SNSF'nin J.H.N.'ye verdiği 310030_219210 no'lu hibe, bu el yazmasının herhangi bir kısıtlama olmaksızın yayınlanmasını destekledi. Şekil 1 , BioRender.com yardımıyla oluşturulmuştur.

Prosedürler Kuzeybatı ve Orta İsviçre etik komitesi (EKNZ; Proje Kimliği 2019-00273). Tüm hastalar endoskopik incelemeden önce biyopsilerin deneysel kullanımı için yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler. Çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Hasta kaynaklı özofagus organoidleri için hücre izolasyonu
NOT: İnsan özofagus organoidlerinin kültürlenmesi için ortam bileşenlerinin bir listesi Tablo 1'de verilmiştir.
<ol><li>Biyopsileri alın. NOT: Bu çalışmada, biyopsi forseps ile özofagogastroduodenoskopi sırasında 2.8 mm çalışma kanalına sahip gastroskop kullanılarak bir özofagus segmentinden iki biyopsi alınmıştır.</li>
	<li>Biyopsileri ticari olarak temin edilebilen keratinosit serumsuz ortama aktarın (KSFM; Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE). NOT: Biyopsiler kullanılana kadar birkaç saat buz üzerinde saklanabilir.</li>
	<li>KSFM ortamını 1 mL Dispas I (10 U / mL) ile değiştirin ve biyopsileri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Biyopsileri oda sıcaklığında 300 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Biyopsilere ve hücre kalıntısı peletine dokunmadan 1000 μL'lik bir pipet kullanarak Dispase'ı aspire edin.</li>
	<li>Biyopsileri 1 mL Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile durulayın.</li>
	<li>Biyopsileri oda sıcaklığında 300 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>1000 μL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı aspire edin.</li>
	<li>Biyopsileri 500 μL Tripsin-EDTA (% 0.05) ile 37 ° C'de 10 dakika boyunca 800 rpm'de çalkalarken inkübe edin.</li>
	<li>Tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar tekrar tekrar yukarı ve aşağı pipetleme yaparak mekanik bozulma gerçekleştirin.</li>
	<li>Bir tüberkülin şırıngasının kauçuk piston kafasını kullanarak hücreleri 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.</li>
	<li>Süzgeci 2-4 mL soya fasulyesi tripsin inhibitörü (250 μg/mL) ile yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri, 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüp üzerinde geçmeli kapaklı 35 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.</li>
	<li>Tek hücreli çözeltiyi 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.</li>
	<li>300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>1000 μL'lik bir pipet kullanarak süpernatanı aspire edin.</li>
	<li>Hücreleri 100 μL KSFM ortamında yeniden süspanse edin.</li>
	<li>10 μL tripan mavisini 10 μL hücre süspansiyonu ile karıştırın.</li>
	<li>Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.</li>
</ol>2. Hasta kaynaklı organoid kültür
<ol><li>Saydıktan sonra hücre süspansiyonuna 1-2 mL KSFM ekleyin.</li>
	<li>300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Hücre peletini bozmadan süpernatanı 1000 μL'lik bir pipetle aspire edin.</li>
	<li>Hücre peletini Bodrum membran ekstraktı (BME) hidrojel matrisinde (20.000 hücre başına 40 μL BME) yeniden süspanse edin. NOT: BME'yi ekledikten sonra, BME'nin erken katılaşmasını önlemek için hücreleri buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Viskoz BME hücreli süspansiyon karışımını aspire etmek için 200 μL'lik bir pipet ucunu kesin.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış (37 °C) bir süspansiyon hücre kültürü plakasında 40 μL damlacıklar oluşturun.</li>
	<li>BME damlacıklarının katılaşmasını sağlamak için plakayı 37 ° C'de 20-30 dakika besiyeri olmadan inkübe edin.</li>
