Isolation and Dissociation of Gut from Zebrafish Larvae for FACS Enrichment of Gut Cells

Başlamak için, HEPES Tamponlu E3 ortamı veya E3 ile %1,8'lik bir agaroz plakası hazırlayın. Diseksiyon mikroskobu altında çalışırken, agaroz plakasına arka arkaya altı ila 10 anestezi uygulanmış larva yerleştirin. Her larvanın başına bir böcek iğnesi koyun. Ardından kalan E3'ü bir mendil kullanarak plakadan çıkarın.

Başka bir böcek pimi kullanarak, diğer organları rahatsız etmeden bağırsağı larvalardan izole edin. Sarısı uygun şekilde çıkarıldığından emin olun. İzole edildikten sonra bağırsağı inceleyin ve deri, yağ veya karaciğer gibi tüm bağırsak dışı materyalleri çıkarın.

Bağırsağı toplamak için cımbız kullanın ve buz üzerine yerleştirilmiş bir mikrosantrifüj tüpünde% 10 FCS içeren PBS'ye aktarın. Tüm bağırsakların diseksiyonundan hemen sonra, mikrosantrifüj tüpünü 30 saniye boyunca 13.800 g'da santrifüjleyin. Bağırsakların kurumasını önlemek için tüpte yaklaşık 100 mikrolitre bırakarak süpernatanı çıkarın.

Tüpteki bağırsaklara 500 mikrolitre papain çözeltisi ekleyin. 2.5 mikrolitre bir molar sistein ekleyerek papain'i aktive edin. Daha sonra bağırsakları içeren tüpü 37 santigrat derecede bir su banyosunda 10 dakika inkübe edin.

Enzimatik doku sindirimini uyarmak için içeriği beş dakika sonra yarıya kadar yukarı ve aşağı pipetleyin. Ayrışmış hücreleri, önceden evlendirilmiş 35 mikronluk bir hücre süzgecinden floresanla aktive edilen bir hücre sınıflandırma veya FACS tüpüne aktarın. İki mililitrelik toplam yıkama hacmine% 10 FCS içeren 0,5 mililitre PBS ekleyerek süzgeci birkaç kez yıkayın.

Toplanan süzüntüyü 700 g'da 4 santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. % 10 FCS içeren 300 mikrolitre PBS'ye mililitre DAPI başına bir mikrogram ekleyin. Bu karışımı pelete ekleyin ve ölü hücreleri etiketlemek için tekrar süspanse edin.

Daha sonra, sonraki FACS analizi sırasında dışlanmalarına izin vermek için buz üzerinde beş dakika inkübe edin.