Organoid kaplama yapmak için önce süpernatanı santrifüjden çıkarın ve hepatosellüler karsinom hücrelerini yıkayın. Kaplama için hücreleri 50 mikrolitre bazal membran ekstraktında veya oyuk başına BME'de yeniden süspanse edin. Ardından, hücreleri gelişmiş DMEM / F12'de askıya alın.
Ardından, eşit bir süspansiyon görülene kadar hücre agregalarını nazikçe pipetleyin. BME konsantrasyonunun% 30 ile% 50 arasında olmasını sağlayarak süspansiyona BME ekleyinŞimdi 24 oyuklu bir plakanın ortasında hücre kümeleri ile 50 mikrolitre BME damlacıkları tohumlayın. Damlacıkların 37 santigrat derecede 20 dakika katılaşmasına izin verin.
Her oyuğa 500 mikrolitre önceden ısıtılmış ortam ekleyin ve 37 santigrat derecede bir hücre inkübatörde inkübe edin. Kültür ortamını her iki ila üç günde bir yenileyin. İki hafta sonra, izolasyon ortamını organoid genleşme ortamıyla değiştirin.
Yedi ila 10 günlük kültürlemeden sonra, organoidler uygun yoğunluğa ulaştığında, kültürleri gerektiği gibi işleyin. Organoidleri geçmek için, önce ultra düşük bağlantılı yüzey hücre kültürü plakalarını bir inkübatörde önceden ısıtın. Ardından, donmuş BME'yi kullanımdan hemen öncesine kadar gece boyunca dört santigrat derecede çözün.
Organoid hasat çözeltisini ve tripsin ikamesini 37 santigrat derecede 30 dakika önceden ısıtın. Hazırlık aşamasını takiben, kültür ortamını organoid kültür plakasından çıkarın. Ardından organoid süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Şimdi BME miktarıyla orantılı olarak organoid hasat çözeltisi ekleyin. Süspansiyonu karıştırmak için, kazımak ve yukarı ve aşağı pipetlemek için 1000 mikrolitrelik bir pipet tabancası kullanın. Tüpü oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ettikten sonra, BME'yi dikkatlice aspire etmek için bir mililitrelik bir pipet kullanın.
BME'nin tamamen çözüldüğünden emin olun. Berrak bir organoid hücre kümesi görünene kadar ekstraktı her 10 dakikada bir izleyin. Daha sonra oda sıcaklığında 400 g'da beş dakika santrifüjleyin.
Süpernatantın mümkün olduğu kadar çoğunu çıkarın. Hepatoselüler karsinom organoidlerinin enzimatik sindirimini başlatmak için, kültürlenmiş organoid pelete önceden ısıtılmış tripsin ikamesinden bir ila beş mililitre ekleyin. Süspansiyonu 37 santigrat derecede iki dakika inkübe edin.
Organoidlerin iki ila 10 hücreden oluşan küçük kümelere ayrılıp ayrışmadığını doğrulamak için bir mikroskop kullanın. Sindirimi durdurmak için uygun hacimde soğuk bazal ortam ekleyin. Daha sonra organoidleri sekiz santigrat derecede beş dakika boyunca 400 g'da santrifüjleyin.
Mümkün olduğunca fazla süpernatanı dikkatlice çıkarın. Kaplama için uygun matriste istenen sayıda organoidi yeniden askıya alın. Her 10 günde bir, organoid büyümenin yoğunluğuna bağlı olarak organoidleri geçer.
HCC organoidleri sferoidleri kültürden sonraki üç gün içinde gözlendi. Kuruluşun ilk gününde yuvarlatılmış kenarlı ve geçirgen sitozollü kompakt sferoidler görüldü. Organoidler benzer boyuttaydı ve% 30 ila 50 BME'de kültürlendiğinde en büyük çapa sahipti.
BME en çok %10'da parçalandı ve bu da en küçük organoidlerle sonuçlandı. BME% 100'de en sağlamdı, ancak orta çaplı organoidlerle sonuçlandı. Çoğalan HCC organoidi, üç nesil sonra her kültürde 500 mikrometreyi aşan bir boyuta ulaştı.
20 günlük bir kültür periyodu içinde 1000 mikrometreden daha yüksek büyük boyutlu HCC organoidleri elde edildi.
