sokarak ve ardından ortamı serbest bırakarak kanalı dikkatlice ıslatın. Yavaş çalıştırın. Hava kabarcıkları sokmayın. En az 3 dakika inkübe edin.</li>
	<li>10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak ana ortamı çıkarın. DEP ortamını kanala sokarak kanalı DEP ortamıyla 3 kez yıkayın. Kanalı her zaman ıslak tutun.</li>
</ol>2. Test fikstürü
NOT: Test fikstürü, 3D CAD yazılımı kullanılarak tasarlanmıştır ve bir taban muhafaza ünitesi ve bir üst ünite içerir (Şekil 1B). Daha sonra, standart tolerans sınırı yaklaşık ± olan 3 eksenli bir CNC freze makinesi kullanılarak üretilir test fikstürünün boyutu elektronik bir kumpas (gösterilmemiştir) kullanılarak kontrol edilir. İn vitro biyomekanik test için fikstürün sterilitesi gerekli değildir.
<ol><li>Telleri iki set yaylı piston konektörünün lehim kabı uçlarına önceden lehimleyin.</li>
	<li>Yaylı piston konektörlerini üst üniteye yerleştirin ve bir damla epoksi yapıştırıcı ekleyerek kalıcı bir yapıştırma oluşturun.</li>
</ol>3. Elektrodeformasyon çalışma tamponunun hazırlanması
<ol><li>DEP ortamını hazırlamak için, bir ölçek kullanarak 12.75 g sakaroz ve 0.45 g dekstroz tartın.</li>
	<li>Her iki tozu da 150 mL deiyonize (DI) su ve 3.5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren tek bir kapta çözün.</li>
	<li>Düşük aralıklı bir iletkenlik test cihazı kullanarak iletkenliği ölçün ve 0,04 S/m olduğundan emin olun (Şekil 2). NOT: Ortaya çıkan DEP kuvvetinin11 işaretini ve büyüklüğünü değiştirebilecek farklı bir iletkenlik değeri kullanılabilir. Bununla birlikte, elektrodeformasyon, pozitif bir DEP kuvveti gerektirir.</li>
	<li>Bir ozmolik kullanarak, ozmolaritenin kan plazmasının normal aralığında, 275 ila 295 mOsm/kg su içinde olduğunu doğrulayın (Şekil 3). 4 °C'de saklayın. DEP ortamı artık hazırlanmıştır.</li>
	<li>15 mL'lik bir tüpte, 0.5 g sığır serum albüminini (BSA) 10 mL DEP ortamında çözün. İyice karıştırın. Cihazın ana ortamı şimdi hazırlanmıştır.</li>
</ol>4. Hücre süspansiyonunun hazırlanması
<ol><li>Kanı 1 mL PBS ile 268 x g'da 3 dakika santrifüj ederek 20 μL tam kanı yıkayın. Süpernatanı atın.</li>
	<li>RBC'leri 1 mL PBS'de yeniden askıya alın. Karıştırmak için hafifçe pipetleyin. RBC'leri 268 x g'da 3 dakika yıkayın ve süpernatanı atın.</li>
	<li>10 μL'lik bir mikropipet ucu kullanarak 5 μL RBC peletini çıkarın ve 1 mL DEP ortamına tamamen dağıtın. Hücreleri 268 x g'da santrifüjleyerek 3 dakika yıkayın.</li>
	<li>Süpernatanı atın ve RBC'leri 1 mL DEP ortamında yeniden süspanse edin. Karıştırmak için hafifçe pipetleyin.</li>
	<li>RBC'leri 268 x g'da 3 dakika yıkayın ve süpernatanı atın. 2 μL RBC peletini 500 μL DEP ortamına pipetleyin. Hücre süspansiyonu şimdi 62 - 104 hücre/μL12 aralığında bir konsantrasyonla hazırlanır ve bu konsantrasyon standart bir hücre sayım slaytı kullanılarak doğrulanabilir.</li>
</ol>5. Elektrodeformasyon kurulumu ve yorulma testi
<ol><li>Mikroakışkan cihazı test fikstürünün alt kısmına yerleştirin. Armatürün üst kısmını cihaza hizalayın ve iki set naylon vida ve somun kullanarak iki parçayı birleştirin (Şekil 4).</li>