	<li>Kültürün ilk iki günü için 10 μM Y27632 (ROCK inhibitörü) ile desteklenmiş önceden ısıtılmış KSFM-C ortamı ekleyin.</li>
	<li>Ortamı her gün yeni KSFM-C ortamıyla (Y27632 ve +/- ilgilenilen sitokin olmadan) değiştirin.</li>
	<li>Ortamı aspire edin ve kuyuya sürekli olarak 1 mL Dispase II (1.5 U / mL) eklerken pipet ucuyla damlacıkları kazıyın.</li>
	<li>BME-dispas karışımını 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve BME'yi sindirmek için çalkalayan bir su banyosunda 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.</li>
	<li>4 ° C'de 3 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin ve Dispase II'yi aspire edin.</li>
	<li>İlgi okumasının protokolüne göre ilerleyin (ör., RNA izolasyonu, protein izolasyonu veya histoloji için% 4 PFA ile fiksasyon).</li>
</ol>3. Hastadan türetilen hava-sıvı arayüz (ALI) kültürleri için hücre izolasyonu
<ol><li>Biyopsileri alın. 2.8 mm çalışma kanalına sahip gastroskop kullanılarak özofagogastroduodenoskopi sırasında biyopsi forsepsleri ile bir özofagus segmentinden iki biyopsi alınır.</li>
	<li>Biyopsileri piyasada bulunan keratinosit serumu içermeyen ortama (KSFM; Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) ve kullanıma kadar birkaç saat buz üzerinde saklayın.</li>
	<li>KSFM'yi 1 mL Dispase (10 U/mL) ile değiştirin. Daha sonra biyopsileri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Biyopsileri oda sıcaklığında 300 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Biyopsilere ve hücre kalıntısı peletine dokunmadan 1000 μL'lik bir pipet kullanarak Dispase'ı çıkarın.</li>
	<li>Biyopsileri 1 mL DPBS ile yıkayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında, biyopsileri 2 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.</li>
	<li>Süpernatanı 1000 μL'lik bir pipetle aspire edin.</li>
	<li>Biyopsileri 500 μL Tripsin-EDTA (% 0.05) içinde 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin ve inkübasyon sırasında 800 rpm'de sürekli karıştırın.</li>
	<li>Tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar tekrarlanan yukarı ve aşağı pipetleme ile biyopsileri mekanik olarak bozun.</li>
	<li>Ayrışmış hücreleri, bir tüberkülin şırıngasından kauçuk bir piston kafası ile 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin ve hücreleri 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın.</li>
	<li>Süzgeçten kalan hücreleri çıkarmak için süzgeci 2-4 mL soya fasulyesi tripsin inhibitörü (250 μg/mL) ile yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri 35 μm hücre süzgeci geçmeli kapakla 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüpe süzün.</li>
	<li>Hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.</li>
	<li>300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı 1.000 μL'lik bir pipetle çıkarın.</li>
	<li>Hücre peletini 10 μM Y27632 dahil olmak üzere 4 mL KSFM ortamında (Ca2+ 0.09 mM) yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücreleri bir T25 hücre kültürü şişesine aktarın.</li>
	<li>Birincil keratinositleri genişletmek için, hücreleri yaklaşık 1 hafta boyunca% 60 -% 80 birleşene kadar kültürleyin. NOT: Geçiş (P)0, adacık benzeri hücre konglomeraları oluşturur ve tek katmanlı değildir. Primer keratinositler P1'den itibaren tek tabakalar oluştururlar.</li>
	<li>% 60 -% 80 birleşmede geçiş ve 2-3 T25 veya 1-2 T75 hücre kültürü şişelerinde P1'i yeniden tohumlayın.</li>
	<li>Keratinositler% 60 -% 80 birleşme ile bir tek tabaka oluşturduğunda tekrar P1 geçişi.</li>
</ol>4. Hastadan türetilen hava-sıvı arayüzü (ALI) kültürü
