APL, Ulusal Bilim Vakfı (EF1935265), Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01-EB030031 ve R21-AR080363) ve Ordu Araştırma Ofisi'nden (80523-BB) destek almaktadır

Bu çalışma için kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda verilmiştir.
1. Küçük unilamellar veziküllerin (SUV'lar) varlığında toplu CFE reaksiyonları
<ol><li>SUV hazırlığı NOT: Bu adımın, kloroform ile çalışmaya ilişkin güvenlik talimatlarına uygun olarak çeker ocakta gerçekleştirilmesi gerekir.<ol><li>Kloroform içinde çözünmüş 76 μL 25 mg / mL POPC stok çözeltisini aktararak bir cam şişede 5 mM 1-palmitoil-2-oleoil-glisero-3-fosfokolin (POPC) SUV hazırlayın.</li>
		<li>Cam şişeyi nazikçe döndürürken, altta bir kuru lipit filmi oluşturmak için şişeye hafif bir argon akışı üfleyin. Daha sonra, cam şişeyi, fazla kloroformu buharlaştırmak için kapağı gevşek bir şekilde vidalanmış bir desikatöre aktarın.</li>
		<li>Cam şişeyi kurutucuda 1 saat tutun. Ardından, lipid filmi çözmek için 0,5 mL ultra saf deiyonize su ekleyin ve yaklaşık 2 dakika girdap yapın.</li>
		<li>İki filtre desteğini deiyonize suya batırarak ve bunları iç membran desteklerinin her birine yerleştirerek bir mini ekstrüzyon aparatı kurun. Ardından, 100 nm'lik bir polikarbonat filtreyi ıslatın ve ekstrüder dış kasası ve tespit somunu tarafından bir arada tutulan iki iç membran desteği arasına yerleştirin. Bu kurulumu ekstrüder standına yerleştirin.</li>
		<li>İki adet 1 mL gaz geçirmez şırıngayı ultra saf deiyonize su ile 3 kez yıkayın.</li>
		<li>Lipit-su karışımı örneğini 1 mL gaz geçirmez şırıngalardan birine yükleyin ve şırıngayı yerinde tutmak için salıncak kolu klipslerini kullanarak mini ekstrüderin bir ucuna yerleştirin. İkinci şırıngayı mini ekstrüderin diğer ucuna yerleştirin ve tamamen bastırıldığından emin olun. NOT: Şırıngaya lipit-su karışımı yüklerken, mini ekstrüderden geçirmeden önce şırıngada hava olmadığından emin olun.</li>
		<li>Lipit-su karışımını orijinal şırıngadan mini ekstrüder aparatından boş şırıngaya nazikçe geçirin. SUV'lar oluşturmak için bu adımı 11 kez tekrarlayın. SUV'ları 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. NOT: SUV çözümü 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>CFE reaksiyon düzeneği<ol><li>CFE reaksiyonunu, aşağıda ayrıntıları verilen küçük değişikliklerle üretici tarafından sağlanan hücresiz ekspresyon protokolünü izleyerek birleştirin.</li>
		<li>10 μL Çözelti 1 (amino asitler, NTP'ler, tRNA'lar ve enzimler için substratlar ve gerekli tampon içeren), 1 μL Çözelti 2 (% 20 gliserol içindeki proteinler), 2 μL Çözelti 3 (ribozom (20 μM)), çözünür sfGFP-sfCherry (1-10) 27 (bundan sonra çözünür sfGFP olarak anılacaktır), WT-GluR0-sfGFP veya PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 ng / 1000 baz çifti) için kodlayan uygun miktarda DNA'yı karıştırın, 1 μL murin RNAse inhibitörü ve membran proteinleri için 4 μL 5 mM SUV çözeltisi veya çözünür proteinler için 4 μL su.</li>
		<li>Ultra saf deiyonize su ekleyerek reaksiyonun son hacmini 20 μL'ye getirin. NOT: CFE sistemini monte ederken, tüm bileşenler buz üzerinde tutulmalıdır. Tüm malzemeler sıcaklığa duyarlıdır ve oda sıcaklığına ulaştıklarında bozulabilirler.</li>
	</ol></li>
	<li>CFE reaksiyon inkübasyonu ve izlenmesi<ol><li>CFE çözeltisini 96 oyuklu konik bir V-alt plakaya aktarın. Reaksiyon sırasında buharlaşmayı önlemek için, plakayı bir sızdırmazlık filmi kullanarak örtün.</li>
		<li>Plakayı 37 °C'de bir plaka okuyucuda 4-5 saat inkübe edin ve her 2 dakikada bir 488 nm/528 nm uyarma/emisyon dalga boylarında 100'lük bir kazançla GFP sinyalini ölçerek CFE reaksiyonunu izleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. GUV'lerde kapsüllenmiş CFE reaksiyonları
