Biz bu sunum hazırlama, yardım ettikleri için Evans laboratuvar üyeleri teşekkür ediyorum. Burada kullanılan morpholinos başlangıçta Dr. Audrey Holtzinger tarafından onaylandı. TE, Ulusal Sağlık Enstitüleri (HL064282 ve HL056182) hibe tarafından desteklenmektedir. Weill Cornell Medical College Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Enstitüsü tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Buradaki amacımız, kardiyomiyosit atalarıdır belirtimi için iki transkripsiyon faktörleri fonksiyonel fazlalık test etmektir. Faktörlerin birbiriyle ilişkili iki gata5 ve gata6 genler tarafından kodlanan ve onların göreceli fonksiyonları 1 anlamak için zebrafish bir model kullanılarak . Bizim stratejimiz, gen fonksiyonu morpholinos 2 kullanarak engellemek için . Biz morpholinos bir ya da diğer gen döllenmiş yumurta içine enjekte ve embriyonik fenotip hem morpholinos ile eş zamanlı olarak enjekte yumurta elde edilen embriyolar ile karşılaştırmak. Fenotipleri değerlendirilmesi basitleştirmek için, biz kardiyomiyositlerde GFP ifade transgen taşıyan balıktan elde edilen yumurta kullanın. 1. Adım. Mikroenjeksiyon için hazırlanması. A) ayarlama balık üreyen Enjeksiyonu önce akşam, tek tek erkek ve kadın yetişkin balık (yaş 3-18 ay) çift ertesi sabaha kadar bölme ile ayrılmış damızlık tanklarının içine yerleştirilir. Biz genellikle 10-20 çift balık kurdu, ve ne olursa olsun, yumurta mı, resmi olarak bu fekondite korumak için haftada bir kez evlendirilen vardır. Ayırt kardiyomiyositlerde tanımlamak için basit bir okuma sağladığından, egfp: Bu deneme için cmlc2 için, transgenik bir muhabir gerginlik kullanıyorsunuz. Ertesi sabah, bir kez ışıklar, su getirilir ve bölücüler tankları, balık çiftleri yumurta arkadaşı ve üretmek için izin çekti. Yumurta üretimi izlenecek ve hemen başlatabilir, ya da balık bağlı olarak, bir saat ya da daha fazla bir süre sonra. Tipik olarak, yaklaşık 20 dakika kesintisiz çiftleşme sonra, yumurta, bir pipet veya süzgeç kullanarak toplanmış ve sistem su içeren 100 mm Petri kutularına dökülür. Embriyolar 1-4 hücreli aşamasında arasında enjekte edilir sağlamak için yumurta üretim izlemek için önemlidir. Bir seferde birkaç çifti serbest bırakarak, yumurta üretimi sersemleme ve böylece erken bir gelişim aşamasında enjekte edilebilir yumurta miktarı maksimize etmek mümkündür. Iyi bir çift balık 200&#39;den fazla embriyolar üretmek, ve 4 hücreli aşama ötesine gelişmeden önce tek bir araştırmacı, onları yeterince hızlı enjekte etmek mümkün olmaz çünkü, aynı anda binlerce yumurta toplamak için pratik mantıklı . Balık ışık döngüsü üremek için uyarılırlar, bu nedenle bu bir erken başlamak gerekir, ve yumurta genellikle öğleden sonra elde edilmemiş bir deney. B) iğneler hazırlanması <ol><li> Aşağıdaki koşul kullanarak iki iğne oluşturmak için bir Mikropipet Çektirme ve 3.5 &quot;cam kapiller tüp kullanın: Isı = 626, = 60, Hız = 60, ve Zaman = 250 çekin Biz açık bir filament içermeyen çekirdek iğneler kullanmayın, çünkü. Emme ile ön doldurun. </li><li> Her iğne ucu yavaşça temiz bir jilet veya forseps kullanılarak kırık, ve daha sonra EG-4 mikro-taşlama kullanarak yaklaşık 20 saniye boyunca 30 derece açılı bir eğimli. Bu ucu keskinleştirir ve koryon yoluyla enjekte önemlidir. </li><li> Tutarlı bir iğne çapı yaklaşık 15 mikron ucu boyutu (1-2 nl enjeksiyon hacmi kalibre etmek mümkün ızgara mikroskop mercek kullanarak 4 adet olarak kalibre) elde etmek için önemlidir. </li><li> İğneler, önceden hazırlanmış, güvenli bir yerde güvenli bir şekilde saklanır ve her biri ayrı ayrı tutarlı enjeksiyon hacmi (Ayrıntılar için bölüm D&#39;ye bakınız) sağlamak için enjeksiyonlar başlamadan hemen önce kalibre edilmelidir. Eğer şanslı iseniz, bütün bir deney için tek bir iğne kullanmak mümkün olabilir. Ancak, bir iğne, bir denemenin ortasında kolayca kırılmasına neden olabilir ve o zaman yeni bir iğne çekmek için kullanmak istemiyorum. </li></ol> C) enjeksiyonu plakaları yapma <ol><li> Mikrodalga fırında kaynatarak, 100 ml sistem su içinde% 2 agaroz çözüm hazırlayın. </li><li> Dokunmak serin ve yaklaşık 12ml 100mm bir Petri kabı ters kapağının içine dökün. </li><li> Kapağın her iki tarafın içine, yaklaşık 45 derecelik bir açıda eğik 2 mikroskop slaytlar, yerleştirin. Agaroz katılaşmış sonra, yavaşça kapağı uzak iki slayt çekin. </li><li> Bu embriyoların yerleştiği ve daha sonra enjekte edilecektir olukları oluşturur. Çoklu plakaları önceden