<ol><li>ALI kültürü için P2 birincil keratinositlerini transwell eklere tohumlayın. NOT: 500 μL KSFM'de (Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) 12 kuyulu ekte (0.6cm2 başına 200.000 keratinosit) 400.000 hücre tohumlayın.<ol><li>100 μL KSFM'de (Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) 24 kuyucuklu ekte (0.5cm2 başına 155.000 keratinosit) 150.000 hücre tohumlayın.</li>
		<li>Alternatif olarak, KSFM ortamında (Ca2+ 0.09 mM + %10 DMSO) -80 °C'de 24 saat dondurun ve ardından donmuş hücreleri daha sonra kullanmak üzere sıvı nitrojene aktarın. NOT: Dondurulmuş şişeleri kullanırken, ALI kültürü için hücreleri kullanmadan önce çözüldükten sonra bir kez daha geçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Transwell kültür plakasının ekinin altındaki alt kuyuya orta ekleyin. NOT: 12 oyuklu plaka için: 1,5 mL KSFM (Ca2+ 0,09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE). 24 kuyucuklu plaka için: 600 μL KSFM (Ca2+ 0.09 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE).</li>
	<li>Orta ila yüksek kalsiyumlu KSFM'yi (Ca2+ 1.8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) 2 gün sonra değiştirin.</li>
	<li>Yüksek kalsiyumlu KSFM ortamını 7. güne kadar her iki günde bir değiştirin.</li>
	<li>7. günde, ortamı üst odadan aspire ederek ve alt odadaki ortamı 10 ng/mL KGF (=FGF7), 75 μg/mL askorbik asit (AA) içeren yüksek kalsiyumlu KSFM (Ca2+ 1.8 mM, 1 ng/mL EGF, 50 μg/mL BPE) ile değiştirerek hava ikmali gerçekleştirin.<ol><li>İsteğe bağlı: Ortama istenen konsantrasyonda ilgilenilen sitokin ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Ortamı 14. güne kadar her iki günde bir değiştirin.</li>
</ol>5. Transepitelyal elektrik direnci (TEER) ölçümü
<ol><li>TEER ölçüm cihazının elektrodunu, 10-15 dakika boyunca% 5 sodyum hipoklorit içeren 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna daldırarak sterilize edin.</li>
	<li>Elektrodu steril ddH2O ile ardışık 4 kuyuya daldırarak ve elektrotun kurumasını sağlayarak %5 sodyum hipokloriti yıkayın.</li>
	<li>Bir elektrotu kuyuya ve ikinci elektrotu transwell ekine yerleştirerek, PBS ile doldurarak ve TEER'i ölçerek boşluğu ayarlayın. NOT: TEER ölçümleri için önerilen hacimler: 12 kuyulu plaka için (kuyuda 1900 μL ve ekte 900 μL). 24 kuyulu plaka için (kuyuda 750-1000 μL ve ekte 250 μL).</li>
	<li>ALI kültürlerinin ortamını oda sıcaklığında steril PBS ile değiştirin. NOT: Ortamı alt kuyudan ve ikinci adımda transwell ekinden çıkarın. Benzer şekilde, ALI kültürünün transwell membranından ayrılmasını önlemek için PBS'yi önce eke ve ardından alt kuyucuğa ekleyin.</li>
	<li>TEER metre elektrotlarını ALI kültürleri ile deney kuyularına yerleştirin ve TEER ölçümünügerçekleştirin 1. NOT: Ortam değiştirilmeden önce her iki günde bir TEER ölçümleri yapın.</li>
</ol>6. Makromoleküler akı
<ol><li>FITC-Dextran (3-5 kDa) stok çözeltisini çalışan 1 mg / mL konsantrasyona seyreltin. NOT: FITC-DEXTRAN'ı her zaman ışığa maruz kalmaktan koruyun.</li>
	<li>Okuma için standart olarak azalan FITC konsantrasyonuna (1000 μg/mL ila 0.25 μg/mL) sahip bir seyreltme sırası hazırlayın.</li>
	<li>Transwell'in üst bölmesine 500 μL FITC-dekstran çözeltisi (1 mg / mL) ve alt bölmeye 1.5 mL ortam (+/- ilgilenilen sitokin) ekleyin ve plakayı inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>İlgili zaman noktalarında alt bölmeden 120 μL ortam toplayın (örn. 0 dk, 15 dk, 30 dk, 60 dk, 90 dk, 120 dk, 150 dk ve 180 dk).</li>
	<li>Pipet, her zaman noktasının kopyalarını (50 μL/oyuk) siyah 96 oyuklu şeffaf düz tabanlı bir plakaya dönüştürür.</li>
	<li>FITC-dekstran'ı 490 nm'de uyarın ve bir plaka okuyucu kullanarak emisyonu 520 nm dalga boyunda okuyun.</li>
	<li>Standarda göre makromoleküler akı miktarını hesaplayın.</li>
</ol>