<ol><li>GUV dış tampon çözeltisinin hazırlanması<ol><li>1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 1.5 μL 1 M spermidin, 37.5 μL 100 mM ATP, 25 μL 100 mM GTP, 12.5 μL 100 mM CTP, 12.5 μL 100 mM UTP, 25 μL 1 M kreatin fosfat, 18 μL 1 M magnezyum asetat, 93.33 μL 3 M potasyum glutamat karıştırın, 50 μL 1 M HEPES KOH (pH 7.4), 1.15 μL 332 mM folinik asit, 100 μL 2 M glikoz ve 50 μL 6 mM stok çözeltisinden 20 amino asidin her birinin karışımı (Sun ve ark.28 tarafından tarif edilen protokol izlenerek hazırlanmıştır).</li>
		<li>Ultra saflaştırılmış deiyonize su ekleyerek çözeltinin son hacmini 1 mL'ye getirin. NOT: Tüm bileşenler buz üzerinde tutulmalıdır. Amino asit tükenmesini önlemek için en sona amino asit karışımını ekleyin28. Çözelti 330 μL'lik alikotlarda toplanabilir ve kullanıma kadar -20 ° C'de saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Yağda lipid karışımının hazırlanması NOT: Bu adımın, kloroform ile çalışmaya ilişkin güvenlik talimatlarına uygun olarak çeker ocakta gerçekleştirilmesi gerekir.<ol><li>Bir davlumbazda, 17.3 μL 25 mg / mL POPC stok çözeltisi ve 1.08 μL 50 mg / mL poli (bütadien) -b-poli (etilen oksit) (PEO-b-PBD) kopolimerini 15 mL'lik bir cam şişede karıştırın. NOT: Nihai yağda lipid çözeltisi, sırasıyla% 95 ve% 5 POPC ve PEO-b-PBD ile 0.5 mM lipid içerir. PEO-b-PBD, protein ekspresyonu sırasında membran stabilitesini arttırmak için kullanıldı, ancak kopolimerin lipid moleküllerinden ayrı misellere toplanma eğilimini azaltmak için düşük bir molar oranda tutuldu29,30.</li>
		<li>Kloroformu buharlaştırmak için şişeyi döndürürken cam şişeye hafif bir argon gazı akışı dikkatlice üfleyin.</li>
		<li>Kurutulmuş lipitleri içeren 15 mL'lik cam şişeye 1.2 mL hafif mineral yağ pipetleyin.</li>
		<li>Lipitleri ve yağı 10-20 saniye boyunca maksimum hızda girdaplayarak karıştırın. Çözünmüş lipit-kopolimer karışımı bulanık görünecektir.</li>
		<li>Yağdaki tüm olası lipid agregalarının tamamen çözünmesini ve yağ boyunca dağılmasını sağlamak için, cam şişeyi maksimum hızda 10-20 saniye daha vortekslemeden önce 20 dakika boyunca yaklaşık 50 °C'de bir fırına koyun.</li>
	</ol></li>
	<li>CFE reaksiyon montajı ve kapsüllemesi (Şekil 1 aşağıdaki adımları özetlemektedir).<ol><li>Adım 2.1'de hazırlanan 270 μL CFE dış tampon çözeltisini, 15 μL 5 M NaCl ve 15 μL'yi 4.5 M KCl'yi karıştırarak 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 300 μL GUV dış çözeltisi hazırlayın. NOT: Bu adımda, GUV dış çözeltisine 0,45 μL 1 M 1,4-dithiothreitol (DTT) ekleyin. NaCl ve KCl eklemenin amacı, dış çözeltinin ozmolalitesini iç CFE çözeltisiyle eşleşecek şekilde ayarlamaktır. NaCl ve KCl'nin tam hacmi, istenen ozmolalite ayarına bağlıdır. Ozmolaliteyi ayarlamak için NaCl veya KCl veya her ikisi birden eklenebilir.</li>
		<li>GUV dış solüsyonunun üzerine 300 μL yağda lipid karışımını nazikçe pipetleyin. NOT: Lipit-yağ karışımını eklerken, yağın sulu dış çözelti ile karışmaması önemlidir. Eklemeden sonra, yağ içinde lipid karışımı ile GUV dış çözeltisi arasında görünür bir arayüz olmalıdır.</li>
		<li>Lipid tek tabakasının arayüzde oluşmasını ve stabilize olmasını sağlamak için yağ-su arayüzünü oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.</li>