hazırlanmış olabilir. % 70 etanol bir katman daha ekleyerek sonra 4 ° C&#39;de orijinal plaka alt ekleyerek ve parafilm mühürleme süresiz olarak saklanabilir. Kullanmadan önce iyice yıkamayı unutmayın. </li></ol> D) Mikroenjeksiyon istasyonu ve iğne kalibrasyon <ol><li> Sıkıştırılmış azot kaynağı ve PLI-100 mikroenjektör açın. Enjektör 18 PSI sabit bir akış basınç için ayarlanabilir olmalıdır. </li><li> Bir iğne takmadan önce, mikromanipülatör geniş bir hareket yelpazesi sağlamak için uygun bir pozisyonda olduğunu temin ve eklenen bir iğne tablo grev olmayacak. Birini takıniğneler sıkı bir mühür olduğundan emin mikromanipülatör içine önceden hazırlanmış (C bölümü). Iğne kırmak için değil dikkatli olun. </li><li> Kalibrasyon geçmeden önce tıkalı değildir emin olmak için mikroskop altında iğne ucu dikkat edin. </li><li> Enjeksiyon çözüm veya GKD 2 O bir damla (2-3 ul) parafilm küçük bir parçasının üzerine koyun ve dolgu düğmesini kullanarak iğne içine çekerek yaklaşık 1,5 ul doldurmak. Eğer iğne ucu tam çözüm var ve herhangi bir hava kabarcığı çizmekten kaçınmak için mikroskop aracılığıyla sıvı emme gözlemlemek emin olun. </li><li> Mineral yağ bir damla bir mikrometre ızgara üzerine yerleştirin. </li><li> Damla boyutu, çapı yaklaşık 1.5 mikron olduğundan emin olmak için enjeksiyon zaman ampirik olarak ayarlayın. Bu ~ 1,8 nl bir enjeksiyon hacmi sunacak. Gerçek ses seçimi için ayarlanmış, ancak pratik bir anlamda doğru 1 nl altında hacimleri kalibre etmek zordur ve embriyoların 2 nl yukarıda birimleri tahammül olmayabilir. Birim boyutu ne olursa olsun kontrolleri dahil olmak üzere tüm enjeksiyonlar için aynı tutmak, seçmek ve enjekte morfolino miktarı titre çözüm konsantrasyonları (enjeksiyon hacmi oldukça fazla) ayarlamak. </li><li> Iğne ucu boyutları değişecektir yeniden kalibre edilmesi, bir iğne değiştirilir her zaman gereklidir. </li></ol> 2. Adım. Iki farklı genleri hedefleyen morpholinos onaylanması Morpholinos hedef çeviri başlanması ve böylece protein sentezi ya da uygun mRNA işleme engelleyen bir hedef mRNA sitesi veya ek siteler için tasarlanmıştır. Belirli bir demonte gösteren, aynı fenotip oluşturmak, ilk kez bir gen analiz ederken, biz test etmek için her iki tip morpholinos kullanabilirsiniz. Splice-bloker bir avantajı hedef gen için antikorlar mevcut değilse, özellikle yararlıdır RT-PCR, normal transkript demonte doğrulayabilirsiniz. Gata6 5;: &#39;; 5&#39;-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3 gata5 Splice Site MO dizisi&#39; 5&#39;-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3: Biz tutarlı bir kardiyak fenotipi morpholinos (gata5 5&#39;UTR MO dizisi kullanarak gata5 ve gata6 genlerin nasıl elde edilir gız &#39;UTR MO sırası: 5&#39;-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3&#39;). <ol><li> Morpholinos Gene Araçlar, LLC (Philomath OR) elde edilir. Gen Araçları ve destek personeli sorarsanız, o hedef için en iyi dizisi seçmenize yardımcı olacaktır. Sadece onlara üyelik numarasını göndermek için, ve onlar bildirecektir gerekir. Ancak, faaliyet doğrulamak için hazırlıklı olmalıyız neden morfolino çalışacağına dair bir garanti yoktur,. Ayrıca morfolino OpenBiosystems kullanılabilir olup olmadığını kontrol edebilirsiniz. Gene Araçları OpenBiosystems sentezlenmiş morpholinos stokları sağlar. Tekrar işe yarayacak hiçbir garanti olsa da, bu test etmek için yeni hedefler karşılamak maliyetlerini düşürmeye yardımcı olabilir, düşük bir maliyetle daha küçük miktarlarda satmak. Transcriptome karşı morfolino BLAST emin olun; UCSC zebrafish genom tarayıcı (genome.ucsc.edu) Blat özelliğini kullanabilirsiniz. Tabii ki, bir morfolino edebiyat (titizlikle) onaylanmıştır varsa, aynı sırayla satın almalarını tavsiye edilir. </li><li> Morfolino steril GKD 2 0 1 mM nihai konsantrasyonu çözülür ve oda sıcaklığında saklanır. Düşük sıcaklıklarda bazen agrega ve çökelmesine neden olabilir bazı nedenlerden dolayı, morfolino çözümleri FREEZE VERMEYİN. Morpholinos, proteazlar veya nükleazlar duyarsız sürece eklediğiniz su steril olarak, oda sıcaklığında oldukça güvenli olmalıdır. </li><li> Enjekte önce, 65 morfolino inkübe ° C sağlamak için 5 dakika tamamen çözünmüş ve oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Buz üzerinde örnek KOYMAYIN. Morfolino enjeksiyon kadar oda sıcaklığında tutun. </li><li> Morfolino titre için, biz genellikle, 1 mM çalışma konsantrasyonlarda verim 2 0 GKD stok konsantrasyonu 