Başlamak için kelepçe tutucuları ve metal kelepçeleri hazırlayın. Eşleşen cl'yi yerleştirinamp her biri bir metal cl ile kelepçe tutucular montaj istasyonuna. Islak otoklavlanmış kağıt parçalarını metal kelepçelerin üzerine yerleştirin.
Kağıdı neşter ile kelepçelerin iç kenarları boyunca kesin. İki küçük kağıt parçası daha kesin ve ıslak tutun. Sivri uçlu cımbız kullanarak, uç noktaları kelepçelerin üzerinde olacak şekilde metal kelepçeler arasındaki kağıda sekiz çekirdek eksplant yerleştirin.
Çekirdek eksplantlarının uç noktalarını daha küçük kağıt parçalarıyla örtün ve üstüne metal kelepçeler yerleştirin. Metal kelepçeler ve kelepçe tutucu arasındaki çekirdek eksplantlarını sabitlemek için bir tornavida ve küçük vidalar kullanın. Kelepçelenmiş çekirdek eksplantlarını dikkatlice silikon kültür odalarına aktarın ve bu odaları iki mililitre standart hücre kültürü ortamı ile doldurun.
Ardından montajı ek vidalarla sabitleyin. Kollajen hidrojeli hazırlamak için, önce bir hücre ayırma solüsyonu kullanarak hedef hücreleri doku kültürü kaplarından çıkarın. Daha sonra oda sıcaklığında beş dakika boyunca 400G'de santrifüjleyin, ardından bir mililitre standart kültür ortamında yeniden süspanse edin.
Daha sonra, montaj başına 10 mikrolitre PBS, 1.28 mikrolitre bir molar NaOH ve 8.72 mikrolitre çift damıtılmış suyu karıştırarak bir çapraz bağlama çözeltisi hazırlayın. 12 assembloid'e kadar hücre süspansiyonunu ekleyin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Hücre süspansiyonunu, aşağıdaki nihai konsantrasyonlar elde edilecek şekilde ayarlayın.
Ayrı olarak, her assemboid başına bir tane olmak üzere 80 mikrolitre kollajen ekleyerek bir kollajen bir çözelti hazırlayın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Çözeltiler buz üzerinde hazır olduğunda, hücre kültürü ortamını kenetlenmiş çekirdek eksplantlarını içeren odalardan aspire edin. Çapraz bağlama solüsyonuna kollajen bir solüsyon ekleyin ve kabarcıklar oluşturmadan hızlı bir şekilde pipetleyerek karıştırın.
Tek tek tendon çekirdeği eksplantlarını kaplamak için silikon odalarındaki oluklara 200 mikrolitre karışık çözelti ekleyin. Hidrojellerin 37 santigrat derecede 50 dakika polimerize olmasına izin verin. Daha sonra silikon kültür odalarını, odaların köşelerine pipetleyerek 1,5 mililitre ilgili ko-kültür ortamıyla dikkatlice doldurun.
Odaları bir inkübatöre koymadan önce büyük bir petri kabına veya steril bir kutuya yerleştirin. Asambloidleri uygun koşullarda kültürleyin, kültür ortamını haftada iki kez değiştirin. Asambloidleri kelepçelerden makasla çıkarın.
Gerekirse, çekirdek eksplantlarını harici hidrojel bölmesinden ayırmak için cımbız kullanın. Asambloidin 21 günden fazla bir süre boyunca lezyon benzeri kültür koşullarında kültürlenmesi üzerine, çekirdek eksplantının mekanik olarak gerilebilir, görünüşte değişmemiş, görsel olarak ayırt edilebilir ve çevredeki hidrojelden fiziksel olarak ayrılabilir kaldığı gözlemlendi. Ayrıca, çevredeki hidrojel, Aşil tendonundan türetilen fibroblastların çevredeki hidrojeli en hızlı şekilde daralttığı tohumlanmış hücre popülasyonuna bağlı olarak zamanla sıkışır.
3D kollajen hidrojelde canlılık, morfoloji ve hücre yayılımı için konfokal mikroskopi değerlendirmesi, canlılığın en az yedinci güne kadar assembloid kültürü sırasında korunduğunu ortaya koydu. Ayrıca, Vegfa ve Mmps'nin gen ekspresyonu, transkriptomik analizde görüldüğü gibi çekirdek eksplantlarda güçlü bir şekilde artmıştır. Benzer şekilde, sekretom analizi, çekirdek eksplantlarda vasküler endotelyal büyüme faktörü gibi sitokinlerin varlığını tespit etti.