	<li>Test fikstürünü mikroskop tablasına yerleştirin. Mikroskop altında istediğiniz bir elektrot setini bulun.</li>
	<li>Bulunan elektrot setiyle eşleşen ilgili elektrot kablosu çiftini fonksiyon üretecinin çıkış terminaline bağlayın (Şekil 4).</li>
	<li>Mikroakışkan kanalın 5 mm girişinden 3 μL DEP ortamını çıkarın. 10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak 5 μL hücre süspansiyonunu yavaşça girişe yükleyin.</li>
	<li>Hücrelerin 1 dakika oturmasına izin verin. Gerekirse, hücreleri kanala itmek için girişe ek bir DEP ortamı ekleyin.</li>
	<li>Kanalı 20x büyütme altında gözlemleyin. Görüntülemenin kontrastını artırmak için 414/46 nm bant geçiren filtre kullanın.</li>
	<li>Sinüs düğmesine basın ve 2 MHz frekansında 3 VRMS genliğine sahip bir sinüs dalgası tanımlayın. Modülasyonu etkinleştirmek için Mod düğmesine basın. Tip seçeneğine basarak dalga modunu ASK olarak değiştirin.</li>
	<li>Modülasyon frekansını, 250 s'lik bir yükleme-boşaltma süresine karşılık gelen 4 mHz'e ayarlayın (Şekil 5A). Fonksiyon üretecinin çıkışını AÇIN.</li>
	<li>Her 10 dakikada bir saniyede 30 kare (fps) hızında 1 dakikalık bir video kaydedin.</li>
</ol>6. RBC deformasyonunun karakterizasyonu
<ol><li>Bir video düzenleme uygulaması kullanarak, önceki adımda kaydedilen .avi dosyalarını Ctrl+O tuşlarına basarak açın. İlgilendiğiniz bir kareyi seçmek için zaman çizelgesini kullanın ve Ana Ekran tuşuna ve ardından klavyede Bitir tuşuna basarak seçimin başlangıç ve bitiş karelerini aynı olacak şekilde ayarlayın.</li>
	<li>Görüntü çerçevesini dışa aktarın. JPEG olacak çıktı formatını seçin ve OK tuşuna basın.</li>
	<li>ImageJ uygulamasını açın ve önceki adımda kaydedilen görüntüleri yükleyin. Analyze > Set Measurement'a basarak ve Area, Perimeter (Çevre ) ve Fit Elips (Elips'e Sığdır ) onay kutularının işaretli olduğundan emin olarak gerekli ölçümleri ayarlayarak başlayın. Tamam'a basın.</li>
	<li>Ardından, Görüntü > Türü > 8 bit'i seçerek görüntüyü gri tonlamaya dönüştürün.</li>
	<li>Ardından, Görüntü > Eşik Ayarlama'yı kullanarak görüntüyü ikiliye dönüştürün >. Eşik iletişim kutusunda, iki kaydırıcıyı gerektiği gibi ayarlayın. Apply (Uygula ) düğmesine basın ve ardından Threshold (Eşik) iletişim kutusunu kapatın.</li>
	<li>ROI Yöneticisi> Analiz > Araçları'nı seçin. ROI Yöneticisi'nde, Tümünü Göster etiketli onay kutusuna basın. Bu kutuyu kapatmayın.</li>
	<li>Değnek (izleme) Aracı'nı seçin, görüntüde uygun bir hücre seçin ve klavyede T tuşuna basın. Seçilen hücre numaralandırılacaktır. Yeni bir hücre tekrar seçilebilir. Ölçülecek tüm uygun hücreleri seçin. Uygulanabilir hücreler, diğer hücrelerden izole edilenler olarak tanımlanır. Bu hücrelerin sayısı tek bir görüş alanında 50 ila 200 arasında değişebilir.</li>
	<li>ROI Yöneticisi kutusuna dönün ve Ölç'e basın. Bu, Sonuçlar kutusunu açar. Major (Büyük) ve Minor (Minör) etiketli sütunlar, sırasıyla elips, majör ve minör eksenlerin uzunluklarıdır (piksel cinsinden). Ölçümleri CSV formatlı bir dosya olarak dışa aktarmak için Dosya > Farklı Kaydet'i seçin.</li>
	<li>Herhangi bir uygun hesaplamalı analiz yazılımını kullanarak, Majör ve Minör bölümünü hesaplayın.</li>
</ol>