İnsan Özofagus Organoidleri ve Hava-Sıvı Arayüz Kültür Protokolleri

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Sağlanan prosedürler, başarı olasılığı yüksek olan hasta kaynaklı organoidlerin ve ALI kültürlerinin yetiştirilmesine izin verir. Organoid protokolü, insan özofagus organoidlerinin26 oluşumunu bildiren ilk yayınlanan protokolden ve yakın zamanda yayınlanan bir protokolden32 uyarlanmıştır. Sherill ve meslektaşları ALI model22'yi tanımladılar. Organoidler ve ALI kültür modelleri, EoE 5,26<s...

Özofagus iltihabı, özofagusun Th2 baskın kronik inflamatuar bir hastalığı olan eozinofilik özofajitte (EoE) gözlendiği gibi epitel bariyer bütünlüğünü 1,2,3,4,5 tehlikeye atar 6. EoE ilk olarak 1990'larda 7,8 tanımlanmıştır ve ağırlıklı olarak gıda antijenleri 9,10,11,12,13 tarafından indüklenmiştir. Yetişkin popülasyonda en sık görülen EoE semptomları disfaji ve gıda etkisidir14. Çocuklarda, EoE tipik olarak gelişememe, gıda reddi, kusma ve karın ağrısı ile kendini gösterir15. Genom çapında ilişkilendirme çalışmaları (GWAS), epitel bariyer bütünlüğünde yer alan EoE risk genlerini tanımlamış ve epiteli EoE araştırmasının odak noktasına taşımıştır 16,17,18. EoE transkriptomikleri ayrıca, bozulmuş bir farklılaşma sürecinin ve reaktif bir bazal bölge hiperplazisinin, özofagus epitelinin 3,5,19,20,21,22 bozulmuş bariyer fonksiyonuna neden olduğunu ortaya koydu. EoE'nin Th2 aracılı bir hastalık6 olduğunun erken anlaşılması, epitel bütünlüğünü bozarak IL-13'ün itici bir aracı olarak keşfedilmesine yol açmıştır 3,4,21,23. Epitel bütünlüğü üzerindeki sitokin aracılı etkilerin genetik yatkınlık yoluyla içsel bariyer bozukluğundan diseksiyonuna izin veren deneysel sistemler, EoE'deki immün hücreler ve epitel arasındaki karmaşık etkileşimi inceleme imkanı sağlar. İnsan özofagus organoidleri ve hava-sıvı arayüz (ALI) kültürleri, sitokin stimülasyonunun epitel bütünlüğü üzerindeki sonucunu analiz etmek için değerli araçlar olarak önerilmiştir5.
Yetişkin dokuya özgü kök hücre (ASC) türevi özofagus organoidlerinin üretilmesi için ilk protokol, 2009 yılında bağırsak organoidlerinin ilk yayınlanan raporlarından beş yıl sonra, ince bağırsağın epitel bölmesini özetleyen bağırsak Lgr5 + ASC'leri kullanılarak oluşturulmuştur24. DeWard ve ark. murin özofagus epitel hücrelerinden organoidlerin üretilmesine öncülük etti25. 2018'de Kasagi ve ark. ölümsüzleştirilmiş insan özofagus skuamöz epitel hücre hattı EPC2-hTERT ve birincil hasta kaynaklı hücrelerden insan özofagus organoidleri üretti26. Aynı yıl, Zhang ve ark. indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi özofagus organoidlerini başarıyla üretti. Özofagus progenitör hücre (EPC) gelişimi için TGFβ ve kemik morfogenetik protein (BMP) inhibisyonunun önemini ve tabakalı skuamöz epitelin farklılaşmasında Notch sinyallemesinin kritik rolünü tanımladılar26,27. Trisno ve meslektaşları, Sox2'yi gelişimsel kaderi özofagus farklılaşmasına yönlendiren bir Wnt inhibitörü olarak tanımlayarak bu bulguları tamamladılar28. Protokollerin, ortam bileşiminin ve kültür koşullarının müteakip iyileştirmeleri, organoid oluşum oranını arttırdı ve kriyoprezervasyondan sonra organoidlerin alt kültürlenmesini ve geri kazanılmasını mümkün kıldı 26,29,30,31,32. Bu organoidler, sitokinlerle stimülasyondan sonra doku mimarisini ve potansiyel hedef genlerin ekspresyonunu incelemek için güçlü araçlar olmasına rağmen, özofagus organoidleri, bariyer bütünlüğü için doğrudan ölçümler olarak transepitelyal direnci (TEER) veya makromolekül akısını ölçme imkanı sunmayacaktır. Sherrill ve meslektaşları22 tarafından daha önce tanımlandığı gibi, epitelyal farklılaşmayımodelleyen ALI kültürleri 4, epitel bütünlüğünün doğrudan değerlendirilmesine izin verir. Hasta kaynaklı organoidleri ve ALI kültürlerini birleştirmek, EoE'de doku mimarisini ve epitel bariyer bütünlüğünü araştırmak için güçlü bir araçtır.
Burada, özofagus biyopsilerinden canlı hücrelerin izole edilmesi ve sitokinlerin bariyer bütünlüğü üzerindeki etkilerini incelemek için daha fazla kullanılabilecek özofagus organoid ve ALI kültürlerinin oluşturulması için talimatlar içeren prosedürler verilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3945.070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pituitary extract</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>7.657 185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>3532-010-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVE-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell counting slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>FD4</td>
			<td>average mol wt 3000-5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus - Megafuge&#160; 40R&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant epidermal growth factor</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein</td>
			<td>R&amp;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>251-KG-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 100-1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 20-200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td></td>
			<td>1134950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T9128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>SAFC Biosciences (Merck)</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris (Bio-Techne)</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional cell culture models to investigate the epithelial barrier in eosinophilic esophagitis 