0.5 mM, 0.25 mM ve 0.125mM seri dilüsyonları hazırlar. Enjeksiyon hacmi 1.8 nl kullanarak, sıra bağlı olarak, bu yaklaşık 20ng, 10ng, 5NG, enjeksiyon başına morfolino 2.5ng temsil eder. Bu hoşgörü ve etkinliği her morfolino değişecektir bu yana, sadece bir başlangıç ​​noktasıdır ve tahmin edilemez. En morpholinos çok 20 ng yukarıda tolere edilebilir, ancak bazı 1 ng çok altında dozlarda etkili olabilir. Bizim yaklaşımımız, bir fenotip &quot;yaylalar&quot; konsantrasyonunu tanımlamak için. Diğer bir deyişle, tanımlanmış bir fenotip 2.5 ng kullanarak, ancak 5 ng veya üzerinde herhangi bir miktarda kullanarak benzer ise, bir eşik miktar olarak 5 ng seçsin. Tabii ki, bu &quot;sınır&quot; hakkı yerine daha tekrarlanabilir eşik ötesine çalıştığından emin olmak için, 2.5 ng ve 5.0 ng arasında gelecek titre yararlı olabilir. </li><li> Ekli ve kalibre edilmiş bir iğne doldurun(Bkz. yukarıda) en düşük çalışma konsantrasyonu (en seyreltik) morfolino çözüm. Sadece atık malzeme olarak kaçının, iğne aşırı doldurma. Ul sadece 1 doldurursanız, 500 enjeksiyon için yeterli bir çözüm yoktur. </li><li> Bir pipet kullanarak, mikroenjeksiyon plaka olukları döllenmiş tek hücreli embriyo transferi. Embriyoların enjeksiyon olukları altına düştüğü sağlamak için aşırı su çıkarın. Onlar float değil, agaroz yatağa bağlı olmamalıdır. </li><li> Mikromanipülatör koryon ve enjeksiyon için yumurta sarısı içine iğne ucu inmeye böylece enjeksiyon plakası yerleştirin. Bireysel embriyoları yerleştirmek için, bir iğne ucu iter veya embriyoların uygun konuma çeker enjeksiyon plakası gibi işleyebilirsiniz. Iğne ucu veya hasar embriyolar kırmak için değil, dikkatli olun! Bu biraz pratik alır, ama bir kural olarak, oldukça hızlı ve temiz, enjeksiyondan sonra sonra embriyonun içine bir iğne taşımak ve sadece mikromanipülatör kullanımı. Embriyolar (sol el sağ eli ile enjekte) plaka hareket serbest el kullanarak enjeksiyon konuma getirilir. Yeni bir öğrenci için, enjekte çözüm görselleştirmek için% 0.25 fenol kırmızısı içeren bir solüsyon kullanarak uygulama yararlıdır. Onaylamak için, bu çözüm arası koryon alanından daha ziyade, embriyo enjekte edildi. Güven, aynı zamanda bir çözüm içeren floresan etiketli mikroküreler (F-8794 Molecular Probes) enjekte edilerek elde edilir Ancak, uygulamada bir kaç tur sonra bu yardımları artık gereklidir. Sadece iğne tıkanmış ve enjekte edilen hacim uygun göründüğünü olmadığını teyit etmek için zaman zaman havaya enjekte etmek iyi bir fikirdir. </li><li> Enjekte embriyolar sistem su ile 100mm Petri kabı geri aktarılır ve 28.5C kültüre. En düşük çalışma konsantrasyonu enjeksiyondan sonra, kalan tüm çözüm sınırdışı ve morfolino sonraki en yüksek çalışma konsantrasyonu iğne doldurmak için kullanılan olabilir. Morfolino her konsantrasyon için tekrarlayın. Iğne su kullanarak yıkayın mümkün olsa da, ayrı bir morfolino test ederken, biz iğne değiştirmek ve yeniden kalibre etmek için tercih. Uninjected embriyolar özel parti embriyoların sağlıklı ve normal olup olmadığını doğrulamak için bir kohort tutmak için emin olun. </li></ol> Adım 3. Bireysel eşik dozlarda morpholinos ko-enjeksiyon Yukarıda yapılan titrasyon amaç için bir eşik dozu her morfolino tanımlamak için oldu. Hedeflenen gen önemli bir işlevi varsa, en iyi senaryo morphants aslında% 100, tanımlanmış bir fenotip gösterecektir. Ancak, yanlış enjeksiyon eserler bazı değişkenliği nedeniyle bekleyebilirsiniz. Uygulama ile, bu% 10 geçmemelidir. Bazı partiler embriyolar (uninjected kontroller dahil) deney indirimli gerekebilir, bu durumda hayatta değil. Bu arada bireysel embriyolar daha az ya da demonte toleranslı olabilir, biyolojik değişkenlik de vardır. Son olarak, bazı morpholinos sağlam bir demonte (penetrant) elde etmek için yeterince verimli olmayabilir. Bir fenotip embriyo düşük bir yüzde, ama tekrarlanabilir ise, bu ayrı bir morfolino test değer olabilir. Bu sonraki deneyde amaç, hem de genler aynı anda hedeflenen tamamen yeni bir fenotip görülmektedir olup olmadığını belirlemek için. Biz sadece bireysel genler birini test ederken eşik seviyesinde veya üstünde değil ayrı bir fenotip nesil için oldukça morphant fenotip embriyoların yüzde bir artış için, ama değildir. <ol><li> , Tanımlanmış bir fenotip oluşturan her bireyin morfolino eşik konsantrasyon, daha önce test morpholinos arada bir karışım hazırlayın. Örneğin, her gen için eşik 5 ng ise, her 5 ng + 5 ng (10 ng toplam) içerecek bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Embriyolar 20 ng toplam morfolino çok daha fazla tahammül edemez bu yana, her gen verimli her hedef için yeterli az miktarda kullanmak için, önceki deneylere göre, önemlidir. </li><li> Kontroller kombinasyonu için kullanılan aynı konsantrasyonda, her bireyin morfolino tek başına enjekte edilen embriyoların setleri içermelidir. Enjeksiyonluk çözelti hacimleri (örneğin 1.8 nl) sabit tutulmalıdır. Bildirici zorlanma kullanarak büyük bir avantajı, herhangi bir zamanda tekrar tekrar fenotip (örneğin kardiyomiyosit farklılaşma) değerlendirmek ve bu. Embriyoların in situ hibridizasyon, gen ekspresyonu için değerlendirilmek üzere iseniz, sahne uyumlu embriyoların ve kontrolleri, çeşitli zamanlarda enjeksiyon sonrası sabit olabilir. Deneme için, yaklaşık 24 hpf, GFP ifade kardiyomiyosit farklılaşması için bir vekil olarak değerlendirmek için devam etmektedir. </li></ol> Adım 4. Efenotiplerin değerleme <ol><li> Enjeksiyondan hemen sonra, enjekte embriyolar izlenir olmalı ve bu kalan morphants canlılığı tehlikeye düşürebilecek gün boyunca birkaç kez, herhangi bir ölü ya da ölmek üzere olan embriyolar kaldırmak için. Muhabir gen ekspresyonu değerlendirmek için, embriyolar floresan kapasite ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak incelenir. 0,75 x 11.25x için bir büyütme 1X veya 1.6x objektif ve bir dizi ile, Nikon SMZ1500 mikroskop kullanıyoruz. Floresan filtre kullanılarak, ışık şiddeti en üst düzeye çıkarmak için tamamen açık ayarı diyafram açmak için emin olun. Ayrıca muhabir gen (GFP, TTT, vs.) Bağlı olarak, doğru bir filtre kullandığınızdan emin olun. </li><li> Embriyolar genellikle 1 / 20 dilüsyon tricaine methanesulfonate 4mg/ml stok sistemi su kullanarak sedasyon. Hisse senetleri-20C dondurularak saklanır. Alternatif olarak, embriyolar 20x tricaine stok kullanılarak ötenazi olabilir. Koryon hala bile Embriyolar genellikle gösterildi olabilir. Ancak, özellikle eğer fotoğrafı olacak, keskin forseps kullanarak chorions kaldırmak için iyi bir fikir. Embriyolar tricaine çözüm depresyon slaytlar yerleştirerek, ya da daha küçük bir damla% 3 metilselüloz yerleştirilir fotoğrafçılığı için onları hareketsiz sonra görülebilir. </li><li> Tek morphants göre morpholinos kombinasyonu enjekte edilen embriyo fenotipleri uyun. Burada ilkel kalp tüpü GFP ifade desen arıyoruz. Bu muhabir gerginlik GFP kardiyomiyositlerde kalp şartname ve kalp tüpü morfolojilerinden ayrıntılı analiz sağlar cmlc2 organizatörü, üzerinden ifade edilir. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar Deneyde önemli biyolojik değişkenlik 3,4 olmasına rağmen, eşik seviyeleri ile enjekte edildiğinde, gata5 ve gata6 tek morphants tekrarlanabilir kalp fenotipleri göstermektedir. Örneğin, gata5 morphants çoğu iki bölgede bulunan GFP ifade ile, bifid kalp üretmek. Kalp atalarıdır kalp tüpü oluşumu sırasında orta hatta sigorta düzgün göç başarısız çünkü bu durum oluşur. Ancak, bazı gata5 morphants arızalı bir kalp tüpü oluşturmak ve az sayıda (% 5) GFP + hücrelerinin miktarında önemli bir azalma vardır. Bu biyolojik değişkenliği yansıtan inanıyorum, ama aynı zamanda morpholinos &quot;boş&quot; bir mutasyon eşdeğer olmadığı gerçeğine bağlı olabilir. Aynı şekilde, gata6 morphants kardiyak fenotipi gösterir ancak, az sayıda bifid, ısıtır da dahil olmak üzere fenotipleri bir dizi var ve morfolojik olan kalpleri uninjected kontrol embriyoların karşılaştırıldığında rahatsız . Kalp oluşumunun dinamik bir süreç olduğu ve en azından bazı kalp fenotip dolaylı embriyonik morfogenetik kusurlarından kaynaklanıyor olabilir bu yana bu değişkenliği, bir kalp morfogenetik fenotip için alışılmadık bir durum değildir. Ancak daha da önemlisi, hem gata5 ve gata6 morphants kalp morfogenetik kusurları dizi tutarlı ve tekrarlanabilir, ve büyük bir bölümü embriyoların önemli GFP + kardiyomiyositlerde oluşturmak. Gata5 ve gata6 tek morphants tezat olarak, her iki faktörün tükenmiş embriyolar kardiyomiyositlerde kaybı ile tutarlı GFP ifade tam bir kaybı, göstermektedir. Böylece, her gata5 ve gata6 kalp morfolojilerinden olmayan gereksiz fonksiyonları var, ancak iki genin işlevsel olarak farklılaşmış kardiyomiyositlerde nesil için bir gereklilik gereksizdir. Daha önceki çalışmalar için bir gereklilik kardiyomiyosit şartname 3 düşündüren, aynı zamanda nkx2.5 dahil olmak üzere ilk kardiyomiyosit belirteçleri, bir kaybı gösterdi.

