Başlamak için, dokuyu ötenazi disseke farenin kemiklerinden çıkarın. Temizlenmiş kemikleri, buz üzerine yerleştirilmiş FACS tamponu içeren altı oyuklu yeni bir plakaya yerleştirin. Kemikleri iki ila beş mililitre FACS tamponu olan bir harca aktarın.
Kemik iliği serbest kalana kadar kemikleri dairesel hareketlerle öğütün. Üç mililitrelik bir şırınga ile kemik iliğini homojenize etmek için yukarı çekin ve aşağı yıkayın. Homojenatı başka bir şırıngaya çekin, ardından 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe süzün.
İkinci kez homojenize etmeden önce doku parçalarını filtrelerinden FACS tamponu ile tekrar harca durulayın. Durulanan dokuyu daha önce olduğu gibi süzün. Daha sonra, kalan kemik spiküllerini FACS tamponu ile tekrar harca durulayın.
Ardından, maksimum verimi sağlamak için parçaları 15 mililitrelik bir tüpe yıkayın. Kemik iliğini sindirmek için önce 300 G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Kemik iliği peletini iki mililitre sindirim karışımında tekrar süspanse edin.
Karışımı 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra bir döndürücü üzerinde 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Şimdi, enzimatik sindirimi durdurmak için 10 mililitre FACS tamponu ekleyin.
Karışımı 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Süspansiyonu 400 G'de dört santigrat derecede yedi dakika santrifüjleyin. Peletin bir mililitre RBC lizis tamponunda yeniden süspanse edilmesi.
Ardından, lizizi durdurmak için 10 mililitre FACS tamponu ekleyin. Ardından karışımı daha önce olduğu gibi 50 mililitrelik bir tüpe süzün. Son olarak, karışımı 300 G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin.
Süpernatanı attıktan sonra, peleti 100 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Kemik spiküllerinin sindirimi için önce kemik spiküllerini vorteksleyin. Süpernatanı boşaltın ve kemikleri altta tutun.
Daha sonra, spikülleri kemik spikül sindirim karışımının bir mililitresinde yeniden süspanse edin. Tüpü bir döndürücü üzerinde 37 santigrat derecede 60 dakika inkübe edin. Son olarak, 10 mililitre FACS tamponu ile sindirimi durdurun.
Karışımı, RBC parçalanmış ve sindirilmiş kemik iliği içeren 50 mililitrelik tüpe süzün.
