Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31371596), Bio-teknoloji araştırma merkezi, Çin üç Gorges Üniversitesi (2016KBC04) ve Jiangsu Province, Çin (BK20151424) doğal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir.

1. dizi hizalaması
<ol><li>
Ökaryotik tatlı ve ayrı belgeler prokaryotik SemiSWEET amino asit dizileri toplamak ve onları FASTA biçiminde listelenmektedir. Dizileri Ulusal Merkezi'nden biyoteknoloji bilgi (NCBI), Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı (EMBL) ve Japonya (DDBJ) veritabanları DNA veri Bankası için benzerlik arama temel yerel hizalama arama aracı (patlama) aracı ile karşıdan yükleyin.
	<ol>
<li>İki MtN3/tükürük etki (7 transmembran sarmal) Ökaryotlar ve prokaryotlar tek MtN3/tükürük etki alanı (3 transmembran sarmal) sahip 57 SemiSWEET protein sahneleri sahip 228 sözde tatlı protein sequences örnek dosyalarını toplamak 13.</li>
		<li>Basitleştirmek için tek hücreli ökaryotlarda filogenetik ağaç traversler 228 sözde tatlılar arasında 35 aday tatlı proteinler seçin. Böylece okuyucu bir gerçek veri setinde pratik olabilir bu dizilere bağlıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
35 tatlı dizileri hizalayın onları Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) giren tarafından.
	<ol>
<li>Ve protein sequences FASTA biçiminde giriş kutusuna yapıştırın veya FASTA biçiminde bir dizi dosya yükleyin. Amino asit dizini altında 'Adım 1' bölümündeki açılan menüsünde simgesini tıklatarak olduğunu belirtin.</li>
		<li>Çıkış biçimi ve diğer parametreleri 'Adım 2' bölümünde, gerekirse belirtin. Bu çalışma için "numarası w/o clustal" olarak çıktı biçimini ayarlamak ve diğer parametreler varsayılan ayarları bırakın. Çoğu durumda, varsayılan parametreleri de herhangi bir belirtme ezelî iş.</li>
	</ol>
</li>
	<li>'Adım 3' bölümünde hizalamayı çalıştırmak ve gönderin. Her yerde hizalamayı tamamlanana kadar dakika için birkaç saniye sürebilir. "Sonuç Özeti" panelinde "Hizalama" CLUSTAL biçiminde altında bağlantısını sağ tıklatın ve hizalanmış dizileri "35.clustal" (Şekil 1) kaydedin.</li>
	<li>
Hizalama sonucu dosya BioEdit içinde açın.
	<ol>
<li>BioEdit ana panelde "Sequence" ve "Ruh düzenlemek" ilk açılan menüden seçin ardından "Düzenlemek artıkları" alt menü (Şekil 2) tıklatın.</li>
		<li>Hizalama imleci (seçili sıra siyah gösterilecek) ile sol tarafındaki çıkıntılı serileri seçmek ve seçili sıraları (Şekil 3) kaldırmak için "Düzenle" menüsünün altında "Sil" simgesini tıklatın.</li>
		<li>Seçin ve ilk MtN3/tükürük etki alanı sağ tarafındaki çıkıntılı dizileri silmek ve kesilmiş ilk MtN3/tükürük etki alanı dizileri (Şekil 4) 35-I.fas kaydedin. Aynı şekilde, silmek belgili tanımlık sol ve sağ tarafta ikinci MtN3/tükürük etki alanı dizileri çıkıntılı ve 35-II.fas kaydedin. İlk ve ikinci MtN3/tükürük etki alanı dizileri ritim (http://proteinformatics.charite.de/rhythm/inndex.php?site=helix) veya TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) ile önceden tahmin edilebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dosya 35-I.fas MEGA ile açın ve "istendiğinde Hizala"'ı tıklatın. "Düzen" menüsü altında "Tümünü Seç" seçin, ardından "Sequence(s)" seçin; adları ve özellikleri dizileri siyah (Şekil 5)-ecek var olmak seçme.
	<ol>
<li>"Kopya" dizileri panoya kopyalamak için "Düzenle" menüsünden seçin ve sonra kopyalanan dizileri bir doc dosyasına yapıştırın.</li>
		<li>Doktor dosyasında tüm "#" yerine ">" ve FASTA biçimde onları dönüştürmek için ilgili olmayan tüm karakterleri silin. Eklemek "-Ben" onları ilk MtN3/tükürük etki alanı sırası olarak işaretlemek için her takson adının sonundaki. Tabi aynı yöntem ikinci MtN3/tükürük etki alanı dizi işlemek ve eklemek "-II" takson adından sonra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Doc dosya biçiminde FASTA birinci ve ikinci MtN3/tükürük etki alanı dizileri birleştirin.
	<ol>