<ol>
	<li>Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+zebrafish+model+to+study+GATA+transcription+factors.">Using the zebrafish model to study GATA transcription factors.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).</li><li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish.">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li><li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata5+and+Gata6+are+functionally+redundant+in+zebrafish+for+specification+of+cardiomyocytes.">Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes.</a> Dev Biol. 312, 613-622 (2007).</li><li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium.">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Dev Biol. 311, 623-635 (2007).</li><li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata4+regulates+the+formation+of+multiple+organs.">Gata4 regulates the formation of multiple organs.</a> Development. 132, 4005-4014 (2005).</li><li>Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA+factors+in+Drosophila+heart+and+blood+cell+development.">GATA factors in Drosophila heart and blood cell development.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).</li></ol>

Burada anlatılan deney, tek başına ayrı bir fenotip yelpazesi olan her iki morpholinos, kombine ve birlikte ortak enjekte edildi tamamen farklı bir fenotip bulundu. Tabii ki, ilk etapta bu denemeyi yapmak için bir gerekçe gerekiyordu. Biz iki genin, bu durumda kalp şartnamede, bir önceki fonksiyonu için birbirlerini telafi olabilir şüpheli. Bu genler çok ilgili (ve aynı DNA dizilerinin bağlama yeteneğine) ve embriyogenez 5 sırasında desen örtüşen ifade edilir çünkü. Ayrıca, Drosop...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fish breeder tanks and dividers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aquatic Habitats</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fish nets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aquatic Habitats</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>System water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>60mg &#x201C;Instant Ocean&#x201D; per liter dH2O</td>
</tr>
<tr>
<td>100mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>351029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micropipette needle puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter instruments, Co.</td>
<td>P-97 Flaming/Brown</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3.5" glass capillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>3-000-203-G/X</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Personna</td>
<td>94-120-71</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro grinder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige, Japan</td>
<td>EG-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gridded microscope eyepiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Premiere</td>
<td>MF-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micrometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ward&#x2019;s Natural Science</td>
<td>94 W 9910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultrapure agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spatula</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>14-357Q</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Scale</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mettler Toledo</td>
<td>AB54-S/FACT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Disposable weigh dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>2-202-B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Conventional microwave</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>General Electric</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Erlenmeyer flask</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>4980</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microscope slides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-552</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Graduated cylinder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-572-6D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Automatic pipette man</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BrandTech</td>
<td>2026333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>70% ethanol wash solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tarr</td>
<td>801VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>N2 tank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tech Air</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harvard apparatus</td>
<td>PLI-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Micro Instruments</td>
<td> LTD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ1500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>American National Can</td>
<td>PM-992</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mineral oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>M5904</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kimwipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimberly-Clark</td>
<td>34155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>gata5 splice site morpholino</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetools, LLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5'-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3'</td>
</tr>
<tr>
<td>gata5 ATG Blocker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetools, LLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5'-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3'</td>
</tr>
<tr>
<td>gata6 Long Isoform ATG Blocker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Genetools, LLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5'-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3'</td>
</tr>
<tr>
<td>Disposable Pasteur Pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-678-20B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tricaine Methanesulfonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Argent Chemical Laboratories</td>
<td>MS-222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methycellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ICN Biomedicals</td>
<td>155495</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heat Block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>11-718-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sharp forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dumont</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Size 55</td>
</tr>
<tr>
<td>Depression Microslides</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48339-009</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a reverse genetic approach to test functional redundancy during embryogenesis