		<li>Bu arada, zar protein varyantlarını veya çözünür GFP'yi kodlayan plazmit DNA'sını içeren bir CFE reaksiyonu oluşturmak için bölüm 1.2.1'i izleyin. 4 μL 5 mM SUV solüsyonunu veya suyu 4 μL 1 M sükroz ile değiştirin. Bu reaksiyon GUV iç çözeltisi olacaktır. NOT: İç ve dış çözeltilerin ozmolalitesini ölçmek için bir ozmometre kullanılmıştır. Dış çözeltinin ozmolalitesi daha sonra NaCl veya su ilavesiyle buna göre ayarlandı. CFE reaksiyonunun ozmolalitesi tipik olarak 1600 mOsm/Kg civarındadır. Reaksiyona sükroz eklenmesi, iç çözelti yoğunluğunu arttırır, böylece santrifüjleme adımı sırasında veziküllerin yağ-su arayüzü boyunca hareket etmesine izin verir. Sükroza bir alternatif, Opti-Prep yoğunluk gradyan çözeltisidir.</li>
		<li>CFE reaksiyonunu içeren mikrosantrifüj tüpüne 600 μL lipit-yağ karışımı ekleyin ve reaksiyonu yağda lipid çözeltisinde emülsifiye etmek ve sentetik hücrelerin etrafında lipit tek tabakasını oluşturmak için ~ 1 dakika boyunca kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin. NOT: Nihai çözeltide kabarcık olmamalı ve opak görünmelidir.</li>
		<li>İç çözelti emülsiyonunu, yağ-su arayüzünün kurulduğu 1.5 mL mikrosantrifüj tüpündeki yağ tabakasının üzerine nazikçe pipetleyin. NOT: Arayüzü bozmamaya veya dengesini bozmamaya dikkat edin.</li>
		<li>4 ° C'de 2.000 x g'de 10 dakika santrifüjleyin. NOT: Santrifüjleme hızı bu protokol için optimize edilmiştir. Adir ve ark.31 farklı bir santrifüj hızı bildirmiştir.</li>
		<li>Santrifüjleme bittiğinde, bir pipetleyici kullanarak fazla yağı ve dış çözeltiyi mikrosantrifüj tüpünden dikkatlice çıkarın. Kalan hacim yaklaşık 100 μL olana kadar dış çözeltiyi çıkarın. NOT: Mikrosantrifüj tüpünün altında genellikle bir GUV peleti görülür. Bununla birlikte, görünür bir peletin olmaması, mutlaka GUV veriminin olmadığı anlamına gelmez. Bir pipetleyici kullanmak yerine, dış çözeltinin üstündeki fazla yağ aspirasyon ile çıkarılabilir. Yağdaki lipit çözeltisinin tamamen çıkarıldığından emin olmak çok önemlidir. GUV solüsyonundaki yağ kirliliği düşük kaliteli görüntülere neden olabilir.</li>
		<li>GUV peletini kalan 100 μL'lik çözelti içinde hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Ardından, GUV çözeltisini inkübe etmek için temiz, 96 iyi berrak düz tabanlı bir plakaya aktarın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Kapsüllenmiş CFE reaksiyon inkübasyonu ve görüntüleme
<ol><li>Buharlaşmayı önlemek için plakayı bir sızdırmazlık filmi kullanarak örtün. Plakayı 37 °C'de 5-6 saat inkübe edin. Plaka okuyucuyu inkübasyon adımına hazırlamak için bir plaka okuyucu kullanılabilir ve adım 1.3.2 takip edilebilir.</li>
	<li>İnkübasyon bittikten sonra, 96 oyuklu plakayı bir EMCCD kamera (veya bir sCMOS kamera), DAQ-MX kontrollü lazer (veya entegre bir lazer birleştirici sistemi) ve bir CSU-X1 eğirme diski konfokal (veya bir lazer tarama konfokal) ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskobun görüntüleme aşamasına yerleştirin. GUV'ler içeren herhangi bir ROI'ye odaklanın ve Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA objektif kullanarak 488 nm'lik bir uyarma dalga boyunda görüntüler yakalayın.</li>
	<li>GUV'lerin görüntülerini .tiff formatında kaydedin.</li>
	<li>Görüntüleri bir görüntü işleme yazılımında (ör. ImageJ veya Fiji) açın. Brightness/Contrast (Parlaklık/Kontrast ) ayar panelini açın. Parlaklığı ve kontrastı, floresan proteinleri görünür kılan uygun ayarlara ayarlayın.</li>
	<li>Amaç, ifade edilen farklı proteinlerin sinyal yoğunluğunu karşılaştırmaksa, önce Görüntü > Yığınlar alt menüsü altında bulunan Yığına Görüntüler panelini kullanarak farklı proteinler içeren GUV'lerin tek tek görüntülerini yığınlayın. Ardından, Parlaklık/Kontrast panelini kullanarak tüm görüntülerin parlaklığını ve kontrastını ayarlayın.</li>
</ol>