<li>Kombine dizileri Clustal Omega yeniden yükleyin ve yukarıda açıklandığı gibi dizileri hizalayın. Sonucu "35 realigned.clustal" kaydedin.</li>
		<li>BioEdit içinde "35 realigned.clustal" dosyasını açın, düzensiz (çıkıntılı) amino asit kalıntıları hizalanmış dizileri iki ucundaki silin ve sonra dizileri "35 realigned.fas" kaydedin. "Ne zaman bazı standart olmayan karakter kaydedilemiyor uyardı Evet" i tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hesaplama filogenetik ağaç
<ol><li>
"35 realigned.fas" MEGA içinde açın.
	<ol>
<li>"Veri" menüsünü tıklatın ve "İhracat hizalama" seçin ve hizalamayı PAUP biçiminde (nexus) MrBayes (Şekil 6) daha sonra kullanmak için "35.nex" olarak kaydedin.</li>
		<li>Bu arada, MEGA ana bölmesine "Modelleri" simgesine tıklayın, "bulmak en iyi DNA/Protein modelleri (ML)" seçin ve açılan pencerede "Tamam" düğmesini tıklatın. "İşlem (Şekil 7) arama modeli başlamak için hesaplaması"'ı tıklatın. Yeni bir ilerleme panel açılır; Bu işlem dolu diziler ve bilgisayarın performansını karmaşıklığına bağlı olarak birkaç gün için birkaç dakika sürer. Not: model arama süreci tamamlandıktan sonra sonuçları açın gösteren bir tablo ( Şekil 8). En küçük BIC puan ilk olarak, yavaş yavaş artan BIC puanları ile farklı modeller bir dizi ardından listelenir. En küçük BIC puan ile ilk modeli "LG + G + F" ML ağacı "35 realigned.fas" dosyasını temel alan için önerilen yöntemdir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
MEGA ana bölmesine "Phylogeny" simgesine tıklayın, "Yapı/Test maksimum olabilirlik Tree"'ı tıklatın ve sonra açılır panelde "Evet"'i tıklatın. Farklı gösteren yeni bir pencere açılacaktır olması gereken parametreleri belirtilen (Şekil 9).
	<ol>
<li>İlk olarak, önyükleme phylogeny kutusu testinde ayarlayın; 500 ya da 1000 çoğu durumda yeterli. Oyuncu değişikliği modeli altında "amino asit" değiştirme türünü seçin. Bir ikame modeli seçme amacı onların mevcut Birleşik3dayalı dizileri arasındaki gerçek fark tahmin etmektir.</li>
		<li>Seçin "LG frekansları ile. (+F) modeli "(LG + F) modeli/yöntemi kutusunda. "Gamma dağıtılmış" (siteler arasında yanioranı varyasyonları açıklamak için G) oranları ve desen kutusuna seçin., yavaş yavaş gelişen, değişiklikleri daha fazla ağırlık veren siteleri3. "Silme işlemi tamamlamak" veri alt küme küme küme kutusunda seçin tire içeren sütunların tümünü kaldırmak için.</li>
		<li>Diğer tüm parametreleri varsayılan durumlarına (Şekil 9) içinde tutun. Bu parametrelerin tayini sonra Hesaplama başlatmak için "Hesaplama" simgesini tıklatın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. sunum filogenetik ağaç
Not: MEGA kullanarak hesaplama tamamlandığında bir filogenetik ML ağaç sunulacak (Şekil 10).
<ol><li>"Dosya" simgesi ağaç panelindeki aşağı açılır menüsünün altında "Kaydetmek geçerli oturum"-sonucunu kaydetmek için seçin (.mas olan varsayılan dosya türü). Bu da çalışmanın, sonuç "35.mas" kaydedildi. Ağaç panelde clade, uzunluğu dahil olmak üzere birçok parametreleri ağaç, ağaç topolojisi, takson adı, boyutu ve rengi, yazı tipi görüntülenir ve farklı seçenekleri ayarlayabilirsiniz.</li>
	<li>Görüntü simgesini tıklatarak son ağaç dosyayı kaydedin ve rakam farklı biçimlerde kaydedebilir veya fotoğraf düzenleme için kaynak olarak görüntüyü kopyalayın.</li>
</ol>4. analiz tatlılar ve dizi hizalaması kullanarak SemiSWEETs ilişkisi
Not: Bu adımı sıradan dizi analizi gerekmeyebilir.
<ol><li>228 ökaryotik tatlılar ve Clustal yukarıda açıklandığı gibi Omega 57 prokaryotik SemiSWEETs hizalayın. Hizalama sonuçları Clustal Omega entegre ve bir fotoğraf editörü (Şekil 11) kaydetmek için kopyalanan Jalview gösterilebilir. Not: SemiSWEETs Methanobacteria (Arkeler) gelen tatlı dizileri ikinci MtN3/tükürük etki ile uyumlu, ancak örnek uyum içinde bazı SemiSWEETs α-bakteri gelen tatlı sıraları, ilk MtN3/tükürük etki ile hizalanır.</li>
</ol>5. filogenetik ağaç inşaat MrBayes ile