Genlik Modülasyonlu Elektrodeformasyon ile RBC'lerin Mekanik Yorulma Testi

<ol>
	<li>Kim, Y., Kim, K., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+techniques+for+red+blood+cell+deformability:+recent+advances.">Measurement techniques for red blood cell deformability: recent advances.</a> Blood Cell&#8212;An Overview of Studies in Hematology. 10, 167-194 (2012).</li><li>Safeukui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+sensing+and+sequestration+of+spherocytic+erythrocytes+by+the+human+spleen.">Quantitative assessment of sensing and sequestration of spherocytic erythrocytes by the human spleen.</a> Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 120 (2), 424-430 (2012).</li><li>Naghedi-Baghdar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+diet+on+blood+viscosity+in+healthy+humans:+a+systematic+review.">Effect of diet on blood viscosity in healthy humans: a systematic review.</a> Electronic physician. 10 (3), 6563 (2018).</li><li>Franco, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+red+cell+lifespan+and+aging.">Measurement of red cell lifespan and aging.</a> Transfusion Medicine and Hemotherapy. 39 (5), 302-307 (2012).</li><li>Matthews, K., Lamoureux, E. S., Myrand-Lapierre, M. -. E., Duffy, S. P., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+measuring+red+blood+cell+deformability.">Technologies for measuring red blood cell deformability.</a> Lab on a Chip. 22, 1254-1274 (2022).</li><li>Kim, J., Lee, H., Shin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+measurement+of+red+blood+cell+deformability:+A+brief+review.">Advances in the measurement of red blood cell deformability: A brief review.</a> Journal of Cellular Biotechnology. 1 (1), 63-79 (2015).</li><li>Varga, A., Matrai, A. A., Barath, B., Deak, A., Horvath, L., Nemeth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interspecies+diversity+of+osmotic+gradient+deformability+of+red+blood+cells+in+human+and+seven+vertebrate+animal+species.">Interspecies diversity of osmotic gradient deformability of red blood cells in human and seven vertebrate animal species.</a> Cells. 11 (8), 1351 (2022).</li><li>Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. -. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformation+measurement+of+individual+cells+in+large+populations+using+a+single-cell+microchamber+array+chip.">Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip.</a> Applied Physics Letters. 100 (17), 173702 (2012).</li><li>Al Safi, A., Bazuin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+digital+transmitters+with+amplitude+shift+keying+and+quadrature+amplitude+modulators+implementation+examples.">Toward digital transmitters with amplitude shift keying and quadrature amplitude modulators implementation examples.</a> , 1-7 (2017).</li><li>Zhang, J., Chen, K., Fan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cell+isolation+and+analysis.">Circulating tumor cell isolation and analysis.</a> Advances in Clinical Chemistry. 75, 1-31 (2016).</li><li>Cottet, J., Fabregue, O., Berger, C., Buret, F., Renaud, P., Fr&#233;n&#233;a-Robin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyDEP:+a+new+computational+tool+for+dielectric+modeling+of+particles+and+cells.">MyDEP: a new computational tool for dielectric modeling of particles and cells.</a> Biophysical Journal. 116 (1), 12-18 (2019).</li><li>Haywood, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+the+full+blood+count.">Interpreting the full blood count.</a> InnovAiT. 15 (3), 131-137 (2022).</li><li>Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Suresh, S., Du, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+fatigue+of+human+red+blood+cells.">Mechanical fatigue of human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 19828-19834 (2019).</li><li>Gharaibeh, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+slowly+adhering+cell+fraction+containing+stem+cells+from+murine+skeletal+muscle+by+the+preplate+technique.">Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique.</a> Nature Protocols. 3 (9), 1501-1509 (2008).</li><li>Qiang, Y., Liu, J., Dao, M., Du, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assay+for+single-cell+characterization+of+impaired+deformability+in+red+blood+cells+under+recurrent+episodes+of+hypoxia.">In vitro assay for single-cell characterization of impaired deformability in red blood cells under recurrent episodes of hypoxia.</a> Lab on a Chip. 21 (18), 3458-3470 (2021).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bir DEP kuvveti indükleyen sinüs dalgasının ASK OOK modülasyonu, RBC'lerin mekanik yorgunluğunu uzun bir süre boyunca test etmek için kullanılabilir. Bu protokolde, hücre deformabilitesi üzerindeki olası olumsuz metabolik etkileri önlemek için in vitro yorgunluk testini 1 saat ile sınırladık. Kapsamlı yorulma testi koşulları, ASK modülasyonlu elektrodeformasyon tekniği kullanılarak programlanabilir. Yükleme frekansı, genlik ve yükleme hızı gibi parametrelerin tümü programlanabilir. Yükleme ...

