CRISPR/Cas9 Sistemini Kullanarak Sentromerle İlişkili Protein-E ^CENP-E-/- Nakavt Hücre Hatlarının Üretilmesi

Kinesin-7 ve CENP'nin genetik silinmesi genellikle hücre döngüsünün durması ve hücre ölümü ile sonuçlanır. Kararlı CENP nakavt hücre hatlarının inşası, CENP biyolojisinde çözülmemiş önemli bir konudur. Bu çalışmada, bir CRISPR / Cas9 sistemi kullanarak CENP nakavt HeLa hücreleri oluşturduk ve optimize edilmiş üç tarama stratejisi oluşturduk.

Son zamanlarda, çinko parmak nükleazları, transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazlar ve nükleazlarımızı nasıl yaptığımız dahil olmak üzere çeşitli genom düzenleme teknolojileri, genomları belirli bir boyutta parçalamak için tasarlanmıştır. CRISPR/Cas9 gen nakavt teknolojisi, temel biyoloji, biyoteknoloji ve tıpta devrim yarattı. CENP, kinetokorları mikrotübüllere bağlamak ve kromozomları hizalamak için gereklidir.

Antikor mikroenjeksiyonu, sgRNA delesyonu, kimyasal inhibisyon veya genetik delesyon yoluyla CENP'nin bozulması, kromozomun yanlış hizalanmasına, mitotik kusurlara ve sıklıkla hücre ölümüne neden olarak CENP protein mekanizmalarının incelenmesini zorlaştırır. Bu çalışmada, hücre kolonisi taraması, fenotiplerin kromozom hizalaması ve CENP proteinlerinin floresan yoğunlukları dahil olmak üzere üç optimize edilmiş fenotip tabanlı tarama stratejisi oluşturulmuştur, bu da tarama verimliliğini ve deneysel başarı oranını artırmıştır. Daha da önemlisi, CENP silinmesi kromozomun yanlış hizalanmasına, BubR1 proteinlerinin anormal konumuna ve mitotik kusurlara neden olur.

CENP ve inhibitörlerinin etkileşim modları ve moleküler mekanizmaları, hücre biyolojisi ve kanser araştırmalarında önemli araştırma alanlarıdır. Bu çalışmada, CENP nakavt HeLa hücre hattı, CENP inhibitörlerinin özgüllüğünün ve toksisitesinin doğrulanması için değerli bir araç olarak kurulmuştur.