Dev Unilamellar Veziküllerde Membran Proteinlerinin Hücresiz Ekspresyonu

<ol>
	<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+In+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).</li><li>Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+tissue-scale+properties+with+synthetic+cells:+Forging+one+from+many.">Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many.</a> ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).</li><li>Powers, J., Jang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+biomimetic+functions+of+synthetic+cells+through+compartmentalized+cell-free+protein+synthesis.">Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis.</a> Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+Past,+present+and+future.">Artificial cells: Past, present and future.</a> ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).</li><li>Groaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+spatiotemporal+organization+and+dynamics+in+synthetic+cells.">Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells.</a> WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685 (2021).</li><li>Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+cell+as+a+platform+for+understanding+membrane-membrane+interactions.">Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions.</a> Membranes. 11 (12), 912 (2021).</li><li>Bashirzadeh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+crosslinker+competition+and+sorting+drive+emergent+GUV+size-dependent+actin+network+architecture.">Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture.</a> Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).</li><li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes.">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> iScience. 25 (5), 104236 (2021).</li><li>Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+photosynthetic+cell+producing+energy+for+protein+synthesis.">Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis.</a> Nat Commun. 10 (1), 1325 (2019).</li><li>Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-regulated+and+bidirectional+communication+in+synthetic+cell+communities.">Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities.</a> ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).</li><li>Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-based+juxtacrine+signaling+between+synthetic+cells.">Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells.</a> bioRxiv. , (2024).</li><li>Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+and+tunable+performance+of+a+cell-free+biosensor+encapsulated+in+lipid+vesicles.">Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles.</a> Science Advances. 9 (1), 6605 (2023).</li><li>Schneider, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Protein+expression+in+cell-free+systems.">Membrane Protein expression in cell-free systems.</a> Methods Mol Biol. 601, 165-186 (2010).</li><li>Noireaux, V., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+age+of+cell-free+biology.">The new age of cell-free biology.</a> Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).</li><li>Majumder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-sized+mechanosensitive+and+biosensing+compartment+programmed+with+DNA.">Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA.</a> Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).</li><li>Poddar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+stretching+activates+calcium+permeability+of+a+putative+channel+Pkd2+during+fission+yeast+cytokinesis.">Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis.</a> MBoC. 33 (14), (2022).</li><li>Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+protein+synthesis+in+cell-free+systems:+From+bio-mimetic+systems+to+bio-membranes.">Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes.</a> FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).</li><li>Dondapati, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+membrane+proteins+derived+from+eukaryotic+cell-free+systems.">Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems.</a> Front Pharmacol. 10, 917 (2019).</li><li>Majumder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+synthesis+and+reconstitution+using+mammalian+cell-free+lysates+enables+the+systematic+study+of+the+regulation+of+LINC+complex+assembly.">In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly.</a> Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).</li><li>Niwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+study+of+liposome-assisted+synthesis+of+membrane+proteins+using+a+reconstituted+cell-free+translation+system.">Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system.</a> Sci Rep. 5 (1), 18025 (2015).</li><li>Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstitution+platforms+of+mammalian+cell-free+expressed+membrane+proteinsmembrane+proteins.">In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins.</a> Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).</li><li>Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cotranslational+recruitment+of+ribosomes+in+protocells+recreates+a+translocon-independent+mechanism+of+proteorhodopsin+biogenesis.">Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis.</a> iScience. 24 (5), 102429 (2021).</li><li>Steink&#252;her, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell-free+expression+of+membrane+proteins+by+tuning+ribosome+cotranslational+membrane+association+and+nascent+chain+aggregation.">Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation.</a> bioRxiv. , (2023).</li><li>Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+a+potassium-selective+prokaryotic+glutamate+receptor.">Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor.</a> Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).</li><li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+unilamellar+vesicles+using+an+inverted+emulsion.">Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li><li>Hsu, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-triggered+DNA-mediated+membrane+fusion+in+synthetic+cells.">Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells.</a> Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).</li><li>Moghimianavval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+functional+membrane-membrane+interfaces+by+interspy.">Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy.</a> Small. 19 (13), 2202104 (2023).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli+based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> J Vis Exp. (79), e50762 (2013).</li><li>Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diblock+copolymers+enhance+folding+of+a+mechanosensitive+membrane+protein+during+cell-free+expression.">Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression.</a> PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).</li><li>Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+conjugation+of+(tri-)+block+copolymers+to+liposomes+toward+the+construction+of+sterically+stabilized+vesicle+systems.">Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems.</a> Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).</li><li>Adir, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+protein+producing+synthetic+cells+using+cell+free+bacterial+extracts,+liposomes+and+emulsion+transfer.">Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer.</a> J Vis Exp. (158), e60829 (2020).</li><li>van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+giant+unilamellar+vesicle+production+for+artificial+cells+-+current+challenges+and+future+directions.">Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions.</a> Small Methods. 7 (12), 2300416 (2023).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+Not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).</li><li>Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detergent-free+systems+for+structural+studies+of+membrane+proteins.">Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins.</a> Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).</li><li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles.">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> J Vis Exp. (177), e63332 (2021).</li><li>Hwang, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vesicles+enable+mechano-responsive+hydrogel+degradation.">Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation.</a> Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509 (2023).</li><li>Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+and+polymersomes:+a+comparative+review+towards+cell+mimicking.">Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking.</a> Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).</li><li>Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reverse-phase+method+revisited:+Rapid+high-yield+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles+(GUVs)+using+emulsification+followed+by+centrifugation.">A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation.</a> Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).</li><li>Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photostable+silicon+rhodamine+platform+for+optical+voltage+sensing.">A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing.</a> J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).</li><li>Bailoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+out-of-equilibrium+metabolism+for+synthetic+cells:+A+membrane+perspective.">Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective.</a> ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Hücre sinyalizasyonu veya hücre uyarımı gibi moleküllerin veya bilgilerin hücre zarı boyunca transferine bağlı olan hemen hemen her hücresel süreç, zar proteinleri gerektirir. Bu nedenle, zar proteinlerinin sulandırılması, farklı uygulamalar için çeşitli sentetik hücre tasarımlarının gerçekleştirilmesinde ana darboğaz haline gelmiştir. Biyolojik membranlardaki membran proteinlerinin geleneksel deterjan aracılı sulandırılması, hafif şişme veya elektroformasyon gibi GUV üretim yöntemleri...