<ol><li>Bayesian çıkarımlar MrBayes ile MrBayes yürütülebilir dosyasını açın ve DOS arayüzey-ecek gelmek yukarıya içinde a yeni pencere. İlk adım nexus veri ﬁle okumaktır. Giriş "yürütmek 35.nex" sonra istemi (35. nex dosya MrBayes yürütülebilir dosyanın aynı dizine kaydedin veya karşıya yüklemeden önce dosyanın yolu gelin unutmayın). "Başarılı okuma matrix" ileti son listelenen özellikleri (Şekil 12) aşağıdaki gösterilir. 35. nex dosya zaten hazırlanan ve MEGA içinde kaydedilen (2.1 Yukarıdaki bakın).</li>
	<li>
Evrimsel modeli ayarlayın.
	<ol>
<li>Sonra-e sevketmek, tip "prset aamodelpr = fixed(lg); LSet gore g = ". "Lg" ve "g" MEGA içinde ayarla "LG" ve "G" modeline karşılık gelir. Model başarıyla ayarladıktan sonra yazın "mcmc nchains = 4 ngen 5.000.000 =" istemi sonra. Kullanımı "nchains = 4" Giriş bir soğuk zincir ve Metropolis kaplin için üç sıcak zincirler toplam sayısını belirtir. "ngen 5.000.000 =" Metropolis kaplin 5.000.000 nesiller sıcak ve soğuk zincir ve yakınsama için çalıştırmak anlamına gelir. Bu çalışmada, ortalama standart sapması 0,01 altındaki split frekansları sıcak ve soğuk zincir yakınsama kabul edildi.</li>
		<li>Ngen numarasını doğru işleminin başında öngörülen edemiyor ve genellikle ayarlanması gereken Not ortalama standart sapma split frekans değişikliği temel. Buna ek olarak, yakınsama için ngen numarası ne zaman program çalıştıran aynı verilere göre her zaman farklı olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analizler: Bu adımı verilerin karmaşıklığı ve bilgisayarın performansını bağlı olarak birkaç gün için birkaç dakika sürer. Hazır ayar hesaplama tamamladıktan sonra bir istemi "analizi ile (Evet/Hayır) devam edilsin mi?" soracaktır "Hayır" sonra istemi yazdıysanız, bilgi işlem (Şekil 13), keser misin yoksa bu daha fazla nesil sayısı girdikten sonra hesaplamak devam edecektir. Hesaplama tamamlandığında (split frekansların bir ortalama standart sapma ile < 0,01 veya 0,05), hesaplama sorgulama istemi sonra "Hayır" yazarak durdurun. Not: 0,01 sıkı bir kriterdir, 0,05 orta ve genellikle yeterli.</li>
	<li>
Örneklerin özetleme: "Karter" modeli Parametreler (Şekil 14) örnekleri özetlemek için istemi sonra yazın. Sonra yazın "sumt relburnin Evet burninfrac = 0.25 =" ağaç örnekleri özetlemek ister sonra. Filogenetik ağaç İnşaat hakkında detaylı bilgi-ecek var olmak göstermek Şekil 15ASC II kod ekran, bir gösteren clade itibarını ve diğer gösteren dal uzunlukları görünür iki ağaç rakamlar ardından, olduğu gibi. Aynı zamanda, "35.nex.con" adlı bir ağaç dosya otomatik olarak kaydedilir.</li>
	<li>Daha iyi bir sunum filogenetik ağaç için FigTree Aracı (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) ile "35.nex.con" ağaç dosyasını açın, bir stil veya sonucu (Şekil 16) görüntülemek için boyut seçin veya bile bunu yapmak için bir fotoğraf Düzenleyicisi'nde düzenleyin daha fazla okuyucu dostu.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nei, M., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Evolution and Phylogenetics. , (2000).</li><li>Foth, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+to+uncover+organellar+origins+of+nuclear-encoded+genes.">Phylogenetic analysis to uncover organellar origins of nuclear-encoded genes.</a> Methods Mol Biol. 390, 467-488 (2007).</li><li>Baldauf, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+for+the+faint+of+heart:+a+tutorial.">Phylogeny for the faint of heart: a tutorial.</a> Trends Genet. 19, 345-351 (2003).</li><li>Feng, D. F., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+sequence+alignment+as+a+prerequisite+to+correct+phylogenetic+trees.">Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees.</a> J Mol Evol. 25, 351-360 (1987).</li><li>Persson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+in+protein+analysis.">Bioinformatics in protein analysis.</a> EXS. 88, 215-231 (2000).</li><li>Sievers, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+scalable+generation+of+high-quality+protein+multiple+sequence+alignments+using+Clustal+Omega.">Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.