Kırmızı kan hücreleri (RBC'ler) insan vücudundaki en çok deforme olabilen hücrelerdir1. Deforme olmaları, oksijen taşıma işlevleriyle doğrudan ilişkilidir. RBC'lerde azalmış deformabilitenin çeşitli RBC bozukluklarının patogenezi ile ilişkili olduğu bulunmuştur2. Deformabilite ölçümleri, RBC ile ilişkili hastalıkları daha iyi anlamamızı sağlamıştır3. RBC'lerin normal ömrü 70 ila 140 günarasında değişebilir 4. Bu nedenle, yaşlanma süreciyle birlikte deforme olabilirliklerinin nasıl azaldığını, örneğin döngüsel kayma gerilmelerinden kaynaklanan yorulma davranışlarınıölçmek önemlidir 3.
RBC'nin yüksek verimde deforme olabilirliğini ölçmek, tek tek hücrelere uygulanan pikonewton ölçek kuvvetleri (~ 10-12 N) nedeniyle zordur. Son on yılda, hücre deformabilitesini ölçmek için birçok teknoloji geliştirilmiştir5. RBC'lerin tek hücre seviyesindeki deformasyon ölçümleri pipet aspirasyonu ve optik cımbız ile yapılabilirken, toplu analizler ozmotik gradyan ektasitometri ile yapılır. Ektasitometri analizleri, kan bozukluklarını teşhis etme fırsatı sağlayan bol miktarda veri sağlar 6,7. RBC'lerin deforme olabilirliği, kolloid prob atomik kuvvet mikroskobu ile viskoelastik teori kullanılarak da analiz edilebilir. Bu yöntemde, hem zamana bağlı hem de kararlı durum tepkileri dikkate alınarak RBC'lerin elastik modülünü tahmin etmek için hesaplamalı analiz uygulanır. Bireysel RBC'lerin deforme olabilirliği, tek hücreli mikro odacıklı dizi yöntemi kullanılarak ölçülebilir. Bu yöntem, hematolojik bozuklukları tespit etmek için RBC deformabilitesi ve karmaşık RBC popülasyonlarındaki hücresel özelliklerin dağılımı hakkında bilgi sağlamak için her hücreyi membran ve sitozolik floresan belirteçler aracılığıyla analiz eder8.
Yorulma, mühendislik malzemelerinin ve biyomalzemelerin özelliklerinin bozulmasında önemli bir faktördür. Yorulma testi, döngüsel yüklemeye maruz kalan bir yapının bütünlüğünün ve uzun ömürlülüğünün nicel bir analizini sağlar. Biyolojik hücrelerde yorgunluğun analizi, hücre zarlarında döngüsel deformasyonun uygulanması için genel, kolayca uygulanabilir, yüksek verim ve kantitatif bir yöntemin olmaması nedeniyle uzun süredir engellenmiştir. Bu, mikroakışkan bir ortamda uygulanan elektrik sinyali modülasyonu ve elektrodeformasyon tekniklerinin kullanılmasıyla mümkündür. Dijital modülasyon olarak genlik kaydırmalı anahtarlama (ASK) tekniği, bu makalede On-Off anahtarlama (OOK) modülasyonu ile uygulanmaktadır. Anahtarlama kavramı,9 işlevi için bir sinüs dalgası taşıyıcı sinyali gerektiren kanal üzerinden dijital sinyallerin iletimini ifade eder. AÇIK ve KAPALI süreleri eşit olarak ayarlanabilir. AÇMA AÇMA altında, RBC'ler, düzgün olmayan elektrik alanı tarafından oluşturulan harici bir elektrodeformasyon kuvvetine (Fdep)10 maruz kaldıklarında deforme bir duruma girerler. OFF-key altında, RBC'ler rahat durumdadır. RBC'lerin yorgunluğunu, yani artan yükleme döngüleri ile esneme yeteneklerinde aşamalı bir bozulma gözlemliyoruz. RBC'lerde yorgunluğa bağlı deformabilite kaybı, kan dolaşımı sırasında biriken membran hasarı hakkında fikir verebilir ve hücre yorgunluğu ile hastalık durumları arasındaki bağlantıları daha fazla araştırmamızı sağlar.