Aşağıdan yukarıya sentetik biyoloji, biyomühendislik, ilaç dağıtımı ve rejeneratif tıpta çok sayıda potansiyel uygulamaya sahip gelişmekte olan bir alan olarak son on yılda artan bir ilgi kazanmıştır 1,2. Özellikle aşağıdan yukarıya sentetik biyolojinin temel taşı olarak sentetik hücrelerin geliştirilmesi, sentetik hücrelerin umut verici uygulamalarının yanı sıra in vitro biyofiziksel çalışmaları kolaylaştıran hücre benzeri fiziksel ve biyokimyasal özellikleri nedeniyle çok çeşitli bilimsel toplulukları cezbetmiştir 3,4,5,6 . Sentetik hücreler genellikle farklı biyolojik süreçlerin yeniden yaratıldığı hücre büyüklüğünde dev unilamellar veziküllerde (GUV'ler) tasarlanır. Hücre hücre iskeletininyeniden yapılandırılması 7,8, ışığa bağlı enerji yenilenmesi9, hücresel iletişim10,11 ve biyoalgılama12, sentetik hücrelerde hücre benzeri davranışları yeniden yapılandırma çabalarına örnektir.
Bazı hücresel süreçler çözünür proteinlere dayanırken, doğal hücrelerin algılama ve iletişim gibi birçok özelliği genellikle iyon kanalları, reseptörler ve taşıyıcılar dahil olmak üzere zar proteinlerini kullanır. Sentetik hücre gelişimindeki en büyük zorluk, zar proteinlerinin yeniden yapılandırılmasıdır. Lipid çift tabakalarında geleneksel membran proteini sulandırma yöntemleri deterjan aracılı saflaştırmaya dayansa da, bu tür yöntemler zahmetlidir, ekspresyon konakçısı için toksik olan proteinler için etkisizdir veya genellikle GUV'lerde membran proteini sulandırması için uygun değildir13.
Protein ekspresyonu için alternatif bir yöntem, hücresiz ekspresyon (CFE) sistemleridir. CFE sistemleri, sentetik biyolojide, hücre lizatı veya saflaştırılmış transkripsiyon-translasyon makinesi kullanarak çeşitli proteinlerin in vitro ekspresyonuna izin veren güçlü bir araç olmuştur14. CFE sistemleri ayrıca GUV'lerde kapsüllenebilir, böylece hafif hasat yapan sentetik hücrelerin9 veya mekanosensitif biyosensörlerin15,16 oluşturulması gibi çeşitli uygulamalar için programlanabilen bölümlere ayrılmış protein sentezi reaksiyonlarına izin verir. Rekombinant protein ekspresyonu yöntemlerine benzer şekilde, CFE sistemlerinde membran protein ekspresyonu zordur17. CFE sistemlerinde agregasyon, yanlış katlanma ve translasyon sonrası modifikasyon eksikliği, CFE sistemleri kullanılarak başarılı membran protein sentezini engelleyen başlıca darboğazlardır. CFE sistemlerini kullanarak aşağıdan yukarıya membran proteininin sulandırılmasının zorluğu, kısmen sinyal peptitlerine, sinyal tanıma parçacıklarına, translokonlara ve şaperonlama moleküllerine dayanan karmaşık bir membran protein biyogenez yolunun olmamasından kaynaklanmaktadır. Bununla birlikte, son zamanlarda, çok sayıda çalışma, translasyon sırasında mikrozomlar veya lipozomlar gibi membranöz yapıların varlığının başarılı membran protein ekspresyonunu desteklediğini göstermiştir 18,19,20,21. Ek olarak, Eaglesfield ve ark. ve Steinküher ve ark. membran proteininin N-terminalinde sinyal peptitleri olarak bilinen spesifik hidrofobik alanların dahil edilmesinin, ekspresyonunu önemli ölçüde iyileştirebileceğini bulmuşlardır 22,23. Toplamda, bu çalışmalar, protein translasyonu GUV membranının varlığında meydana gelirse ve uygun N-terminal sinyal peptidi kullanılırsa, sentetik hücrelerde membran proteininin sulandırılması zorluğunun üstesinden gelinebileceğini düşündürmektedir.
Burada, GUV'lerde membran proteininin yeniden yapılandırılması için rekombinant elementler (PURE) CFE reaksiyonları kullanılarak protein sentezinin kapsüllenmesi için bir protokol sunulmaktadır. Bakteriyel glutamat reseptörü24 (GluR0) model membran proteini olarak seçilir ve N-terminal sinyal peptidinin membran sulandırması üzerindeki etkisi incelenir. Eaglesfield ve ark.22 tarafından membran proteini sulandırma verimliliğini arttırdığı gösterilen proteorhodopsin sinyal peptidinin etkisi, PRSP-GluR0 olarak gösterilen mutasyona uğramış bir GluR0 varyantı oluşturularak araştırılır ve doğal sinyal peptidini barındıran vahşi tip GluR0 (bundan sonra WT-GluR0 olarak anılacaktır) ile ekspresyonu ve membran lokalizasyonu karşılaştırılır. Bu protokol, CFE kapsüllemesi için sağlam hale getiren modifikasyonlarla birlikte ters çevrilmiş emülsiyon yöntemine25 dayanmaktadır. Sunulan yöntemde, CFE reaksiyonları ilk olarak, CFE sistemini içeren ve lipid tek tabakası tarafından stabilize edilen mikron boyutunda damlacıklar üreten bir yağ içinde lipid çözeltisi kullanılarak emülsifiye edilir. Emülsiyon damlacıkları daha sonra başka bir lipit tek tabakası ile doyurulmuş bir yağ-su arayüzünün üzerine katmanlanır. Emülsiyon damlacıkları daha sonra merkezkaç kuvveti yoluyla yağ-su arayüzü boyunca hareket etmeye zorlanır. Bu işlem sayesinde, damlacıklar başka bir tek tabaka elde eder, böylece iki tabakalı bir lipit vezikül oluşturur. CFE reaksiyonunu içeren GUV'ler daha sonra inkübe edilir, bu sırada membran proteini eksprese edilir ve GUV membranına dahil edilir. Bu protokol, GluR0'ın hücresiz ekspresyonu için belirtilmiş olsa da, diğer zar proteinlerinin hücresiz sentezi veya hücre iskeleti yeniden yapılandırması veya zar füzyon çalışmaları gibi farklı sentetik hücre uygulamaları için kullanılabilir26.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 nm polycarbonate filter</td>
			<td>STERLITECH</td>
			<td>1270193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Clear Bottom Plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>165305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>11-120-533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10621714001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1 Confocal Scanner Unit</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density gradient medium (Optiprep)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>Optional to switch with sucrose in inner solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter supports</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand microtubes (1.5 mL)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic acid calcium salt hydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>F7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>158968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon X3 camera&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light mineral oil</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate tetrahydrate&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M5661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 Inverted Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2B933&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEO-b-PBD</td>
			<td>Polymer Source</td>
			<td>P41745-BdEO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA</td>
			<td>Homemade</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC lipid in chloroform&#160;</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PUREfrex 2.0</td>
			<td>Cosmo Bio USA</td>
			<td>GFK-PF201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleotide Solution Set</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N0450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor, Murine</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTS Amino Acid Sampler</td>
			<td>Biotechrabbit</td>
			<td>BR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600</td>
			<td>ELITechGroup</td>
			<td>VAPRO 5600</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of the bacterial glutamate receptor channel by encapsulation of a cell-free expression system