Özofagusun skuamöz epiteli doğrudan çevreye maruz kalır ve sürekli olarak gıda antijenleri ve mikroplar dahil olmak üzere yabancı antijenlerle karşı karşıya kalır. Epitel bariyerinin bütünlüğünün korunması, enfeksiyonları önlemek ve zararsız gıda kaynaklı antijenlerin neden olduğu iltihaplanmayı önlemek için kritik öneme sahiptir. Bu makale, doku homeostazı ve hastalığı bağlamında özofagusun epitel kompartmanını incelemek için hasta biyopsilerinden insan özofagus organoidleri ve hava-sıvı arayüz kültürleri oluşturmak için basitleştirilmiş protokoller sunmaktadır. Bu protokoller, son on yılda, hastadan türetilen birincil hücrelerden, organoidlerden ve hava-sıvı arayüz kültürlerinden üç boyutlu organ benzeri yapıları tanımlayan önemli bilimsel kilometre taşları olmuştur. Donörün fenotipik ve genetik özelliklerini korurken, özofagus epitelinde spesifik sitokinlerin, büyüme faktörlerinin ve sinyal yollarının işlevini üç boyutlu bir çerçeve içinde araştırma imkanı sunarlar. Organoidler, sitokin stimülasyonu sonrası transkriptom ve proteomu değerlendirerek doku mikromimarisi hakkında bilgi sağlar. Buna karşılık, hava-sıvı arayüz kültürleri, transepitelyal direnç (TEER) veya makromolekül akı ölçümleri yoluyla epitel bariyer bütünlüğünün değerlendirilmesine izin verir. Bu organoidleri ve hava-sıvı arayüz kültürlerini birleştirmek, bozulmuş özofagus epitel bariyeri koşullarında araştırmaları ilerletmek için güçlü bir araçtır.