</a> Mol Syst Biol. 7, 539 (2011).</li><li>Sievers, F., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustal+omega.">Clustal omega.</a> Curr Protoc Bioinformatics. 48, 1-16 (2014).</li><li>Yang, Z., Rannala, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phylogenetics:+principles+and+practice.">Molecular phylogenetics: principles and practice.</a> Nat Rev Genet. 13, 303-314 (2012).</li><li>Hall, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+accuracies+of+several+phylogenetic+methods+using+protein+and+DNA+sequences.">Comparison of the accuracies of several phylogenetic methods using protein and DNA sequences.</a> Mol Biol Evol. 22, 792-802 (2005).</li><li>Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEGA6:+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+version+6.0.">MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0.</a> Mol Biol Evol. 30, 2725-2729 (2013).</li><li>Ronquist, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MrBayes+3.2:+efficient+Bayesian+phylogenetic+inference+and+model+choice+across+a+large+model+space.">MrBayes 3.2: efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space.</a> Syst Biol. 61, 539-542 (2012).</li><li>Chen, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+transporters+for+intercellular+exchange+and+nutrition+of+pathogens.">Sugar transporters for intercellular exchange and nutrition of pathogens.</a> Nature. 468, 527-532 (2010).</li><li>Xuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+oligomerization+for+bacterial+and+plant+SWEET+sugar+transporter+family.">Functional role of oligomerization for bacterial and plant SWEET sugar transporter family.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 3685-3694 (2013).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+evidence+for+a+fusion+of+archaeal+and+bacterial+SemiSWEETs+to+form+eukaryotic+SWEETs+and+identification+of+SWEET+hexose+transporters+in+the+amphibian+chytrid+pathogen+Batrachochytrium+dendrobatidis.">Phylogenetic evidence for a fusion of archaeal and bacterial SemiSWEETs to form eukaryotic SWEETs and identification of SWEET hexose transporters in the amphibian chytrid pathogen Batrachochytrium dendrobatidis.</a> FASEB J. 30, 3644-3654 (2016).</li><li>Holder, M. T., Zwickl, D. J., Dessimoz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+robustness+of+phylogenetic+methods+to+among-site+variability+in+substitution+processes.">Evaluating the robustness of phylogenetic methods to among-site variability in substitution processes.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363, 4013-4021 (2008).</li><li>Alfaro, M. E., Holder, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Posterior+and+the+Prior+in+Bayesian+Phylogenetics.">The Posterior and the Prior in Bayesian Phylogenetics.</a> Annu Rev Ecol Evol Syst. 37, 19-42 (2006).</li><li>Suchard, M., Rambaut, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Many-core+algorithms+for+statistical+phylogenetics.">Many-core algorithms for statistical phylogenetics.</a> Bioinformatics. 25, 1370-1376 (2009).</li><li>Zierke, S., Bakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FPGA+acceleration+of+the+phylogenetic+likelihood+function+for+Bayesian+MCMC+inference+methods.">FPGA acceleration of the phylogenetic likelihood function for Bayesian MCMC inference methods.</a> BMC Bioinformatics. 11, 184 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biyolojik araştırmalarda nükleotit veya amino asit dizileri8temel bir filogenetik ağaç yapmak için giderek daha popüler hale geliyor. Genel olarak, dizi hizalaması, hizalanmış diziler için uygun yöntem veya algoritma ile değerlendirilmesi ve filogenetik ağaç olarak hesaplama sonucunun görselleştirme dahil olmak üzere uygulama üç kritik aşama vardır. Sunulan çalışmada, dizi hizalaması üç tur yapılmıştır: ilk olarak, birinci ve ikinci MtN3/tükürük etki de dahil olm...