Hücresiz ekspresyon (CFE) sistemleri, sentetik biyolojide, sentetik hücrelerde biyoalgılama ve enerji rejenerasyonu gibi hücresel işlevlerin biyomimikrisine izin veren güçlü araçlardır. Bununla birlikte, çok çeşitli hücresel süreçlerin yeniden yapılandırılması, zar proteinlerinin sentetik hücrelerin zarına başarılı bir şekilde yeniden yapılandırılmasını gerektirir. Çözünür proteinlerin ekspresyonu genellikle yaygın CFE sistemlerinde başarılı olsa da, sentetik hücrelerin lipid çift katmanlarında zar proteinlerinin yeniden yapılandırılmasının zor olduğu kanıtlanmıştır. Burada, bir model membran proteini olan bakteriyel glutamat reseptörünün (GluR0), dev unilamellar veziküllerde (GUV'ler) sentetik hücreler içinde CFE reaksiyonunun kapsüllenmesine ve inkübasyonuna dayalı olarak model sentetik hücreler olarak sulandırılması için bir yöntem gösterilmiştir. Bu platformu kullanarak, GluR0'ın N-terminal sinyal peptidinin proteorhodopsin sinyal peptidi ile ikame edilmesinin, GluR0'ın hibrit GUV'lerin membranlarına başarılı kotranslasyonel translokasyonu üzerindeki etkisi gösterilmiştir. Bu yöntem, sentetik hücrelerde çeşitli zar proteinlerinin hücresiz olarak yeniden yapılandırılmasına izin verecek sağlam bir prosedür sağlar.

Bottom-up synthetic biology has gained increasing interest over the past decade as an emerging field with numerous potential applications in bioengineering, drug delivery, and regenerative medicine1,2. The development of synthetic cells as a cornerstone of bottom-up synthetic biology, in particular, has attracted a wide range of scientific communities due to the promising applications of synthetic cells as well as their cell-like physical and biochemical properties that facilitate in vitro biophysical studies3,4,5,6. Synthetic cells are often engineered in cell-sized giant unilamellar vesicles (GUVs) in which different biological processes are recreated. Reconstitution of cell cytoskeleton7,8, light-dependent energy regeneration9, cellular communication10,11, and biosensing12 are examples of efforts made to reconstruct cell-like behaviors in synthetic cells.
While some cellular processes rely on soluble proteins, many characteristics of natural cells, such as sensing and communication, often utilize membrane proteins, including ion channels, receptors, and transporters. A major challenge in synthetic cell development is the reconstitution of membrane proteins. Although traditional methods of membrane protein reconstitution in lipid bilayers rely on detergent-mediated purification, such methods are laborious, ineffective for proteins that are toxic to the expression host, or are often not suited for membrane protein reconstitution in GUVs13.
An alternative method for protein expression is cell-free expression (CFE) systems. CFE systems have been a powerful tool in synthetic biology that allows in vitro expression of various proteins using either cell lysate or purified transcription-translation machinery14. CFE systems can also be encapsulated in GUVs, thus allowing compartmentalized protein synthesis reactions that can be programmed for various applications, such as the creation of light-harvesting synthetic cells9 or mechanosensitive biosensors15,16. Analogous to recombinant protein expression methods, membrane protein expression is challenging in CFE systems17. Aggregation, misfolding, and lack of post-translational modification in CFE systems are major bottlenecks that hinder successful membrane protein synthesis using CFE systems. The difficulty of bottom-up membrane protein reconstitution using CFE systems is due in part to the absence of a complex membrane protein biogenesis pathway that relies on signal peptides, signal recognition particles, translocons, and chaperoning molecules. However, recently, multiple studies have suggested that the presence of membranous structures such as microsomes or liposomes during translation promotes successful membrane protein expression18,19,20,21. Additionally, Eaglesfield et al. and Steink&#252;her et al. have found that the inclusion of specific hydrophobic domains known as signal peptides in the N-terminus of the membrane protein can significantly improve its expression22,23. Altogether, these studies suggest that the challenge of membrane protein reconstitution in synthetic cells can be overcome if the protein translation occurs in the presence of the GUV membrane and if proper N-terminal signal peptide is utilized.
Here, a protocol for encapsulation of the protein synthesis using recombinant elements (PURE) CFE reactions for membrane protein reconstitution in GUVs is presented. Bacterial glutamate receptor24 (GluR0) is selected as the model membrane protein, and the effect of its N-terminal signal peptide on its membrane reconstitution is studied. The effect of proteorhodopsin signal peptide, which was shown to improve membrane protein reconstitution efficiency by Eaglesfield et al.22, is investigated by constructing a mutated variant of GluR0 denoted as PRSP-GluR0 and its expression and membrane localization with wild-type GluR0 (referred to as WT-GluR0 hereafter) that harbors its native signal peptide is compared. This protocol is based on the inverted emulsion method25 with modifications that make it robust for CFE encapsulation. In the presented method, the CFE reactions are first emulsified using a lipid-in-oil solution that generates micron-sized droplets that contain the CFE system and are stabilized by the lipid monolayer. The emulsion droplets are then layered on top of an oil-water interface that is saturated with another lipid monolayer. The emulsion droplets are then forced to travel across the oil-water interface via centrifugal force. Through this process, the droplets obtain another monolayer, thus generating a bilayer lipid vesicle. The GUVs containing the CFE reaction are then incubated, during which the membrane protein is expressed and incorporated into the GUV membrane. Although this protocol is specified for cell-free expression of GluR0, it can be used for cell-free synthesis of other membrane proteins or different synthetic cell applications such as cytoskeleton reconstitution or membrane fusion studies26.

