Sentetik Hücre Uygulamaları için Küçük Unilamellar Veziküller (SUV'ler) ile Toplu Hücresiz Ekspresyon Reaksiyonları

Başlamak için, şişeyi hafifçe döndürürken POPC lipitleri içeren bir cam şişeye hafif bir Argonne akışı üfleyin. Lipitler, şişenin dibinde bir film olarak kuruduğunda, gevşek bir şekilde kapatın, ardından bir kurutucuya aktarın. Bir saat sonra, lipit filmi çözmek için 0,5 mililitre ultra saf deiyonize su ekleyin.

Çözeltiyi iki dakika boyunca girdaplayın. Ardından, iki filtre desteğini ve deiyonize suyu ıslatın. Bunları iç zar desteklerinin her birine yerleştirin.

Ardından, ekstrüder dış kasası ve tespit somunu tarafından bir arada tutulan iki iç membran desteği arasına 100 nanometrelik bir polikarbonat filtre yerleştirin. Mini ekstrüzyon aparatının kurulumunu tamamlamak için kurulumu ekstrüder standına yerleştirin. Daha sonra, lipit su karışımını bir mililitrelik gaz geçirmez bir şırıngaya yükleyin.

Şırıngayı mini ekstrüderin bir ucuna sabitlemek için salıncak kolu klipslerini kullanın. İkinci şırıngayı mini ekstrüderin diğer ucuna yerleştirin ve tamamen bastırıldığından emin olun. Şimdi lipit su karışımını orijinal şırıngadan aparattan boş olana geçirin.

Ekstrüzyonu 11 kez tekrarladıktan sonra SUV'ları 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Hücresiz ekspresyon protokolünü birleştirmek için, çözünür SFGFP veya glutamat reseptörü SFGFP, murin RNAse ve SUV çözeltisinin varyantlarını kodlayan bir ila 3 DNA plazmid çözeltisini bir şişeye pipetleyin. Reaksiyon hacmini 20 mikrolitreye çıkarmak için ultra saf deiyonize su ekleyin.

Hücresiz ekspresyon çözeltisini 96 kuyulu konik V alt plakaya aktarın. Plakayı bir plaka okuyucuda 37 santigrat derecede dört ila beş saat inkübe edin. Plaka okuyucuyu 100 kazanç, 485 nanometre uyarma, 528 nanometre emisyon, beş saatlik çalışma süresi ve her iki dakikada bir okuma aralığı ölçümü ile ayarlayın.

Hücresiz reaksiyonu gerçek zamanlı olarak izlemek için GFP sinyalini her iki dakikada bir ölçün. Çözünür SFGFP, her üç protein arasında en yüksek ekspresyona sahipti.