DNA veya RNA dizilerinin fizyolojik ve biyokimyasal yöntemlerle analiz veya morfolojik ve fosil kanıtları gözlenen temel fenotipleri için genetik bilgi taşırlar. Bir anlamda, genetik bilgi daha eski ikinci temeli olduğu için dış fenotipleri değerlendirmek daha güvenilirdir. Evrimsel çalışmada, Fosil kanıtlar çok doğrudan ve ikna edici. Ancak, mikroorganizmalar gibi birçok organizmalar bir fosil uzun jeolojik çağ boyunca forma şansı var. Bu nedenle, nükleotit dizileri ve amino asit dizileri üzerinden ilgili kaybolmamış organizmalar gibi moleküler bilgiyi evrimsel ilişkiler1keşfetmek için değer vardır. Bu da çalışmanın, basit bir giriş temel filogenetik bilgi ve bir öğrenmek kolay iletişim kuralı bir filogenetik ağaç kendi oluşturmak için ihtiyacı olan yeni gelenler için sağlandı.
DNA (nükleotit) ve protein (amino asit) diziler arasında homolog genler, organelleri veya bile organizmalar2filogenetik ilişkiler anlaması için kullanılabilir. DNA dizileri evrimi sırasında değişikliklerden etkilenen olasılığı daha yüksektir. Buna ek olarak, eş anlamlı nükleotit dizileri mutasyonların amino asit serilerinde mutasyonlar neden değil verilen bu amino asit dizileri çok daha stabildir. Sonuç olarak, amino asit dizileri uzaktan ilgili organizmalar3homolog genler için uygun ise DNA dizileri yakından ilgili organizmalar, homolog genler karşılaştırılması için yararlı olur.
Filogenetik analiz amino asit hizalama ile başlar veya veritabanı5 sıralama bir ek açıklama eklenen genom alındı nükleotit dizileri4 listelenen FASTA formatı, yani, sözde veya ifade protein içinde dizileri, RNA dizileri , veya DNA dizileri. Bu yüksek kaliteli dizileri analizi için toplamak için önemlidir ve sadece homolog dizileri filogenetik ilişkileri analiz etmek için kullanılabilir fazlalaştı. Birçok farklı platformlarda Clustal W, Clustal X, kas gibi T-kahve, MAFFT, dizi hizalaması için kullanılabilir. En çok kullanılan online kullanılabilir veya ücretsiz indirilebilir Clustal Omega6,7 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), olduğunu'dir. Hizalama aracı Kullanıcı hizalama başlatmadan önce ayarlayabilirsiniz, ancak varsayılan parametreleri de çoğu zaman işe fazla parametre var. İşlem tamamlandıktan sonra sonraki adım için doğru biçimde hizalanmış dizileri kaydedilmesi gerekir. Onlar o zaman düzenlenmesi gerekir veya BioEdit gibi bir düzenleme yazılımı kullanarak filogenetik ağaç inşaat MEGA tarafından (amino asit kısaltmalar ve kısa çizgileri dahil. eşit uzunluğu olmak dizileri gerektirdiğinden kesilmiş Hizalanmış sırayla amino asit veya nükleotid olmayan herhangi bir pozisyon bir kısa çizgiyle temsil edilir "-"). Genel olarak, tüm çıkıntılı amino asitler veya nükleotid hizalama iki ucundaki kaldırılması gerekir. Buna ek olarak, çünkü onlar küçük değerli bilgileri iletmek ve bazen kafa karıştırıcı veya yanlış bilgi3verebilir kötü hizalanmış hizalama serilerinde içeren sütunlar silinebilir. Bir veya daha fazla tire içeren sütunlar şu anda veya daha sonra ağaç inşaat aşamasında silinebilir. Alternatif olarak, onlar-ebilmek var kullanılmış filogenetik hesaplama için. Dizi hizalaması ve düzeltme bittiğinde hizalanmış dizileri FASTA formatı veya daha sonra kullanmak istediğiniz biçimde kaydedilmesi gerekir.
Birçok yazılım platformları farklı yöntemler veya algoritmalar kullanarak ağaç inşaat işlevleri sağlar. Genel olarak, Yöntemler mesafe matris yöntemleri veya ayrı veri yöntemleri olarak sınıflandırılabilir. Mesafe matris ayrı veri yöntemleri karmaşık ve zaman alıcı iken hesaplamak için hızlı ve basit yöntemlerdir. Amino asit veya nükleotid sırası kimliği, bir mesafe matris yöntemi paylaşım yüksek derecesi ile çok yakından ilişkili özellikleri için (komşu katılma: NJ; Aritmetik ortalama ile unweighted çifti grubu yöntemi: UPGMA) uygundur; Uzaktan ilgili takson, ayrı veri yöntemi için (maksimum olabilirlik: ML; Maksimum cimrilik: MP; Bayesian çıkarımı) en iyi3,8' dir. Bu çalışmada, MEGA (6.0.6) ve Bayesian kesmesi (MrBayes 3.2) ML yöntemlerde filogenetik ağaç9oluşturmak için uygulandı. İdeal olarak, uygun model ve parametreler kullanıldığında, farklı yöntemler elde edilen sonuçları tutarlı olabilir ve böylece daha güvenilir ve inandırıcı.
MEGA10kullanılarak inşa bir ML filogenetik ağaç için FASTA formatı hizalanmış sıra dosyasında programa yüklenmiş olması gerekir. İlk adım, karşıya yüklenen veriler için en iyi oyuncu değişikliği modeli seçmektir. Tüm kullanılabilir ikame modelleri karşıya yüklenen dizileri dayalı karşılaştırılır ve son puanları sonuçları tabloda gösterilecek. (İlk tabloda listelenen) en küçük Bayesian bilgileri ölçüt (BIC) puan ile modeli seçin, önerilen modele göre ML parametrelerini ayarlamak ve hesaplama başlatmak. Hesaplama zaman yüklenen verileri (uzunluk dizileri ve takson sayısı) karmaşıklığı ve programların çalıştığı bilgisayarın performansını bağlı olarak birkaç gün için birkaç dakika değişir. Hesaplama tamamlandığında, bir filogenetik ağaç yeni bir pencerede gösterilecek. "FileName.mat" kaydedin. Ağaç görünümünü belirtmek için parametreleri ayarladıktan sonra bir kez daha kaydedin. Bu yöntemi kullanarak, MEGA yayın notu filogenetik ağaç şekiller oluşturabilirsiniz.