Yazar Spotlight: Sentetik Hücrelerde Membran Proteini Sulandırması

Bakteriyel Glutamat Reseptör Kanalının, Hücresiz Bir Ekspresyon Sisteminin Kapsüllenmesi ile Sulandırılması

Our protocol addresses the reconstitution of a membrane protein within the lipid bilayer of a synthetic cell made using the inverted droplet emulsion method. The advantage of using the inverted droplet emulsion method is its ability to generate synthetic cells that provide a stable environment for the cell-free expression of membrane proteins. Our protocol offers a robust method for researchers in the field to synthesize membrane proteins inside synthetic cells using cell-free expression system.My lab is working on reconstituting various ion channels in synthetic cells through the reconstitution of the action potential by a well-defined set of ion channels.

CFE reaksiyonlarının kapsüllenmesinden önce, doğal ve proteorhodopsin sinyal peptitlerini barındıran iki GluR0-sfGFP varyantı (sinyal peptit dizileri Ek Tablo 1'de sunulmuştur) ve çözünür sfGFP, toplu reaksiyonlarda ayrı ayrı eksprese edildi ve ekspresyonları, bir plaka okuyucu kullanılarak sfGFP sinyali tespit edilerek izlendi (Şekil 2A). Membran proteinleri, 100 nm SUV'ların yokluğunda veya varlığında eksprese edildi. Ek olarak, sfGF...

Watch this Scientific Journal Video about Membrane Protein Reconstitution in Synthetic Cells at JoVE.com

Bu protokol, bir model membran proteininin lipid çift tabakasına sentezinin ve dahil edilmesinin araştırılması için dev bir unilamellar vezikül (GUV) içinde bir hücresiz ekspresyon (CFE) sistemini kapsüllemek için kullanılan ters emülsiyon yöntemini tanımlar.

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy ...

Protokolümüz, ters çevrilmiş damlacık emülsiyon yöntemi kullanılarak yapılan sentetik bir hücrenin lipid çift tabakası içindeki bir zar proteininin sulandırılmasını ele almaktadır. Ters çevrilmiş damlacık emülsiyon yöntemini kullanmanın avantajı, zar proteinlerinin hücresiz ekspresyonu için kararlı bir ortam sağlayan sentetik hücreler üretme yeteneğidir. Protokolümüz, alandaki araştırmacıların hücresiz ekspresyon sistemi kullanarak sentetik hücrelerin içindeki zar proteinlerini sentezlemeleri için sağlam bir yöntem sunmaktadır.Laboratuvarım, iyi tanımlanmış bir dizi iyon kanalı ile aksiyon potansiyelinin yeniden yapılandırılması yoluyla sentetik hücrelerde çeşitli iyon kanallarının yeniden oluşturulması üzerinde çalışıyor.

reconstitution-bacterial-glutamate-receptor-channel-encapsulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Reconstitution of the Bacterial Glutamate Receptor Channel by Encapsulation of a Cell-Free Expression System

787 Görüntüleme.  University of Michigan, Ann Arbor. Protokolümüz, ters çevrilmiş damlacık emülsiyon yöntemi kullanılarak yapılan sentetik bir hücrenin lipid çift tabakası içindeki bir zar proteininin sulandırılmasını ele almaktadır. Ters çevrilmiş damlacık emülsiyon yöntemini kullanmanın avantajı, zar proteinlerinin hücresiz ekspresyonu için kararlı bir ortam sağlayan sentetik hücreler üretme yeteneğidir. Protokolümüz, alandaki araştırmacıların hücresiz ekspresyon sistemi kullanarak sentetik hücrelerin i...

Video: Yazar Spotlight: Sentetik Hücrelerde Membran Proteini Sulandırması

Cell-free expression (CFE) systems are powerful tools in synthetic biology that allow biomimicry of cellular functions like biosensing and energy regeneration in synthetic cells. Reconstruction of a wide range of cellular processes, however, requires successful reconstitution of membrane proteins into the membrane of synthetic cells. While the expression of soluble proteins is usually successful in common CFE systems, the reconstitution of membrane proteins in lipid bilayers of synthetic cells has proven to be challenging. Here, a method for reconstitution of a model membrane protein, bacterial glutamate receptor (GluR0), in giant unilamellar vesicles (GUVs) as model synthetic cells based on encapsulation and incubation of the CFE reaction inside synthetic cells is demonstrated. Utilizing this platform, the effect of substituting the N-terminal signal peptide of GluR0 with proteorhodopsin signal peptide on successful cotranslational translocation of GluR0 into membranes of hybrid GUVs is demonstrated. This method provides a robust procedure that will allow cell-free reconstitution of various membrane proteins in synthetic cells.

