CRISPR/Cas9 Aracılı CENP-E Nakavt HeLa Hücrelerinin İmmünofloresan Boyama ve Yüksek Çözünürlüklü Konfokal Mikroskopi

Başlamak için, bir kapak fişi üzerinde büyüyen vahşi tip ve CENP-E mutant HeLa hücrelerinden oluşan bir tabak alın. Hücreleri% 4 paraformaldehit ve PBS fiksatif solüsyonu ile oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin. Ardından, her biri beş dakikalık iki tur boyunca PBS'ye daldırın.

Daha sonra, hücreleri% 0.25 Triton X-100 ve PBS ile oda sıcaklığında 10 dakika geçirgenleştirin. Her biri beş dakikalık iki tur boyunca PBS'ye daldırın. Hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca %0.1 Tween 20 ile %1 BSA PBS ile bloke etmeye devam edin.

Primer antikorları %1 BSA ve PBST'de seyreltin ve numuneleri 12 saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Birincil antikor çözeltilerini atın. Ardından, hücreleri PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez durulayın.

Hücreye seyreltilmiş ikincil antikorlar ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Ardından, ikincil antikorları atın. Daha sonra hücreleri PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez durulayın.

Çekirdekleri DAPI kullanarak oda sıcaklığında beş dakika boyayın. Kızakları montaj ortamıyla monte edin ve oje ile kapatın. Floresan görüntüleri, 63 kat büyütme, 1.40 sayısal diyafram açıklığı objektifi ile donatılmış bir taramalı konfokal mikroskop kullanarak gözlemleyin ve daha fazla analiz için kaydedin.

Kontrol ve CENP-E mutant gruplarının immünofloresan boyamaları, CENP-E proteinlerinin floresan yoğunluklarının CENP-E mutant Klon 1 hücrelerinde tamamen nakavt olduğunu ve CENP-E mutant Klon 3 hücrelerinde önemli ölçüde azaldığını gösterdi. Kromozom yanlış hizalamasına sahip metafaz hücrelerinin oranları, kontrol hücrelerine kıyasla Klon 1 ve 3'te artmıştır. Bu arada, metafaz hücrelerinin oranları Klon 1 hücrelerinde ve Klon 3 hücrelerinde önemli ölçüde artmıştır.

Ek olarak, CENP-E delesyonundan sonra Klon 1 ve 3 gruplarında interfaz hücrelerinin oranı, kontrol grubuna kıyasla biraz artmıştır. CENP-E delesyonu sonrası profaz, anafaz ve telofaz hücre oranları bir miktar azalırken, CENP-E delesyonu sonrası metafaz hücre oranları artmıştır.