MrBayes11ile ağaç yapımı için genellikle FASTA biçiminde listeleniyorsa, hizalanmış sıra nexus biçimi (.nex dosya türü olarak) dönüştürmek için ilk adımdır. FASTA dosyaları nexus biçime dönüştürme MEGA işlenebilir. Ardından, nexus biçimi hizalanmış sırayla MrBayes yüklenebilir. Dosya başarıyla karşıya yüklendiğinde, ağaç hesaplama detaylı parametrelerini belirtin. Bu parametreler amino asit ikame modeli, değişim oranları, Markov zinciri Monte Carlo (MCMC) için zincir numarası gibi ayrıntıları kaplin, ngen numarası dahil, standart sapma split frekansların ortalama ve benzeri. Bu parametreleri belirttikten sonra Hesaplama başlatmak. Sonunda, ASC II kodu, bir gösteren clade güvenilirlik ve diğer gösteren dal uzunlukları, iki ağaç resimler ekranda görüntülenir.
Ağaç sonuç otomatik olarak "FileName.nex.con" olarak kaydedilir. Bu ağaç dosya açıldı ve FigTree tarafından düzenlenmiş ve FigTree içinde görüntülenen resim daha fazla yayın için daha uygun yapmak için değiştirilebilir.
Bu çalışmada, örnek olarak tek hücreli ökaryotlarda 35 tatlılar ve prokaryot, gelen 57 SemiSWEETs de dahil olmak üzere 228 tatlı proteinleri analiz edildi. Tatlılar ve SemiSWEETs glikoz, fruktoz veya sukroz taşıyıcılar membranlar12,13arasında karakterize. Filogenetik analiz tatlılar içeren iki MtN3/tükürük etki alanları bir bakteriyel SemiSWEET ve bir archaeon14evrimsel bir füzyon elde göstermektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1132px;" width="1130">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:127px;">Adobe Illustration</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a graphical tool developed by Adobe Systems Software Ireland Ltd. Copyright &#169; 2017</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:127px;">BioEdit</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a biological sequence alignment editor written for Windows 95/98/NT/2000/XP/7. Copyright &#169; Tom Hall</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:127px;">Clustal Omega</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a package for making multiple sequence alignments of amino acid or nucleotide sequences.&#160; http://www.clustal.org/</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:127px;">CorelDRAW</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a graphic design software. Copyright &#169; 2017 Corel Corporation</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:127px;">FigTree</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a graphical viewer of phylogenetic trees designed by the University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:127px;">MEGA</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">MolecularEvolutionary Genetics Analysis version6.0 http://www.megasoftware.net/home</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:127px;">MrBayes</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">an Bayesian phylogenetic inference tool</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:127px;">NVIDIA</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a company designs graphics processing units (GPUs) for the gaming and professional markets. Corporation Copyright &#169; 2017</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:127px;">PAUP</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">Phylogenetic Analysis Using Parsimony. David Swofford&#39;s program implements the maximum likelihood method under a number of nucleotide models.</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:127px;">Photoshop</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a raster graphics editor developed and published by Adobe Systems Software Ireland Ltd. Copyright &#169; 2017</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:127px;">RHYTHM</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a knowledge based prediction of hekix contacts. Charit&#233; Berlin &#8211; Protein Formatics Group - Copyright 2007-2009</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:127px;">TMHMM</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">a tool for prediction of transmembrane helices in proteins. http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:127px;">Compter</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:752px;">4GB memory, Core 2 or above CPU. Windows 7, Windows 10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using phylogenetic analysis to investigate eukaryotic gene origin