Burada, ASK modülasyonlu elektrodeformasyon yoluyla bir mikroakışkan cihazda RBC'lerin yorulma testinin nasıl uygulandığına ve RBC'lerin mekanik deformasyonundaki kademeli bozunmanın karakterizasyonu için mikroakışkan cihaz, mekanik yükleme ve mikroskobik görüntüleme gibi sistem ayarlarına ilişkin adım adım prosedürler sunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Balance Scale</td>
			<td>ViBRA</td>
			<td>HT-224R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bandpass filter</td>
			<td>BRIGHTLINE</td>
			<td>414/46 BrightLine HC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Disposable Syringes with Luer-Lok&#8482; Tips, 1 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punches with Plunger System, 1.5 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punches with Plunger System, 3 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-460-407</td>
			<td>1.5 mm and 3 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt needle, 23-gauge</td>
			<td>BSTEAN</td>
			<td>X001308N97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovin Serum Albumin</td>
			<td>RMBIO</td>
			<td>BSA-BSH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>911015119999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tube, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-539-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MDX01455</td>
			<td>MilliporeSigma&#8482;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EC Low Conductivity meter</td>
			<td>ecoTestr</td>
			<td>358/03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160; &#160;Snap-Cap MicrocentrifugeTubes</td>
			<td>www.eppendorf.com</td>
			<td>05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft&#160;</td>
			<td></td>
			<td>Graph plotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>SIGLENT</td>
			<td>SDG830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass/ITO Electrode Substrate</td>
			<td>OSSILA</td>
			<td>S161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>IX81 - SN9E07015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Oven</td>
			<td>QUINCY LAB (QL)</td>
			<td>MODEL 30GCE</td>
			<td>Digital Model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td>Graph plotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Osmometer - Model 3300</td>
			<td>Advanced Instruments Inc.</td>
			<td>S/N: 03050397P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm Laboratory Wrapping Film</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>SKU=351006</td>
			<td>ICSI/Biopsydish 50*9 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>04-479Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick plasma PDCOOL</td>
			<td>NC0301989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solidworks</td>
			<td>Dassault Systemes</td>
			<td></td>
			<td>CAD software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-188-2419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>SPBEL-ART</td>
			<td>F42400-2121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0304136</td>
			<td>Tongue Depressors Wood NS 6&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