Özofagus organoidleri, ters çevrilmiş bir parlak alan mikroskobu ile belgelendiği gibi, sağlanan protokolün talimatlarına göre hasta biyopsilerinden ekstrakte edilen birincil hücrelerden büyüyecektir (Şekil 1). Epitelyal ASC'ler, izole edilen hücreleri bazal membran ekstraktında tohumladıktan sonra kültürün ilk iki günü içinde kendi kendini organize eden bir şekilde hücre kümeleri oluşturmaya başlar ve bir iskele görevi görür. Ters çevrilmiş parlak alan mikrosk...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis at JoVE.com

Yazar Spotlight: Eozinofilik Özofajitin Patofizyolojisinin Araştırılması

Burada, insan özofagus organoidlerinin kültürü ve hava-sıvı arayüz kültürü için bir protokol sağlanmıştır. Özofagus organoidlerinin hava-sıvı arayüz kültürü, sitokinlerin özofagus epitel bariyeri üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir.

Eozinofilik Özofajitte Epitel Bariyerini Araştırmak İçin Üç Boyutlu Hücre Kültürü Modelleri 

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

Eozinofilik özofajitin patofizyolojisini araştırıyoruz ve EOE'nin kronik inflamatuar sürecini indükleyen ve teşvik eden inflamatuar kaskadı çözmeye çalışıyoruz. Hastalık patogenezine katkıda bulunan yeni immün mediyatörlerin tanımlanması, epitel bariyerinin bozulması ve söz konusu immün mediyatörlere karşı terapötik antikorların onaylanması etrafında odaklanmıştır. IL-20 alt ailesi sitokinlerini, epitel farklılaşmasını ve keratinizasyonu bozan ve MAP kinaz yolağı yoluyla epitel bariyer bozukluğuna neden olan inflamatuar mediatörler olarak tanımladık.

three-dimensional-cell-culture-models-to-investigate-epithelial

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis 

Unit 1

Digestive System

SCIENTISTS IN ACTION

461 Görüntüleme.  University of Basel. Eozinofilik özofajitin patofizyolojisini araştırıyoruz ve EOE'nin kronik inflamatuar sürecini indükleyen ve teşvik eden inflamatuar kaskadı çözmeye çalışıyoruz. Hastalık patogenezine katkıda bulunan yeni immün mediyatörlerin tanımlanması, epitel bariyerinin bozulması ve söz konusu immün mediyatörlere karşı terapötik antikorların onaylanması etrafında odaklanmıştır. IL-20 alt ailesi sitokinlerini, epitel farklılaşmasını ve keratinizasyonu bozan ve MAP kinaz...

Video: Yazar Spotlight: Eozinofilik Özofajitin Patofizyolojisinin Araştırılması

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Polarize İnsan Havayolu bir sıvı kaplı Kültürünün Oluşturulması Solunum Patojenler için Host Hücre Yanıtı Okumak Epitel Calu-3 Hücreler<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Yöntemler Küçük RNA&#39;ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct a tree to show the evolutionary relationship among different taxa (classification units) at the molecular level. Phylogenetic analysis can also be used to investigate domain relationships within an individual taxon, particularly for organisms that have undergone substantial change in morphology and physiology, but for which researchers lack fossil evidence due to the organisms&#39; long evolutionary history or scarcity of fossilization.
In this text, a detailed protocol is described for using the phylogenetic method, including amino acid sequence alignment using Clustal Omega, and subsequent phylogenetic tree construction using both Maximum Likelihood (ML) of Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) and Bayesian Inference via MrBayes. To investigate the origin of eukaryotic Sugars Will Eventually be Exported Transporters (SWEET) genes, 228 SWEETs including 35 SWEET proteins from unicellular eukaryotes and 57 SemiSWEET proteins from prokaryotes were analyzed. Interestingly, SemiSWEETs were found in prokaryotes, but SWEETs were found in eukaryotes. Two phylogenetic trees constructed using theoretically distinct methods have consistently&#160;suggested that the first eukaryotic SWEET gene might stem from the fusion of a bacterial SemiSWEET gene and an archaeal SemiSWEET gene.&#160;It is worth noting that one should be cautious to draw a conclusion based only on phylogenetic analysis, although it is useful to explain the underlying relationship between different taxa, which is difficult or even impossible to discern through experimental means.