Filogenetik analiz nükleotit veya amino asit dizileri veya etki alanı dizileri ve üç boyutlu yapısı, gibi diğer parametreleri farklı özellikleri (sınıflandırma birimleri) arasında evrimsel ilişkiyi moleküler göstermek için bir ağaç oluşturmak için kullanılır düzeyi. Filogenetik analizi de kullanılabilir etki alanı ilişkileri içinde bireysel bir takson araştırmak için özellikle önemli uğramıştır organizmalar Morfoloji ve fizyoloji, ama hangi araştırmacılar nedeniyle fosil kanıt eksikliği için değiştirmek için organizmaların uzun evrimsel geçmişi veya fosilleşmenin kıtlığı.
Bu metinde, amino asit dizi hizalaması Clustal Omega ve maksimum her iki olasılık (ML) moleküler evrim genetik kullanarak sonraki filogenetik ağaç İnşaat kullanma da dahil olmak üzere filogenetik yöntemini kullanarak için detaylı bir protokol anlatılan Analiz (MEGA) ve MrBayes ile çıkarsama Bayesian. Ökaryotik Şekerler olacak taşıyıcılar ihraç olmak sonunda (tatlı) genleri kökenini araştırmak için 228 tatlılar tek hücreli ökaryotlarda üzerinden 35 tatlı proteinler ve prokaryotlar gelen 57 SemiSWEET proteinler gibi analiz edildi. İlginçtir, SemiSWEETs prokaryotlarda bulundu ancak tatlılar ökaryotlarda bulunamadı. Teorik olarak farklı yöntem kullanılarak inşa iki filogenetik ağaç sürekli olarak ilk ökaryotik tatlı gene bir bakteriyel SemiSWEET gen ve arke SemiSWEET gen füzyonu kaynaklanıyor tavsiye ettiler. Bunu zor ya da hatta deneysel yollarla ayırt etmek imkansız farklı özellikleri arasındaki temel ilişkiyi açıklamak yararlı olmasına rağmen sadece filogenetik analizi, dayalı bir sonuç çıkarmak için dikkatli olmalısınız fazlalaştı .