amplitude-modulated electrodeformation to evaluate mechanical fatigue of biological cells

Kırmızı kan hücreleri (RBC'ler) olağanüstü deforme olabilirlikleri ile bilinir. Mikro sirkülasyondan geçerken tekrar tekrar önemli deformasyona uğrarlar. Fizyolojik olarak yaşlanmış eritrositlerde azalmış deformabilite görülür. Hücre deformasyonunu ölçmek için mevcut teknikler, döngüsel yüklerin neden olduğu hücre zarlarındaki kademeli bozulma olan yorgunluğu ölçmek için kolayca kullanılamaz. Mikroakışkan bir kanalda genlik kaydırmalı anahtarlama (ASK) modülasyonu tabanlı elektrodeformasyon kullanarak döngüsel kesme gerilmelerinden kaynaklanan RBC'lerdeki mekanik bozunmayı değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Kısaca, mikroakışkan kanaldaki sayısallaştırılmış elektrotlar, bir sinyal üreteci kullanılarak radyo frekanslarında düşük voltajlı bir alternatif akımla uyarılır. Süspansiyondaki RBC'ler elektrik alanına tepki verir ve hücreleri elektrot kenarlarına hareket ettiren pozitif dielektroforez (DEP) sergiler. Hücreler daha sonra iki hücre yarısına uygulanan elektriksel kuvvetler nedeniyle gerilir ve elektrodeformasyon olarak bilinen tek eksenli gerilmeye neden olur. Kesme gerilimi seviyesi ve ortaya çıkan deformasyon, uyarma dalgasının genliği değiştirilerek kolayca ayarlanabilir. Bu, yüksek verimde küçük ve büyük deformasyonlara yanıt olarak RBC'lerin doğrusal olmayan deforme olabilirliğinin ölçülmesini sağlar. Uyarma dalgasının ASK stratejisi ile değiştirilmesi, programlanabilir yükleme hızları ve frekansları ile döngüsel elektrodeformasyonu indükler. Bu, RBC yorgunluğunun karakterizasyonu için uygun bir yol sağlar. ASK modülasyonlu elektrodeformasyon yaklaşımımız, ilk kez, döngüsel yüklerden kaynaklanan RBC yorgunluğunun doğrudan ölçülmesini sağlar. Genel biyomekanik testler için, diğer hücre tiplerinde ve hastalıklı durumlarda hücre deforme olabilirliği ve yorgunluğunun analizi için bir araç olarak kullanılabilir ve ayrıca oksijen gerilimi ve biyolojik ve kimyasal ipuçları gibi hücrelerin mikro çevresini kontrol etme stratejileri ile birleştirilebilir.