A method of constructing a phylogenetic tree based on sequence homology of SWEETs from eukaryotes and SemiSWEETs from prokaryotes is described. Phylogenetic analysis is a useful tool for explaining the evolutionary relatedness between homologous proteins or genes from different organism groups.

Ökaryotik gen kökenli araştırmaya filogenetik analizi kullanılarak

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between colorectal tumor cells and the immune system. Colorectal carcinoma is among the most common type of cancer, typically treated by surgery, chemotherapy, and radiotherapy. Advantages of radiotherapy in targeting the tumor are well known. However, even limited exposures of healthy tissues are of great concern, particularly regarding the effects on the intestinal barrier and the immune system. The adopted setup allows to study the interplay between two cell populations in a condition more similar to the physiological one, when compared to normal cell cultures. For this purpose, we resort to different techniques and we used an in vitro co-culture model, based on Caco-2 cells differentiated as a monolayer and PBMC, sharing the same culture medium. This protocol has been developed to focus on both macroscopic effects, i.e. cell viability and Trans-Epithelial Electrical Resistance (TEER), and, through western blot, molecular alterations, i.e. the activation of inflammatory pathway in immune cells and the tight junction protein expression in Caco-2 cells. Initial evaluation of radiation effects on Caco-2 cell viability was assessed via the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and Trypan blue assays, while TEER was measured at fixed time intervals through an ohmmeter specifically designed for co-culture systems. In this way, the effects due to radiation, the presence of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC), and eventually their synergistic effect, can be demonstrated. Through these complementary techniques, we observed a high radio-resistance of Caco-2 within the range of 2 - 10 Gy of X-rays and an increased Caco-2 monolayer permeability when PBMCs were added. In particular, PBMC presence was found to be associated with the variation in the tight junction scaffold proteins expression.

We present a protocol to investigate the crosstalk between X-ray-irradiated Caco-2 and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The protocol starts with Caco-2 irradiation and set-up of the co-culture with PBMC; subsequently, trans-epithelial electrical resistance is measured regularly over 48 h and western blot performed in both Caco-2 and PBMC.

X-ışını arasında çapraz karışma araştırmak için bir ortak kültür yöntemi Caco-2 hücreleri ve PBMC radyasyona maruz

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and migration. One critical limitation of such assays, however, is their homogenous assortment of cellular types. Repair is a complex process which demands the interaction of several cell types. Therefore, to study a culture devoid of cellular subtypes, is a concern that must be overcome if we are to understand the repair process. The gastric organoid model may alleviate this issue whereby the heterogeneous collection of cell types closely reflects that of the gastric epithelium or other native tissues in vivo. Demonstrated here is a novel, in vitro scratch-wound assay derived from human or mouse 3-dimensional organoids which can then be transferred to a gastric epithelial monolayer as either intact organoids or as a single cell suspension of dissociated organoids. The goal of the protocol is to establish organoid-derived gastric epithelial monolayers that can be used in a novel scratch-wound assay system to study gastric regeneration.

Here we describe a protocol for establishing and culturing human- and mouse-derived 3-dimensional (3D) gastric organoids, and the method for the transfer of 3D organoids to a 2-dimensional monolayer. The use of the gastric epithelial monolayer as a novel scratch-wound assay for regeneration studies is also described.

Fare ve insan elde edilen birincil Gastrik epitel Monolayer kültür yenilenme çalışmaları için

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Bursal bulaşıcı hastalık virüs patogenezi okumaya bir Ex Vivo tavuk birincil Bursal hücre kültürü modeli

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...