Embriyogenez sırasında Gen fonksiyonu genellikle fare hedef mutagenez (nakavt), örneğin, fonksiyon kaybı-deneyleri ile tanımlanır. Zebra balığı modeli gen-spesifik antisens morpholinos mikroenjeksiyon kullanarak, etkili ters genetik teknikler geliştirilmiştir. Morpholinos embriyogenez (demonte) inhibe çeviri sırasında birkaç gün ya da ekleme, geçici olarak belirli bir baz eşleşme ve blok gen fonksiyonu ile bir mRNA&#39;nın hedef. Ancak, fare ya da Zebra balığı gibi omurgalıların, bazı genlerin fonksiyonlarının kaybı telafi başka bir genin varlığı nedeniyle bu yaklaşımlar tarafından gizlenmiş olabilir. Bu, aynı gelişmekte olan dokularda ifade edilir kızkardeşi genleri içeren gen aileler için özellikle doğrudur. Zebra balığı, fonksiyonel tazminat morpholinos co-enjeksiyon, nispeten yüksek verimli bir şekilde test edilebilir, bu genlerin aynı anda hedef demonte. Aynı şekilde, morpholinos kullanarak, herhangi iki gen arasındaki genetik bir etkileşim alt-eşik seviyelerinde birlikte, hem genler demonte tarafından ortaya olabilir. Örneğin, morpholinos ne bireysel demonte bir fenotip oluşturduğu gibi titre edilebilir. Bu koşullar altında, hem de morpholinos ko-enjeksiyon bir fenotipe neden varsa, genetik bir etkileşim göstermiştir. Burada birbiriyle ilişkili iki GATA transkripsiyon faktörleri bağlamında nasıl göstermek için fonksiyonel fazlalık göstermektedir. GATA faktörler kalp atalarıdır tanımlanması için gerekli olan, ancak bu sadece Gata5 ve Gata6 kaybı ortaya çıkar. Biz, mikroenjeksiyon deneyleri yürütmek, morpholinos doğrulamak ve cardiogenesis için telafi fenotip değerlendirmek nasıl göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis at JoVE.com