Red blood cells (RBCs) are the most deformable cells in the human body1. Their deformability is directly related to their oxygen-carrying functionality. Reduced deformability in RBCs has been found to correlate with the pathogenesis of several RBC disorders2. Deformability measurements have led us to a better understanding of RBC-related diseases3. The normal lifespan of RBCs can vary from 70 to 140 day4. Therefore, it is important to measure how their deformability decreases along with the aging process, e.g., their fatigue behavior due to cyclic shear stresses3.
Measuring RBC deformability at high throughput is challenging because of the piconewton scale forces (~10-12 N) that are applied to the individual cells. Over the past decade, many technologies have been developed to measure cell deformability5. Deformation measurements of RBCs at the single-cell level can be performed by pipette aspiration and optical tweezers, while bulk analyses are done by osmotic gradient ektacytometry. Ektacytometry analyses provide an abundance of data, which provides an opportunity to diagnose blood disorders6,7. The deformability of RBCs can also be analyzed using the viscoelastic theory by colloid probe atomic force microscopy. In this method, computational analysis is applied to estimate the elastic modulus of RBCs, considering both time-dependent and steady-state responses. The deformability of individual RBCs can be measured by using the single-cell microchamber array method. This method analyzes each cell through the membrane and cytosolic fluorescent markers to provide information for RBC deformability and the distribution of cellular characteristics in complex RBC populations to detect hematologic disorders8.
Fatigue is a key factor in the degradation of properties of engineered materials and biomaterials. Fatigue testing enables a quantitative analysis of the integrity and longevity of a structure subjected to cyclic loading. Analysis of fatigue in biological cells has long been hampered by the lack of a general, readily applicable, high throughput, and quantitative method for the implementation of cyclic deformation in cell membranes. This is possible with the utilization of electrical signal modulation and electrodeformation techniques implemented in a microfluidic setting. The amplitude shift keying (ASK) technique as a digital modulation is applied through On-Off keying (OOK) modulation in this article. The concept of keying refers to the transmission of digital signals over the channel, which requires a sine wave carrier signal to function9. The ON and OFF times can be set equal. Under ON-keying, RBCs enter a deformed state while exposed to an external electrodeformation force (Fdep)10 created by the nonuniform electric field. Under OFF-keying, RBCs are in their relaxed state. We observe the fatigue of RBCs, namely a progressive degradation in their ability to stretch with increasing loading cycles. The fatigue-induced deformability loss in RBCs can provide insights into the accumulated membrane damage during blood circulation, enabling us to further investigate the connections between cell fatigue and disease states.
Here we provide step-by-step procedures on how fatigue testing of RBCs is implemented in a microfluidic device via ASK-modulated electrodeformation and the system settings such as microfluidic device, mechanical loading, and microscopic imagining for the characterization of the gradual degradation in mechanical deformability of RBCs.

Yazar Spotlight: Elektrodeformasyon Davranışlarını Modüle Ederek Dolaşımdaki Hücrelerin Biyomekaniğinin İncelenmesi 

Biyolojik Hücrelerin Mekanik Yorgunluğunu Değerlendirmek için Genlik Modülasyonlu Elektrodeformasyon

Mikroakışkan kanala hücre süspansiyonu yüklendiğinde, nispeten düzgün bir hücre dağılımı gözlendi. Fonksiyon üretecinden gelen sinyal çıkışı (örneğin, basit bir sinüs dalgası veya ASK'nin Anahtarlama fazı) üzerine, ince film sayısallaştırılmış elektrotlar düzgün olmayan bir alternatif akım elektrik alanı üretti. Asılı hücreler bu elektriksel uyarıma kendiliğinden tepki verdiler ve pozitif bir DEP davranışı sergilediler, yani daha yüksek alan kuvvetine sahip elektrotların ken...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Biomechanics of Circulating Cells by Modulating Their Electrodeformation Behavior at JoVE.com

Burada, genlik modülasyonlu bir elektrodeformasyon yaklaşımı kullanan insan kırmızı kan hücreleri durumunda mekanik yorulma testi için bir protokol sunulmaktadır. Bu genel yaklaşım, döngüsel deformasyondan kaynaklanan bir süspansiyondaki biyolojik hücrelerin morfolojik ve biyomekanik özelliklerindeki sistematik değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir.

Red blood cells (RBCs) are known for their remarkable deformability. They repeatedly undergo considerable deformation when passing through the ...