This protocol describes the inverted emulsion method used to encapsulate a cell-free expression (CFE) system within a giant unilamellar vesicle (GUV) for the investigation of the synthesis and incorporation of a model membrane protein into the lipid bilayer.

Biyomühendislik

Bulk Cell-Free Expression Reactions with Small Unilamellar Vesicles (SUVs) for Synthetic Cell Applications

To begin, blow a gentle stream of Argonne into a glass vial containing POPC lipids while gently rotating the vial. When the lipids have dried as a film at the bottom of the vial, loosely cap it, then transfer it to a desiccater. After one hour add 0.5 milliliters of ultrapure deionized water to dissolve the lipid film.Vortex the solution for two minutes. Next, soak two filter supports and deionized water. Place them on each of the internal membrane supports.Then place a 100 nanometer polycarbonate filter between the two internal membrane supports, held together by the extruder outer casing and retainer nut. Place the setup in the extruder stand to finish setting up the mini extrusion apparatus. Next, load the lipid water mix into a one milliliter gast tight syringe.Use swing arm clips to secure the syringe into one end of the mini extruder. Insert the second syringe into the other end of the mini extruder, making sure that it is fully depressed. Now pass the lipid water mix from the original syringe into the empty one through the apparatus.After repeating the extrusion 11 times, transfer the SUVs to a 1.5 milliliter micro centrifuge tube. To assemble the cell-free expression protocol, pipette solutions one to 3 DNA plasmid encoding for soluble SFGFP or variants of glutamate receptor SFGFP, murine RNAse, and SUV solution into a vial. Add ultrapure deionized water to bring the reaction volume to 20 microliters.Transfer the cell-free expression solution to a 96 well conical V bottom plate. Incubate the plate in a plate reader at 37 degrees Celsius for four to five hours. Set up the plate reader with a gain of 100, excitation of 485 nanometers, emission of 528 nanometers, a runtime of five hours, and an interval measurement of one read for every two minutes.Measure the GFP signal every two minutes to monitor the cell-free reaction in real time. Soluble SFGFP had the highest expression among all three proteins.

Sentetik Hücre Uygulamaları için Küçük Unilamellar Veziküller (SUV'ler) ile Toplu Hücresiz Ekspresyon Reaksiyonları

Cell-Free Reactions in Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) for Synthetic Cell Applications

To begin, prepare the GUV outer buffer solution in a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. Mixed together spermidine, ATP, GTP, CTP, UTP, creatine phosphate, magnesium acetate, potassium glutamate, HEPES, potassium hydroxide, folinic acid. glucose, and amino acid stock.Add ultra purified deionized water to bring the final volume of the solution to one milliliter. Next, in a fume hood, add 17.3 microliters of POPC stock solution to a 15-milliliter glass vial. To this, pipette 1.08 microliters of PEO-b-PBD copolymer.Carefully blow a gentle stream of argon gas into the glass vial while rotating the vial to evaporate the chloroform. Then pipette 1.2 milliliters of light mineral oil into the glass vial. Vortex the lipid and oil at maximum speed for 10 to 20 seconds.Place the glass vial in an oven at around 50 degrees Celsius for 20 minutes before vortexing for an additional 10 to 20 seconds at maximum speed. Next, pipette 270 microliters of the GUV outer solution into a 1.5-milliliter microcentrifuge tube. To this, pipette 15 microliters each of five molar sodium chloride and 4.5 molar potassium chloride.Gently pipette 300 microliters of lipid and oil mixture on top of the GUV outer solution. After incubation, assemble a CFE reaction by pipetting Solutions 1 to 3, DNA plasmid encoding for soluble sfGFP or variants of glutamate receptor sfGFP, murine RNAse, and one molar sucrose into a vial. Add ultrapure deionized water to bring the reaction volume to 20 microliters.Add 600 microliters of the lipid-oil mixture to the microcentrifuge tube containing the 20-microliter reaction mixture. Pipette up and down vigorously for one minute to emulsify the reaction. Gently layer the inner emulsion on top of the oil layer in the tube.Centrifuge for 10 minutes at 2000 g at four degrees Celsius. Next, carefully pipette out the excess oil and outer solution from the microcentrifuge tube. Gently mix the GUV pellet in the remaining solution to resuspend it.Transfer the GUV solution to a clean 96-well clear flat bottom plate for incubation. Transfer the sealed plate into a plate reader to incubate at 37 degrees Celsius for five to six hours. After incubation, place the plate on an inverted confocal microscope.Focus on a region of interest containing the GUVs, then capture the images at an excitation wavelength of 488 nanometers. Save the images in the TIFF format. Open the images in an image processing software.Click on the Brightness/Contrast setting panel to open it. Then adjust the brightness and contrast to make the fluorescent proteins visible. The wild-type glutamate receptor cell-free expression reactions encapsulated in GUV demonstrated excellent expression and membrane localization.PRSP-glutamate receptor was prone to aggregation and punctate formation. The soluble sfGFP was expressed in GUVS and stayed in the GUV lumen.