Filogenetik ağaç tüm ilk MtN3/tükürük etki 35 tatlı sıralarının bir clade ve ikinci MtN3/tükürük alan adları başka bir clade kümelenmiş tatlı sıralarının olarak kümelenmiş göster. SemiSWEETs Methanobacteria (Arkeler) üzerinden ikinci MtN3/tükürük ile uyumlu, ancak buna ek olarak, Hizalama sonuçlarını tatlılar ve SemiSWEETs bazı SemiSWEETs α-bakteri gelen tatlı sıraları, ilk MtN3/tükürük etki ile uyumlu göstermek TATLI sıralarının etki alanı. Bu...

Watch this Scientific Journal Video about Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin at JoVE.com

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Tatlılar prokaryot üzerinden sıra Homoloji Ökaryotlar ve SemiSWEETs dayalı bir filogenetik ağaç oluşturma yöntemi açıklanmıştır. Filogenetik analiz homolog proteinler veya genler arasındaki evrimsel ilişkisi farklı organizma gruplarından açıklamak için yararlı bir araçtır.

Ökaryotik gen kökenli araştırmaya filogenetik analizi kullanılarak

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

using-phylogenetic-analysis-to-investigate-eukaryotic-gene-origin

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Immunology and Infection

Unit 2

Genomes and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

15.7K Görüntüleme.  China Three Gorges University. Tatlılar prokaryot üzerinden sıra Homoloji Ökaryotlar ve SemiSWEETs dayalı bir filogenetik ağaç oluşturma yöntemi açıklanmıştır. Filogenetik analiz homolog proteinler veya genler arasındaki evrimsel ilişkisi farklı organizma gruplarından açıklamak için yararlı bir araçtır.

Video: Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

Böcek<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Bakteriyel Patogenez İnceleyecek Güçlü Enfeksiyon Model olarak

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Bakteriyel Patojen Hücresel Enfeksiyon Soruşturma inlc salgılanmasına Görüntüleme<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Floresan Proteinleri kullanarak Afrika tripanosom içinde Glycosome Dynamics Monitör

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

Fırsatçı mantar patojenlere bir Floresan etiketli geninin biyolistik transformasyonu<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Isolation of Murine Peritoneal Macrophages to Carry Out Gene Expression Analysis Upon Toll-like Receptors Stimulation

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. Macrophages express surface Toll-like receptors (TLRs), which recognize molecular patterns conserved through evolution in a wide range of microorganisms. TLRs play a central role in macrophage activation which is usually associated with gene expression alteration. Macrophages are critical in many diseases and have emerged as attractive targets for therapy. In the following protocol, we describe a procedure to isolate murine peritoneal macrophages using Brewer&#8217;s thioglycollate medium. The latter will boost monocyte migration into the peritoneum, accordingly this will raise macrophage yield by 10-fold. Several studies have been carried out using bone marrow, spleen or peritoneal derived macrophages. However, peritoneal macrophages were shown to be more mature upon isolation and are more stable in their functionality and phenotype. Thus, macrophages isolated from murine peritoneal cavity present an important cell population that can serve in different immunological and metabolic studies. Once isolated, macrophages were stimulated with different TLR ligands and consequently&#160;gene expression was evaluated.

We describe here a simple protocol to isolate murine peritoneal macrophages. This procedure is followed by RNA extraction to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.

Fare Periton Makrofagların izolasyonu Toll-benzeri reseptörler Uyarım üzerine Gen İfadesi Analizi Yapacak

During infection and inflammation, circulating monocytes leave the bloodstream and migrate into tissues, where they differentiate into macrophages. ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Grip Hemagglutinin özel antikorlar tarafından indüklenen Fc-aracılı efektör fonksiyonları değerlendirmek için bir yöntem

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...