Araştırmamız, insan kırmızı kan hücreleri gibi dolaşımdaki hücrelerin hücre biyomekaniğinin incelenmesine odaklanmıştır. Hücre zarlarındaki hasarın mekanik kökenlerini ve bazı hastalıklarda kan hücrelerinin ömrünün kısalmasının altında yatan mekanizmaları anlamak için elektrokinetik, mikroakışkanlar ve malzeme biliminden yararlanıyoruz. Biyolojik hücrelerin yorulma çalışması zordur.Hücre zarlarına döngüsel yüklerin uygulanmasını ve tek tek hücrelerdeki deformasyonun izlenmesini talep eder. Kırmızı kan hücrelerinin elektrot deformasyon davranışını modüle etmek için ASK için genlik sayfası anahtarını kullanarak, hücre deformabilitesinin yükleme döngüleri ile uyumlu olarak nasıl değiştiğini ölçebiliriz. İlk kez kırmızı kan hücrelerinin zarlarının tek başına döngüsel gerilme ile parçalanabileceğini gösterdik.Protokolümüz, elektrot deformasyon ölçümü için hücreleri elektrot kenarlarına taşımak için dielektroforez kullanır. Herhangi bir stabilizasyon tekniği gerektirmez ve doğrudan hücre süspansiyonu için kullanılabilir. Sayısallaştırılmış mikroelektrotların kullanılması, onlarca hücreyi tek bir görüş alanında ölçmemizi sağlar.

amplitude-modulated-electrodeformation-to-evaluate-mechanical-fatigue

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Electrical Engineering

Bioengineering

Amplitude-Modulated Electrodeformation to Evaluate Mechanical Fatigue of Biological Cells

Unit 1

Operational Amplifiers

SCIENTISTS IN ACTION

1.0K Görüntüleme.  Florida Atlantic University. Araştırmamız, insan kırmızı kan hücreleri gibi dolaşımdaki hücrelerin hücre biyomekaniğinin incelenmesine odaklanmıştır. Hücre zarlarındaki hasarın mekanik kökenlerini ve bazı hastalıklarda kan hücrelerinin ömrünün kısalmasının altında yatan mekanizmaları anlamak için elektrokinetik, mikroakışkanlar ve malzeme biliminden yararlanıyoruz. Biyolojik hücrelerin yorulma çalışması zordur.Hücre zarlarına döngüsel yüklerin uygulanmasını ve tek tek ...

Video: Yazar Spotlight: Elektrodeformasyon Davranışlarını Modüle Ederek Dolaşımdaki Hücrelerin Biyomekaniğinin İncelenmesi 

Red blood cells (RBCs) are known for their remarkable deformability. They repeatedly undergo considerable deformation when passing through the microcirculation. Reduced deformability is seen in physiologically aged RBCs. Existing techniques to measure cell deformability cannot easily be used for measuring fatigue, the gradual degradation in cell membranes caused by cyclic loads. We present a protocol to evaluate mechanical degradation in RBCs from cyclic shear stresses using amplitude shift keying (ASK) modulation-based electrodeformation in a microfluidic channel. Briefly, the interdigitated electrodes in the microfluidic channel are excited with a low voltage alternating current at radio frequencies using a signal generator. RBCs in suspension respond to the electric field and exhibit positive dielectrophoresis (DEP), which moves cells to the electrode edges. Cells are then stretched due to the electrical forces exerted on the two cell halves, resulting in uniaxial stretching, known as electrodeformation. The level of shear stress and the resultant deformation can be easily adjusted by changing the amplitude of the excitation wave. This enables quantifications of nonlinear deformability of RBCs in response to small and large deformations at high throughput. Modifying the excitation wave with the ASK strategy induces cyclic electrodeformation with programmable loading rates and frequencies. This provides a convenient way for the characterization of RBC fatigue. Our ASK-modulated electrodeformation approach enables, for the first time, a direct measurement of RBC fatigue from cyclic loads. It can be used as a tool for general biomechanical testing, for analyses of cell deformability and fatigue in other cell types and diseased conditions, and can also be combined with strategies to control the microenvironment of cells, such as oxygen tension and biological and chemical cues.

Presented here is a protocol for mechanical fatigue testing in the case of human red blood cells using an amplitude-modulated electrodeformation approach. This general approach can be used to measure the systematic changes in morphological and biomechanical characteristics of biological cells in a suspension from cyclic deformation.