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gen fonksiyonu, başka bir gen tarafından tazminat varsa, fonksiyon kaybı-deneylerde gizlenmiş olabilir. Zebrafish modeli canlı embriyolarının gibi fonksiyonel fazlalık ortaya çıkarmak için nispeten yüksek bir verimlilik anlamına gelir sağlar.

Embriyo sırasında Fonksiyonel Artıklık Test Ters Genetik Yaklaşım

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

a-reverse-genetic-approach-to-test-functional-redundancy-during

Research

JoVE Journal

Biology

11.9K Görüntüleme.  Weill Cornell Medical College of Cornell University. Gen fonksiyonu, başka bir gen tarafından tazminat varsa, fonksiyon kaybı-deneylerde gizlenmiş olabilir. Zebrafish modeli canlı embriyolarının gibi fonksiyonel fazlalık ortaya çıkarmak için nispeten yüksek bir verimlilik anlamına gelir sağlar.

Video: A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

Fareler için açık / koyu Geçiş Testi

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Biyoloji

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Civciv Embriyo Sinir İndüksiyon için Testi

Elevated Plus Maze for Mice

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given gene on a specific behavior can be determined by behavioral analysis of mutant mice. If a target gene is expressed in the brain, behavioral phenotype of the mutant mice could elucidate the genetic mechanism of normal behaviors. The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior. The test is based on the natural aversion of mice for open and elevated areas, as well as on their natural spontaneous exploratory behavior in novel environments. The apparatus consists of open arms and closed arms, crossed in the middle perpendicularly to each other, and a center area. Mice are given access to all of the arms and are allowed to move freely between them. The number of entries into the open arms and the time spent in the open arms are used as indices of open space-induced anxiety in mice. Unfortunately, the procedural differences that exist between laboratories make it difficult to duplicate and compare results among laboratories. Here, we present a detailed movie demonstrating our protocol for the elevated plus maze test. In our laboratory, we have assessed more than 90 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. These data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.
Visualization of the protocol will promote better understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used in different laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test. 


The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie showing the detailed procedures for conducting the test.

Fareler için Yükseltilmiş Artı Labirent

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Yetişkin Mouse Hipokampal dentat girus diseksiyonu

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama Pratik Bir Yaklaşım: Hücreler Mark ve Track Görsel Bir Rehberi In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Genetik Dernekleri Fonksiyonel Dayanak Test bir Allel özel Gen İfadesi Testi

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Farmakolojik ve Fonksiyonel Genetik Tahliller Planarian Rejenerasyon işleyin<emJaponica> Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.